FERNANDO FREDES*, CATHERINE SANCHEZ*, TEXIA GORMAN* y HECTOR ALCAINO*

PURIFICATION OF Fasciola hepatica ANTIGENS
BY ELECTROELUTION AND ITS DIAGNOSTIC APPLICATION THROUGH
WESTERN BLOT IN ANIMAL INFECTION

Two polypeptides (14 kDa and 29 kDa) of adult Fasciola hepatica were purified by electroelution and its diagnostic application through Western blot was evaluated. The value of sensitivity was 95% and 97.5%, respectively and the value of specificity was 100% in both polypeptides. These antigenic components were efficient for the diagnosis of the prepatent stage of the infection.

Keys words: Fasciola hepatica; liver fluke antigens; electroelution; Western Blot; Immunodiagnosis.

* Departamento de Medicina Preventiva Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Casilla 2, Correo 15, Santiago, Chile. E-mail: ffredes@uchile.cl
Proyecto FIV 3632 ]]> INTRODUCCION

En Chile la fasciolosis, causada por Fasciola hepatica, es la enfermedad parasitaria zoonótica de mayor prevalencia en los animales destinados a consumo humano.¹

La metodología de rutina para su diagnóstico es el examen coproparasitológico. Sin embargo, a pesar de tener un bajo costo, tiene baja sensibilidad (72,5% en ovinos, 76,6% en porcinos y 83,3% en equinos) y no sirve en la etapa prepatente de la infección.^{2, 3} Como alternativas, se ha usado la medición de enzimas séricas hepáticas, pero un aumento en su actividad no es específico, ya que se produce con cualquier daño hepático agudo.

Con el fin de mejorar su diagnóstico, se han ensayado diversas pruebas inmunológicas.^4-6 En los primeros estudios se usaron fracciones antigénicas crudas, sin purificación.^{2, 3, 7, 8} Sin embargo, como el parásito tiene una composición antigénica compleja, presenta a los hospedero varios componentes, de los cuales sólo algunos son reconocidos,⁴ por lo que sería de importancia proceder a su purificación.⁹

El propósito de este trabajo será la purificación de antígenos de F. hepatica mediante electroelución y su posterior aplicación en el inmunodiagnóstica de la infección animal mediante Western blot.

MATERIAL Y METODOS

Antígeno de Excreción-Secreción (E-S): Fue obtenido a partir de fasciolas adultas vivas recolectadas obtenidas de los hígados de ovinos. Ellas fueron lavadas en suero fisiológico estéril e incubadas durante 16-18 h a 37°C, en solución Hedon-Fleig estéril.¹⁰ El sobrenadante obtenido fue dializado en agitación contra agua desionizada, durante 24 horas a 4°C, luego fue sometido a ultracentrifugación (15.000 x g por 20 min) y liofilización hasta un volumen de 1 ml. El liofilizado fue almacenado en alíquotas a -70°C, previa determinación de la concentración proteica.¹¹

SDS-PAGE: La técnica se realizó en mini geles de 8x7x1,5 mm, a una concentración de poliacrilamida al 12%, en una cámara vertical Mini-Protean II (BIO-RAD), en condición denaturante, con peineta continua de tres carriles y a una diferencia de potencial de 100 V.¹² En el carril central se incluyó un estándar de peso molecular comercial, con un rango de 14,2 a 66 kDa, mientras que en los dos carriles laterales se colocaron 150 µg/ml del preparado antigénico. Una vez finalizadas las electroforesis cada gel fue cortado longitudinalmente, separándolo en 3 trozos. El trozo central que correspondía al carril central y algo de los carriles laterales fue teñido con azul de Coomassie, para determinar la posición exacta de aquellas bandas que correspondan a los pesos de 14 y 29 kDa. Los otros dos trozos sin teñir fueron cortados al mismo nivel de las bandas en cuadraditos de 1x1 cm. y fueron sometidos a electroelución. ]]> Electroelución: La técnica se realizó en un módulo de electroelución 422 (BIO-RAD) a 8-10 mA/tubo por 4 horas. A cada eluido recolectado se le determinó su concentración proteica.¹¹ Luego se realizaron nuevos SDS-PAGE con los electroeluidos para corroborar la eficiencia de la purificación. Los eluidos fueron agrupados de acuerdo al polipéptido que revelaban (14 ó 29 kDa) y se almacenaron a -70°C.

Western Blot (WB): Se realizó SDS-PAGE con cada uno de los polipéptidos electroeluidos, utilizando una peineta de dos carriles; un carril pequeño lateral donde se incluyó el estándar de peso molecular y un carril mayor donde se depositó el preparado antigénico, en un volumen que contuviera 180 µg de antígeno de 14 kDa y 150 µg del antígeno de 29 kDa, por gel. Los geles fueron electrotransferidos a membranas de nitrocelulosa a 100 V por 90 minutos a 4° C,¹³ las cuales fueron incubadas, toda la noche, con los sueros de animales detectores diluidos 1:100 en PBS-Tween 20 y posteriormente incubadas, por dos horas, con el conjugado anti-Ig G anti ovino (SIGMA) y PBS-Tween 20, según titulaciones previas. Finalmente fueron reveladas con el sustrato (diaminobenzidina, PBS y H₂O₂) y una vez aparecidas las bandas, las membranas se lavaron con agua destilada.

Sueros de ovino con infección con F. hepatica: Para la evaluación de los electroeluidos mediante WB se utilizaron: 10 en fase prepatente; 30 en fase patente; 10 sin fasciolosis pero infectados con otras parasitosis (uno con Thysanosoma actinoides, 6 con hidatidosis, 1 con Cysticercus tenuicollis, 1 con parasitosis pulmonar y 1 con hidatidosis y cisticercosis); y un "pool" de 10 sueros de ovinos sin F. hepatica.

RESULTADOS

En la evaluación inmunodiagnóstica del polipéptido purificado de alrededor de 14 kDa, no existió reacción al ser enfrentado al "pool" de sueros de animales sin F. hepatica (reacción negativa). De los 10 sueros de animales en fase prepatente, 2 de ellos no dieron reacción (reacción negativa) y 8 de ellos dieron una banda de reconocimiento alrededor de los 14 kDa (reacción positiva). En tanto, el 100% de los sueros de animales en fase patente dieron reacción positiva. Los 10 sueros de animales con otras parasitosis no dieron reacción. Se obtuvo valores de sensibilidad de 95% y de especificidad de 100%.

En la Figura 1, se puede observar el reconocimiento del polipéptido de alrededor de 14 kDa por parte de los sueros de ovinos en las etapas prepatente y patente de la infección, así como la ausencia de reconocimiento por parte de los sueros de animales sin infección y con otras parasitosis.

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Para el polipéptido de alrededor de 29 kDa, no existió reacción con el "pool" de sueros de animales sin F. hepatica (reacción negativa). En tanto, el 100% de los sueros de animales con infección prepatente dio reacción positiva y 29 de 30 sueros ovinos en fase patente reconocieron una banda de alrededor de 29 kDa (reacción positiva). De los 10 sueros de animales con otras parasitosis, ninguno ellos dio una banda de reconocimiento. Al evaluar la eficiencia diagnóstica de este polipéptido, se obtuvo valores de sensibilidad de 97,5% y de especificidad de 100%.

En la Figura 2, se puede observar el reconocimiento del polipéptido de alrededor de 29 kDa por parte de los sueros de ovinos en las etapas prepatente y patente de la infección, así como la ausencia de reconocimiento por parte de los sueros de animales sin infección y con otras parasitosis.

DISCUSION

Al realizar SDS-PAGE del antígeno completo de F. hepatica, como en oportunidades anteriores,^14-16 se evidenció la presencia de varios polipéptidos. El presente estudio se centró en la purificación de dos polipéptidos. Uno de alrededor de 14 kDa y el otro de alrededor de 29 kDa, ya que se habían destacado por presentar buena eficiencia diagnóstica y adecuada concentración.¹⁷ El segundo de ellos coincide con el polipéptido predominante de 31-33 kDa ya descrito.¹⁸

La electroelución como metodología de purificación de antígenos de fasciola ha sido usada como método complementario de purificación de fracciones semipurificadas obtenidas por cromatografía.¹⁸ Es una técnica bastante sencilla de implementar, es barata y usa pocos equipos. Además, al cabo de sólo 4 horas es posible recolectar las alíquotas que contienen el polipéptido purificado, en una adecuada concentración para realizar posteriores procedimientos.

Otros estudios han usado fracciones antigénicas semipurificadas de extractos de E-S que contenían ambos polipéptidos (de 14 y 29 kDa), los cuales han llamado la atención por su alta sensibilidad y especificidad,¹⁷ siendo ambos detectados desde etapas muy tempranas de infección. El de 29 kDa es reconocido por sueros de ovinos infectados con F. hepatica desde la 6ª semana de infección, y el de 14 kDa se reconoce desde los 2 meses post-infección.¹⁹

Por otra parte, cabe considerar que ambas bandas han sido descritas, a través de WB, como específicas en ovinos, equinos y cerdos,^18-20 mientras que en bovinos, ha sido descrito, mediante WB, como específico un polipéptido de alrededor de 15 kDa,²⁰ el cual puede coincidir con el polipéptido de 14 kDa, purificado en nuestro estudio.

Al hacer una comparación con los valores de eficiencia diagnóstica de una fracción semipurificada,¹⁷ la sensibilidad de esta última fue inferior (96,7%) a la obtenida en el presente estudio con el polipéptido de alrededor de 29 kDa, y levemente superior a la del polipéptido de 14 kDa. Por ello se puede concluir que la purificación de los polipéptidos efectivamente aumenta la eficiencia diagnóstica de esta prueba.

Finalmente, es posible concluir que los polipéptidos purificados y con mayor razón el de alrededor de 29 kDa, representan una buena alternativa para la implementación de técnicas inmunodiagnósticas para todas las etapas de la infección por F. hepatica..

RESUMEN

]]> La electroelución implementada en este estudio logró purificar por separado dos polipéptidos, uno de 14 y otro de 29 kDa. La eficiencia diagnóstica de cada uno de estos polipéptidos medida a través de Western blot indicó una sensibilidad de 95% y 97,5% respectivamente y ambos una especificidad de 100%. Además se concluye que son de utilidad en la pesquisa de infecciones prepatentes.

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