SIXTO RAUL COSTAMAGNA* y MARIA PRADO FIGUEROA*
The goal of the present study was to determine the validity of the following five methods used for the diagnosis of Trichomonas vaginalis in vaginal secretions at the clinical laboratory: Gram staining; Conventional wet mount examination; May Grunwald-Giemsa staining; Culture in a modified Diamond (Menarini®) medium; Culture in an OXOID® CM 161 medium. We used 89 vaginal-secretion samples extracted with sterile cotton swabs of female subjects between the ages of 25 and 55 at the laboratory of the Hospital de Evacuación 181 of the city of Bahía Blanca, Province of Buenos Aires, Argentina. The samples were stained with Gram and May Grunwald-Giemsa; observed by conventional wet mount examination; and cultured in Diamond (Menarini®) and OXOID® CM 161 media and incubated for 5 days at 37ºC in an anaerobic condition. Results showed that, for a prevalence of disease (Trichomonosis) of 29.21%, the Diamond (Menarini®) culture medium and the immediate conventional wet mount examination at our diagnostic lab have similar sensitivities, predictive negative values, and global values: 80.7%, 92.64%, and 94.38%, respectively. When the four tests were conducted in parallel, the resulting sensitivity was 99.76% with a predictive negative value of 99.90%. As for the OXOID® CM 161 medium, even though the global value of the test was similar, its sensitivity was 76.92%, slightly lower than the results from the conventional wet mount examination, but without a significant statistical difference. The Gram staining showed a diagnostic sensitivity of 19.23%. We conclude that the Diamond (Menarini®) and the OXOID® CM 161 culture media do not improve the etiological diagnosis of Trichomonas as compared to the conventional wet mount examination and May Grunwald-Giemsa staining tests. While we do not recommend using Gram staining for the study of T. vaginalis, we consider that, if the flagellate were to be identified by this method, its finding could be reported without further testing.
Key words: Trichomonas vaginalis; Trichomonosis; Culture of Trichomonas; Diagnostic. ]]>
* Cátedra de Parasitología Clínica. Departamento de Biología, Bioquímica y Farmacia. Universidad Nacional del Sur. San Juan 670. 8000- Bahia Blanca. Argentina. E-mail: rcostama@criba.edu.ar
INTRODUCCION
La trichomonosis, parasitosis del tracto genitourinario producida por el protozoo Tricho-monas vaginalis1 es una de las enfermedades de transmisión sexual (ETS) más difundidas en todo el mundo. No obstante aún no existe un método para el diagnóstico de laboratorio útil para todas las circunstancias, de bajo costo, rápido, sencillo y con valores de predictibilidad, tanto negativos como positivos, aceptables.
Los medios de cultivos para T. vaginalis, por lo menos en nuestro medio, no han tenido el éxito que autores europeos y norteamericanos han obtenido. Los mayores inconvenientes que restringen su uso son el costo de los mismos y el hecho de que todos necesitan el agregado de suero de caballo, antibióticos y antimicóticos, en el momento de su uso, deben ser incubados en anaerobiosis, o bien no se encuentran disponibles en el mercado.2-8
Para evaluar la utilidad de los mismos en nuestra ciudad, es que procedimos, en este ensayo, a validar las siguientes metodologías comúnmente utilizadas para el diagnóstico de T. vaginalis en flujo vaginal, por el laboratorio de Análisis Clínicos: 1) Coloración de Gram, 2) Examen en fresco entre porta y cubreobjetos 3) Coloración de May Grunwald-Giemsa. 4) Cultivo en medio de Diamond modificado (Menarini®) y 5) Cultivo en medio OXOID® CM-161.
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MATERIAL Y METODOS
Se procesaron 89 muestras de flujo vaginal de mujeres que concurrieron al Servicio de Laboratorio del Hospital de Evacuación 181 de la ciudad de Bahía Blanca (Argentina), cuyas edades oscilaban entre los 25 y 55 años, y sintomatología compatible con vaginitis.
Las muestras fueron extraídas para ser procesadas simultáneamente por los cinco métodos señalados, para lo cual se extrajo flujo vaginal de fondo de saco, evaluando que fuese suficiente y significativo, con hisopos estériles.
Primeramente se efectuaron extendidos para coloraciones de Gram y de May Grunwald-Giemsa (dos extendidos para cada uno). Posteriormente se extrajo nueva muestra para efectuar el examen en fresco entre porta y cubreobjetos (de 24 x 24 mm) y el hisopo fue colocado en un tubo que contenía 0,5 cc de solución fisiológica de cloruro de sodio, el cual se mantuvo en un baño termostatizado a 37ºC hasta el momento de su observación: menos de cinco minutos para todos los casos. Se observó con 400 aumentos por espacio de cinco minutos cada preparado, y se informó la presencia o ausencia del protozoo.9
Finalmente se procedió a la extracción de muestras para los cultivos: un hisopo con flujo vaginal fue colocado en cada uno de los tubos que contenían 10 ml del medio de cultivo correspondiente.
Los medios de cultivos utilizados fueron:
a. Medio de cultivo Diamond2 (Menarini®). Cod Tric-20. Ref 1038. Barcelona-España
b. Medio OXOID® CM 161, Hampshire, England. Este medio fue suplementado con suero de caballo y antibiótico-antimicótico, de acuerdo a instructivos del fabricante.
Ambos medios fueron incubados durante cinco días 37ºC, en anaerobiosis. ]]>
Para el análisis estadístico de los resultados, en estas experiencias utilizamos el siguiente software: Epidat, versión 2.0. OPS-OMS, 1997, para análisis de datos tabulados para pruebas diagnósticas simples y para combinación de pruebas.Definimos, para esta experiencia: los siguientes terminos:
- Sensibilidad: la proporción de individuos con la enfermedad que tienen una prueba positiva.
- Especificidad: la proporción de sanos que tienen una prueba negativa.
- Valor Predictivo del Resultado Positivo: la probabilidad de que un individuo con resultado positivo en la prueba, tenga la enfermedad.
- Valor Predictivo del Resultado Negativo: la probabilidad de que un individuo con resultado negativo en la prueba, no tenga la enfermedad.
- Valor Global de la Prueba: la probabilidad de que un individuo sea clasificado correctamente por la prueba.
RESULTADOS ]]>
Los resultados, para un nivel de confianza del 95%, fueron los que se muestran en la Tabla 1.
Si las cinco pruebas se efectuaran «en serie», es decir que a los sujetos con resultado negativo en una prueba ya se los considera «negativo» y por lo tanto no se lo somete a una segunda prueba, mientras que a los positivos sí se les realiza otra prueba (o la misma), para «confirmar el caso», los resultados serían los mostrados en la Tabla 2.
Si las cinco pruebas se efectuaran «en paralelo», es decir que a los sujetos con resultado positivo en una prueba ya se consideran como «positivos» y por lo tanto no se someten a una segunda prueba, mientras que a los «negativos» se les efectúa otra prueba diagnóstica, hasta llegar a la quinta en este caso, buscando de esta manera aumentar la sensibilidad del diagnóstico del laboratorio, los resultados serían los mostrados en la Tabla 3.
La prevalencia de la enfermedad en el grupo estudiado, fue del 29,21%, artificialmente aumentada ya que las pacientes fueron seleccionadas en función de la sintomatología que manifestaban presentar al momento de la realización del examen de flujo, en el laboratorio.
DISCUSION
Del análisis de los resultados obtenidos en esta experiencia, podemos concluir que el medio de cultivo Diamond (Menarini®), para una prevalencia de enfermedad (Trichomonosis) del 29,21%, en nuestro laboratorio de diagnóstico, presenta una sensibilidad, valor predictivo del resultado negativo y valor global de la prueba, similar al examen en fresco; por esta razón es que hasta tanto se disponga de mejores medios de cultivo comerciales, no recomendamos la utilización de los mismos en la práctica diaria en nuestros laboratorios de diagnóstico microbiológico, en contraposición con lo expresado por otros investigadores quienes aseguraban que si no cultivan los flujos vaginales, perdían la mitad de los diagnósticos positivos de T. vaginalis.3 ]]>
Con respecto al medio de Oxoid®, si bien el valor global de la prueba es similar, presenta una sensibilidad del 76,92%, ligeramente inferior al examen en fresco, aunque con diferencia estadística no significativa.Con referencia a la coloración de Gram, no consideramos una coloración recomendable para investigar T. vaginalis como única prueba. Simplemente fue incluida en esta validación ya que es una coloración que rutinariamente efectúan los bacteriólogos en el estudio del flujo vaginal, y que en caso de visualizarse el flagelado en la misma, puede informarse su hallazgo y no se necesitarían efectuar otros exámenes.
Si bien nuestros hallazgos son coincidentes con los de otro artículo,10 es pertinente señalar que en 351 muestras estudiadas en otro estudio, se detectó T. vaginalis por examen en fresco en el 6% de los casos mientras que si se utilizaba cultivos acelulares anaeróbicos la detección llegaba al 13%.11
Un autor12 otorga una «eficiencia relativa» del 100% al cultivo del flujo vaginal en medio de Diamond incubado durante siete días a 37ºC, sin embargo, el mismo autor manifiesta una sensibilidad del 76,9% al medio de Kupferberg13 igual a la hallada por nosotros en esta experiencia, pese a que las muestras son diferentes. El mismo autor,6 si bien reconoce el valor del medio de Diamond, señala que es solamente en condiciones de anaerobiosis y con una incubación de siete días, lo que dificulta aún más su utilización en los laboratorios comunes, ya que no todos disponen de jarras para anaerobiosis, llegándose, luego de un análisis de costo/beneficio, a ser descartado su uso en forma rutinaria por la mayoría de los Laboratorios de Análisis Clínicos.
Por lo expuesto creemos que el medio de Diamond (Menarini®) podría ser recomendable para estudios de cepas axenizadas, para mantenimiento de las mismas en laboratorio para investigación, pero no está disponible en nuestro medio, y su preparación en el laboratorio insume demasiado tiempo.
Es pertinente recordar aquí, que en otros estudios14 los autores demostraron que la coloración fluorescente con naranja de acridina15 tenía una sensibilidad muy superior al examen en fresco, por lo que, teniendo en cuenta que los medios de cultivo aquí ensayados no mejoran significativamente la sensibilidad respecto del examen en fresco, los resultados aquí presentados confirman que el algoritmo para el diagnóstico de T. vaginalis por el laboratorio de Análisis Clínicos es el que incluye: examen en fresco, coloración de May Grunwald-Giemsa y coloración fluorescente con naranja de acridina, efectuados "en paralelo".14
RESUMEN
En el presente estudio se efectuó la validación de las siguientes metodologías utilizadas para el diagnóstico de Trichomonas vaginalis en flujo vaginal, en el laboratorio de Análisis Clínicos: 1) Coloración de Gram, 2) Examen en fresco entre porta y cubreobjetos 3) Coloración de May Grunwald-Giemsa. 4) Cultivo en medio de Diamond modificado (Menarini®) y 5) Cultivo en medio OXOID® CM-161. ]]>
Se utilizaron 89 muestras de flujo vaginal extraído con hisopo estéril de fondo de saco, de mujeres que concurrieron al Servicio de Laboratorio del Hospital de Evacuación 181, de la ciudad de Bahía Blanca (Provincia de Buenos Aires) Argentina y cuyas edades oscilaban entre 25 y 55 años.Las muestras se colorearon con Gram, May Grunwald-Giemsa, se efectuaron observaciones en fresco entre porta y cubreobjetos, y fueron sembradas en los medios de Diamond (Menarini®) y OXOID® CM-161 e incubadas durante cinco días a 37ºC, en anaerobiosis.
Los resultados obtenidos mostraron que el medio de cultivo Diamond (Menarini®) y el examen en fresco inmediato, para una prevalencia de enfermedad (Trichomonosis) del 29,21%, en nuestro laboratorio de diagnóstico, presentan una sensibilidad, valor predictivo del resultado negativo y valor global de la prueba
similares: 80,7%; 92,64% y 94,38% respectivamente. Si las cuatro pruebas son efectuadas en paralelo, la sensibilidad que se obtiene es del 99,76%, con un valor predictivo del resultado negativo del 99,90%.
Para el medio OXOID®, si bien el valor global de la prueba es similar, presenta una sensibilidad del 76,92%, ligeramente inferior al examen en fresco, aunque con diferencia estadística no significativa.
La coloración de Gram presentó una sensibilidad diagnóstica de 19,23%.
Concluimos que los medios de cultivo Diamond (Menarini®) y OXOID® CM 161 no mejoran el diagnóstico etiológico de trichomonosis con relación al examen en fresco y coloración de May Grunwald-Giemsa. La coloración de Gram no la recomendamos para investigar T. vaginalis, no obstante, de visualizarse el flagelado por la misma, puede informarse su hallazgo y no se necesitarían efectuar otros exámenes.
REFERENCIAS ]]>
1.- DONNE A. Animalcules observés dans les matieres purulentes et le produit des sécretions des organes genitaux de l'homme et de la femme. Comptes rendus hebdomadaires des séances de l'Academie des Sciences Paris 1836; 3: 385. [ Links ]
2.- DIAMOND L. The astablishment of various trichomonads of animals and man in axenic cultures. J Parasitol 1957; 43: 488-90. [ Links ]
3.- GALIA C, SMAYEVSKY J, BIANCHINI H. Importancia del cultivo de Trichomonas vaginalis en los distintos estadíos clínicos de la vaginitis a Trichomonas. Acta Bioquímica Clínica Latinoamericana 1984; 18: 461-7. [ Links ]
4.- MASON PR, HEATHER S, FRIPP P J. Comparison of four techniques for the routine diagnosis of Trichomonas vaginalis infection. J Clin Path 1976; 29: 154-7. [ Links ]
5.- PAGET TA, LLOYD D. Trichomonas vaginalis requieres traces of oxygen and high concentrations of carbon dioxide for optimal growth. Mol Biochem Parasitol 1990; 41: 65-72. [ Links ]
6.- GELBART S, THOMASON J, OSYPOWSKI P et al. Growth of Trichomonas vaginalis in comercial culture media. J Clin Microbiol 1990; 28: 962-4. [ Links ]
7.- CASTRO GARZA J, ANAYA VELAZQUEZ F, SAID FERNANDEZ S, GONZALEZ GARZA M T. Comparable growth of a Trichomonas vaginalis strain in PEHPS and TYI-S-33-media. Arch Med Res 1996; 27: 567-9. [ Links ]
8.- COSTAMAGNA S R, NIIZAWA G, BALOGH G. Trichomonas vaginalis en medios de cultivo: consumo proteico. Rev AMBB 199; 9: 22-5. [ Links ]
9.- COSTAMAGNA S R, SORIA O, VAYLET S et al. Algunas consideraciones sobre el examen en fresco en el diagnóstico de Trichomonas vaginalis. Parasitol al Día 1997; 21: 66-8. [ Links ]
10.- THOMASON J, GELBART S, SOBUN J et al. Comparison of four methods to detect Trichomonas vaginalis. J Clin Microbiol 1988; 26: 1869-70. [ Links ]
11.- VAN DER MEIJDEN W I, SCHMITZ P I, DROGENDIJK A C, STOLZ E. Some aspects of the diagnosis of specific vaginal infections in the Rotterdam STD clinic population. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol 1988; 28: 53-64. [ Links ]
12.- GELBART S M, THOMASON J, OSYPOWSKI P et al. Comparison of Diamond's medium modified and Kupferberg medium for detection of Trichomonas vaginalis. J Clin Microbiol 1989; 27: 1095-6. [ Links ]
13.- KUPERFERBERG A, JHONSON G, SPRINCE H. Nutritional requeriment of Trichomonas vaginalis. Proc Soc Exp Biol Med 1948; 67: 304-8. [ Links ]
14.- COSTAMAGNA S R, VAYLET S, PRADO FIGUEROA M, MEZQUITA L. Trichomonosis: validación de tres pruebas para el diagnóstico por el laboratorio de análisis. Parasitol al Día 1967; 21: 61-5. [ Links ]
15.- FRIPP P J, MASON PR, SUPER H. A method for the diagnosis of Trichomonas vaginalis using acridine orange. J Parasitol 61:966-967, 1975. [ Links ] ]]>