1) Unidad de Parasitología Norte. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Casilla 9183. Santiago, Chile.
2) Servicio de Dermatología. Hospital Clínico de la Universidad de Chile
* Email: ccontrer@machi.med.uchile.cl
Abstract
An indirect hemagglutination test (IHAT) and an ELISA test for trichinosis using as antigen a larvae soluble fraction from Trichinella spiralis was carried out for the detection of IgG, IgM and IgA specific antibodies in 113 serum samples from patients confirmed or suspected to have trichinosis by strong clinical and epidemiological evidences (Group I). The same tests were also performed on 110 serum samples corresponding to patients without strong evidences of having trichinosis (Group II).
In Group I the corresponding sensitivities for RHAI, ELISA IgG, ELISA IgM, ELISA IgA were: 82.3-85.8-88.5 and 88.5% respectively.
Seventeen patients were tested again a week after the first analysis (10 of them corresponded to negative ones), increasing the positivity: 23.5-100.0;35.3-100.0;41.2-100.0 and 41.2-100.0% for RHAI, ELISA IgG, ELISA IgM and ELISA IgA, respectively. Other two patients were followed-up for 5 years. IHAT and ELISA IgG remained positive, whereas ELISA IgM and ELISA IgA were constantly negative betweeen 17 and 32 months in one case, and between 48 and 60 months in the other (this last one had presented a severe clinic disease).
In the group II, four patients were positive with IHAT, however only one for ELISA IgA, the latter also presented ELISA IgM near the cut off.
The use of ELISA IgG, ELSIA IgM and ELISA IgA in the immunodiagnosis of trichinosis is discussed.
Palabras clave (Key words): diagnóstico (diagnosis); triquinosis (trichinosis); ELISA IgG; ELISA IgM; ELISA IgA.
A pesar que la prevalencia de infección por Trichinella spiralis en cerdos faenados en matade-ros ha experimentado una notable disminución en los últimos años (Ministerio de Salud de Chile. 1990-1999), la triquinosis humana sigue siendo una zoonosis importante en Chile, con frecuentes brotes epidémicos causados principalmente por la ingestión de carne de cerdo cruda o insuficientemente cocida, de preferencia en sectores rurales, donde un número no determinado de cerdos, se cría y se sacrifica en los domicilios sin el adecuado control médico veterinario.
La tasa de prevalencia de la triquinosis humana, determinada mediante estudios serológicos, es de un 1,5% (Contreras y col., 1994). Por otra parte, el hallazgo de larvas de T. spiralis en autopsias de individuos aparentemente sanos, ha fluctuado desde un 2,2 a un 0,8% entre 1966 y 1997 (Schenone y col., 1997).
La base del diagnóstico de la triquinosis humana la constituyen ciertos antecedentes epidemiológicos y clínicos, junto con el apoyo de algunos exámenes de laboratorio, entre los cuales destacan el recuento de eosinófilos y las reacciones inmunobiológicas.
La detección de anticuerpos específicos (Acs) anti T. spiralis ha sido usada ampliamente mediante una serie de pruebas inmunológicas, siendo las más apropiadas aquellas que posean un adecuado valor diagnóstico (Kagan, 1986; Contreras, 1990) y puedan diferenciar entre infecciones recientes y antiguas.
En nuestro laboratorio se han utilizado las reacciones de precipitinas (RP), de floculación con bentonita (RFB), de hemaglutinación indirecta (RHAI) y ELISA IgG. La RP, que es sensible en el período agudo, tiene cierta inespecificidad (Knierim, 1964). Por otra parte, la RFB presenta una especificidad adecuada, detectando Acs a partir de la tercera semana post infección (Kagan y Norman, 1970). La RHAI y la ELISA IgG poseen una adecuada sensibilidad y especificidad (Sandoval y col. 1990, 1995).
El objetivo del presente trabajo fue evaluar, en conjunto, la utilidad de las inmunoglobulinas específicas IgG, IgM e IgA mediante ELISA, en el diagnóstico y en el seguimiento serológico, usando como antígeno una fracción ácido soluble de larvas de T. spiralis delipidizadas, con el propósito de contribuir a mejorar el diagnóstico serológico de triquinosis humana.
Se seleccionó un total de 223 muestras de sueros de pacientes enviados, entre 1992 y 2000, con el propósito de que se les practicasen reacciones inmunodiagnósticas para triquinosis. ]]>
Las muestras recibidas se clasifican en dos grupos, dependiendo de los antecedentes obtenidos de la orden de examen, del contacto posterior con el clínico y de los resultados de las primeras reacciones serológicas efectuadas.Grupo I.- Constituído por 113 casos confirma-dos o con fuertes evidencias de tener triquinosis: por antecedentes clínicos y epidemiológicos (sistomatología, eosinofilia sanguínea elevada y antecedente de consumo de carne de cerdo insufi-cientemente cocida). De este grupo, 68 pacientes eran procedentes de distintos brotes epidémicos y varios de ellos, familiares entre sí. Paralelamente, a 19 pacientes se les pudo seguir serologicamente: a 17 con una segunda muestra tomada en la semana siguiente de la primera, y en 2, se siguió la evolución serológica por más de 5 años.
Grupo II.- Ciento diez sueros analizados se agruparon como posibles negativos, por ser primitivamente negativos en conjunto para la RHAI y ELISA IgG o a una de ellas. Cincuenta y tres de ellos procedían de brotes y/o estudios familiares, en tanto que 57 fueron enviados al laboratorio sin antecedentes, con sólo la solicitud de la realización de serología para triquinosis. A todos los sueros se les practicó la RHAI y ELISA IgG. Posteriormente, una vez estandarizadas las técnicas de ELISA IgM y de ELISA IgA, los sueros fueron analizados simultáneamente mediante las cuatro reacciones mencionadas.
Antígeno utilizado.
En las cuatro técnicas empleadas se usó la fracción ácido soluble del antígeno de Melcher. Brevemente, el procedimiento consiste en una delipidización de larvas liofilizadas de T. spiralis con éter etílico en Soxhlet, durante siete días. El polvo seco se extrae con buffer borato pH: 8,3 a una concentración del 1%, mantenido una noche a 4º C. El sobrenadante obtenido, luego de una centrifugación a 10.000 g por 30 minutos a 4º C, es llevado a pH 4,8 precipitando algunas fracciones proteícas. Después de una centrifugación en las mismas condiciones que la anterior, se obtiene el sobrenadante, que es la fracción ácido-soluble, a la cual se le midieron proteínas, según el método de Bradford (1976), obteniéndose una concentración de 0,6 mg/ml.
Técnicas empleadas.
a) RHAI.- Desarrollada según Sandoval y col. (1990), considerando el título de corte de 16. b) Técnicas inmunoenzimáticas.- Se siguió lo descrito para ELISA IgG para triquinosis (Sandoval y col., 1995) y por Contreras y col. (1999) para ELISA IgM e IgA. En líneas generales, consistió en sensibilizar placas de poliestireno con fondo plano (Dynatech) con 100 µl de antígeno diluído en buffer carbonato pH 9,6 0,05 M a una concentración de 0,05 µg por pocillo. Las placas se incubaron dos horas a 37º C y por la noche a 4º C, para posteriormente ser lavadas cinco veces en lavador automático Labsystems con buffer fosfato salino 0,01 M pH 7,2 con Tween 20 a una concentración del 0,05% (PBS-T). Posteriormente, se incubó la placa a 37º C, por una hora, con una solución bloqueadora (leche descremada al 3% en PBS-T), luego de eliminar el líquido se conservó a-20º C hasta su uso.
Los sueros fueron diluídos al 1:100 en leche descremada-PBS-T agregándose a los pocillos 100 µl de cada dilución, incubándose y lavándose como se ha descrito. Los conjugados fueron anti IgG, anti IgM y anti IgA humanas-peroxidasa (Sigma) a dilución óptima obtenida de titulaciones previas (1:10000 1:10000 y 1:5000 para IgG, IgM e IgA respectivamente) adicionándose 100 µl a cada pocillo y procediéndose nuevamente a incubar y lavar como se ha descrito.
Se agregaron 100 µl de sustrato (0,04% de ortofenilendiamina y 40 µl de H2 O2 al 30% en buffer citrato 0,1 M pH 5,0) a los pocillos respectivos, dejándose incubar en la oscuridad por un período de 10 minutos, luego de lo cual la reacción enzimática fue detenida con 50 µl de H2SO4 4 M.
La cantidad de color producto de la acción enzimática se determinó mediante la medición de la densidad óptima (DO) a 492 nm en un espec-trofotómetro Organon Teknika. A la lecturas de la DO de los sueros se les restó la correspondiente al blanco (leche descremada- PBS-T). ]]>
Se consideraron positivos aquellos sueros con lecturas de DO > 0,425, 0,412 y 0,142 para IgG, IgM e IgA respectivamente.
Las 223 muestras de sueros procedían de 97 (45,3%) mujeres y de 122 (54,7%) hombres, cuya edad promedio fue de 32,9 años (5-73 años).
La positividad de la RHAI, de la ELISA IgG, ELISA IgM y de la ELISA IgA encontrada en las muestras de sueros de los 113 pacientes confirmados o con fuertes evidencias de tener triquinosis, se muestra en la Tabla I.
De los 113 sueros analizados, 88 (77,9%) fueron positivos para las cuatro reacciones utilizadas, en tanto que 10 (8,8%) fueron negativos.
Los 15 sueros restantes resultaron positivos a lo menos para dos de las reacciones, hecho que se muestra en la Tabla II. ]]>
La Tabla III presenta la evolución serológica de las muestras de sueros de 17 pacientes que pudieron ser seguidos entre 10 y 15 días después de tomada la primera muestra. Diez de ellos correspondían a aquellos sueros inicialmente negativos para las cuatro reacciones.
Dos pacientes (CC y LP) fueron seguidos por más de cinco años y los resultados de su evolución serológica se exponen en la Tabla IV.
Respecto a los 110 sueros catalogados como posibles negativos (Tabla V) se obtuvo una concordancia del 95,5%. El resultado de los 5 sueros discordantes se muestra en la Tabla VI.
La triquinosis sigue siendo un problema de Salud Pública a nivel mundial (Stack, 1995) y la mayoría de las infecciones humanas por T. spiralis cursa en forma asintomática, tal como lo indica el 1,5% de seroprevalencia encontrado en la población general de Chile y el 0,8% de infección triquinósica encontrado en autopsias efectuadas en el Instituto Médico Legal de la Región Metropolitana (Contreras y col., 1994; Schenone y col., 1997).
No siempre el cuadro clínico es lo suficientemente característico para que permita efectuar con facilidad el diagnóstico. En ocasiones, en casos leves, dicho diagnóstico suele confundirse con un simple cuadro gripal con sensación febril y dolor muscular en época de invierno. Por otra parte, existe el hecho de que se consume con mayor frecuencia carne de cerdo en épocas frías, el paciente puede tener cierta dificultad en recordar el tipo de alimentación ingerida en las últimas semanas. Todo esto lleva a considerar la importancia de las reacciones serológicas, para apoyar la sospecha diagnóstica.
Los resultados expuestos en la detección de IgG, IgM e IgA específicas mediante ELISA son concordantes con lo publicado por otros autores. Para ELISA IgG, la sensibilidad varía entre 81 y 100%, para ELISA IgM, la positividad fluctúa entre 12,5% a los 23 días y 100% a los dos meses, en tanto que para ELISA IgA se ha encontrado una sensibilidad del 62% al mes de infección (van Knappen y col. 1982; Au y col., 1983; Rodríguez-Osorio y col., 1987; Morakote y col., 1991).
Diversos autores coinciden en que la respuesta de los anticuerpos específicos, en un individuo infectado, estará en relación con el número de larvas ingeridas y con el tiempo transcurrido desde la ingestión de la carne. Además la sensibilidad dependerá, de la técnica empleada y del antígeno utilizado. ]]>
Así, Kagan (1986) es de opinión que la detección de anticuepos específicos, se produce entre los 15 y 20 días en las infecciones agudas, en tanto que en infecciones subclínicas, esto sucede entre la cuarta y quinta semanas. Serrano y col. (1989), usando reacción de inmunofluorescencia indirecta (RIFI), encontraron positividad luego de 4-6 semanas de después de ocurrida la infección Limsurwan y Siriprasert (1994), a los dos meses post infección, hallaron un 94,2% de positividad mediante ELISA IgG, en tanto que Morakote y col. (1992) encontraron un 100% de IgG a los 50 días y a los 57 días IgM fue detectada en un 93,3%. Mahannop y col. (1995) encontraron un 100% de IgG mediante ELISA a los 57 días. Mikic y col. (1996) usando RIFI, detectaron un 100% de anticuerpos específicos en casos con triquinosis severa y sólo un 58,3% en aquellos pacientes con escasa sintomatología. Mediante la misma técnica, Wang y col. (1998) observaron un 70% de positividad a la semana del peak de la sintomatología, para ir aumentando progresivamente hasta alcanzar un 100% al mes.El 77,9% de concordancia de positividad encontrado en el grupo I, se eleva a 91,2% cuando se consideran positivos aquellos sueros en los que hubo detección de anticuerpos específicos con al menos dos técnicas. El seguimiento serológico de los casos que pudieron ser analizados a la semana demostró en todos ellos un aumento de la positividad incluídos los 10 pacientes en los cuales no se había previamente detectado anticuerpos específicos. Esto sugiere que ante una fuerte sospecha clínica con resultados serológicos negativos es recomendable repetir la serología después de la semana.
El seguimiento serológico por más de cinco años permitió establecer que tanto IgM como IgA fueron las primeras en negativizarse, pero en un período largo de tiempo, entre 17 y 32 meses en un caso y entre 48 y 60 meses en el otro, paciente que presentó un mayor compromiso clínico. La persistencia de anticuerpos específicos IgG, en pacientes que han tenido triquinosis aguda, se debería a una estimulación antigénica crónica que reflejaría la destrucción de las larvas del parásito en la musculatura, como lo proponen Kociecka y col. (1997), quienes detectaron anticuerpos de la clase IgG en un 96% a los 6 años de ocurrido un brote. Resultados similares son los obtenidos por Feldmeir y col. (1991) en que IgG aún era detectable a los tres años, en tanto que IgM estaba a niveles bajos o ausente, y por Morakote y col. (1992), en que a los 2 años 7 meses detectan IgG en un 88,2%, en tanto que IgM en un 11,7%. Harms y col (1993) encontraron un 38% de Acs IgG luego de 10 años.
En este sentido, con los métodos utilizados, es díficil discriminar si los auticuerpos detectados proceden de una infección reciente o son remanentes de una infección previa.
Respecto a los resultados del grupo II, el 95,5% de la concordancia de negatividad con las cuatro reacciones, demuestra una razonable confiabilidad en relación a la especificidad de las técnicas usadas.
De los cinco sueros positivos con una técnica, cuatro fueron positivos para la RHAI. Diversos estudios indican que la RHAI presenta una inespecificidad mayor que ELISA; estos resultados podrían deberse a reacciones cruzadas o a anticuerpos remanentes de infecciones pasadas. El quinto suero, que procedía de un brote epidémico, fue altamente positivo para ELISA IgA y el valor de DO para ELISA IgM fue levemente inferior al valor de corte establecido.
Mientras más cercana sea la proximidad filogenética entre los parásitos, mayor es la probabilidad de encontrar reacciones cruzadas (Ambroise-Thomas, 1986), sobre todo al usar fracciones antigénicas crudas o parcialmente purificadas. Diversos autores han encontrado reacciones cruzadas entre antígenos de T. spiralis y Acs específicos de otros helmintos (De la Rosa y col., 1995; Bitkowska, 1996). Sin embargo, debido a la tasa del 1,5% de prevalencia serólógica encontrada en Chile, tampoco se puede descartar una infección poliparasitaria (Contreras y col., 1994).
Por último, sería recomendable utilizar a lo menos dos técnicas, siendo las más adecuadas ELISA IgG, ELISA IgM y ELISA IgA.
Además, si existe una fuerte sospecha clínica con resultados serológicos negativos, se recomienda repetir la serología después de una semana.
Es necesario implementar el estudio de nuevos antígenos, fundamentalmente de excreción-secreción para ser evaluados con otros métodos tales como Western blott e Inmunodot. ]]>
Ambroise-Thomas, P. 1986. Inmunoparasitología: Origen, Estado Actual y Perspectivas. Bol. Of. Sanit. Panam. 101: 247-253. [ ]
Au, A.C.S., Ko, R.C., Simon, J. W. , Ridell, N.J., Wong, T.W.T. and Templer, M.J. 1983. Study of acute trichinosis in Ghurkas. Specificity and sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assay for IgM and IgE antibodies to Trichinella larval antigens in diagnosis. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 77: 412-415. [ ]
Bitkowska, S. 1996. Phosphochoine antigens in muscle larvae of Trichinella spiralis. Wiad. Parazytol. 42: 57-63. [ ]
Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248:264. [ ]
Contreras, M. del C. 1990. Inmunodiagnóstico de las parasitosis humanas. II. Su uso en protozoosis y helmintiasis. Bol. Chil. Parasitol. 45: 61-72. [ ]
Contreras, M. del C., Schenone, H., Sandoval, L. y García, M. 1994. Epidemiología de la triquinosis en Chile. Estudio de la prevalencia mediante reacciones inmunodiagnósticas. Bol. Chil. Parasitol. 49: 73-74. [ ]
Contreras, M. del C., Acevedo, E., Aguilera, S., Sandoval, L. y Salinas, P. 1999. Estandarización de la ELISA IgM e IgA para el inmunodiagnóstico de la triquinosis humana. Bol. Chil. Parasitol 54: 104-109. [ ]
De la Rosa, J. L., Alcántara, P. and Correa, D. 1995. Investigation of cross-reactions against Trichinella spiralis antigens by enzyme-linked immunosorbent assay and enzyme -linked immunoelectrotransfer blot assay in patients with various diseases. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2: 122-124. [ ]
Felmeier, H., Bienzle, U., Jansen-Rosseck, R., Kremsner, PG., Wieland, H., Dobos, G., Schroeder, S., Fengler-Dopp, D. and Peter, HH. 1991. Sequelae after infection with Trichinella spiralis: a prospective cohort study. Wien Klin. Wochenschr 103: 111-116. [ ]
Harms, G., Binz, P., Feldmeir, H., Zwingenberger, K., Schleehauf, D., Dewea, W., Kress-Hermesdorf, I., Klindworth, C and Bienzle, U. 1993. Trchinosis: a prospective controlled study of patients ten years after acute infection. Clin. Infect. Dis. 17: 637-643. [ ]
Kagan, I.G. and Norman, L. 1970. The serology of Trichinosis. In: Trichinosis in Man and Animals. Ed. S.E. Gould. Springfield. Illinois. Charles. C. Thomas. pp. 222-238. [ ]
Kagan, I.G. 1986. Serodiagnosis of parasitic diseases. In: Manual of Clinical Laboratory Immunology. 3th. Ed. Noel. R. Rose, Herman Friedman and John Faberg. American Society for Microbiology. Washington, D.C. pp. 467-496. [ ]
Knierim, F. 1964. El valor de las reacciones serológicas en el diagnóstico de algunas infecciones parasitarias. Bol. Chil. Parasitol 19: 119-123. [ ]
Kociecka, W., Mrozewicz, B and Gustowska, L. 1997. Clinical aspects of late sequelae of trichinellosis. Wiadomosci parazytologiczne 43: 309-311. [ ]
Limsuwan, S. and Siriprasert, V. 1994. A clinical study on triquinosis in Chagwat Phayao, Thailand. Southeast Asian J. Trop. Med. Public Health 25: 305-308. [ ]
Mahannop. P., Setasuban, P., Morakote, N., Tapchaisri, P and Chaicumpa, W. 1995. Immunodiagnosis of human trichinellosis and identification of specific antigen for Trichinella spiralis. Int. J. Parasitol. 25. 87-94. [ ]
Mikic, D., Marinkovic, V., Milosevic, N., Begovic, V., Velimirovic, S. and Tavcioski, D. 1996. Clinico-laboratory characteristics and treatment of patients with trichinosis. Vojnosanit Pregl. 53: 483-491. [ ]
Ministerio de Salud de Chile . Departamento de Pogramas sobre el Ambiente. Número y prevalencia de enfermedades de interés sanitario en cerdos beneficiados en Chile. Total 1990-1999. [ ]
Morakote, N., Khamboonruang, C., Siriprasert, V., Suphawitayanukul, S., Marcanantachoti, S. and Thamasonthi, W. 1991. The value of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for diagnosis of human trichinosis. Trop. Med. Parasitol. 42: 172-174. [ ]
Morakote, N., Sukhavat, K., Khamboonruang, C., Siriprasert, V., Suphawitayanukul, S., and Thamasonthi, W. 1992. Persistence of IgM and IgE antibodies in human trichinosis. Trop. Med. Parasitol. 43: 167-169. [ ]
Rodríguez-Osorio, M., Gómez-Morales, M.A., Gómez-García, V., López-Cortez, L., Cuello-Contreras, J.A. y Pichón- Díaz, J. 1987. Estudio de un amplio brote de triquinosis humana mediante las técnicas de inmunofluorescencia indirecta y ELISA (enzyme-linke-immunosorbent assay). Rev. Iber. Parasitol. 47: 283-287. [ ]
Sandoval, L., Pérez, S. y Contreras, M. del C. 1990. La reacción de hemaglutinación indirecta en el diagnóstico de la triquinosis. Bol. Chil. Parasitol. 45: 80-83. [ ]
Sandoval, L., Salinas, P., Rugiero, E. y Contreras, M. del C. 1995. Valor diagnóstico de la ELISA IgG para triquinosis usando antígeno de Melcher. Bol. Chil. Parasitol. 50: 92-96. [ ]
Schenone, H., López, R., Barilari, E., Contreras, M del C. y Castillo, D. 1997. Tendencia actual de la triquinosis humana en Chile. Bol. Chil. Parasitol. 52: 22-25. [ ]
Serrano, R., Lacasa, J., Veláquez, J., Ziad, F. y Aznar, R. 1989. Triquinosis: nuevo brote epidémico por ingesta de embutido de jabalí. Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 7: 428-431. [ ]
Stack, P.S. 1995. Trichinosis. Still a public health threat. Postgrad. Med. 6: 137-144. [ ]
van Knappen, F., Franchiment, J.H., Verdone, A.R., Stumf, J. and Undeutsch, K. 1982. Detection of specific immunoglobulins (IgM, IgA, IgE) and total IgE levels in human trichinosis by means of the enzyme-linke immunosorbent assay (ELISA). Am. J. Trop. Med. Hyg. 31: 973-976. [ ]
Wang, Z.Q., Cui, J., Wu F., Mao, F.R. and Jin X.X. 1998. Epidemiological, clinical and serological studies on trichinellosis in Henan Province, China. Acta tropica 71: 255-268. [ ] ]]>
