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Revista chilena de cardiología

versión On-line ISSN 0718-8560

Rev Chil Cardiol vol.30 no.1 Santiago  2011

http://dx.doi.org/10.4067/S0718-85602011000100003 

Rev Chil Cardiol 2011; 30:22 - 27

INVESTIGACIÓN CLÍNICA

 

Polimorfismo rs3091244 del gen de la proteína C reactiva influencia los niveles séricos de CRP-hs en individuos de la región de La Araucanía

Single nucleotide polymorphism rs3091244 of CRP gene is associated with higher levels of hs-CRP in Chilean subjects

 

Nicolás Saavedra 1-2, Angela Fallard 1, Marco Araya1, Pamela Serón1, Fernando Lanas1-2-3, Luis A. Salazar 1-2

1) Laboratorio de Biología Molecular y Farmacogenética, Depto. de Ciencias Básicas, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.
2) Núcleo de Desarrollo Científico - Tecnológico en Biorecursos (BIOREN), Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.
3) Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco.

Dirección para correspondencia


Resumen:

Introducción: Múltiples genes y sus polimorfismos han sido asociados al origen de la formación de la placa aterosclerótica y subsecuentemente el desarrollo de enfermedad cardiovascular. Uno de estos genes implicados, es el que codifica para la proteína C reactiva (CRP), importante marcador proinflamatorio y de inflamación. Entre las variantes identificadas en este gen, el polimorfismo rs3040244 C>T>A ha sido asociado a elevados niveles de CRP-hs. Sin embargo, los resultados obtenidos entre poblaciones son contradictorios.

Objetivo: investigar la asociación entre el polimorfismo rs3091244 y niveles séricos de CRP-hs en individuos de la región de La Araucanía.

Métodos: Se determinó la concentración sérica de CRP-hs a 157 sujetos adultos sin parentesco entre ellos. La genotipificación del polimorfismo rs3091244 se realizó mediante la técnica de PCR-RFLP

Resultados: La distribución de genotipos para el polimorfismo rs3091244 del gen CRP fue la siguiente: CC 11.5%, CT 45.2%, TT 31.2%, CA 5.0% y TA 7.0%. Los portadores de los genotipos TT y TA presentaron elevadas concentraciones séricas de CRP-hs cuando comparadas al genotipo de referencia CC (p=0.030 y p=0.002, respectivamente).

Conclusión: Nuestros datos demuestran que el polimorfismo rs3091244 del gen CRP contribuye para el aumento de los niveles séricos de CRP-hs, y por tanto incrementa el riesgo cardiovascular.


Background: Several genes and their polymorphisms have been associated with atherosclerotic plaque formation and subsequent development of cardiovascular disease. One of them is the C-reactive protein (CRP) encoding gene, CRP being a recognized important pro-inflammatory and inflammatory marker. Biallelics and triallelics single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the promoter region of this gene have been identified. The rs3040244 C>T>A is known as the variant most strongly associated with high hs-CRP levels. However, the results between populations are contradictory. Thus, the purpose of this study was to investigate the possible association between the rs3091244 polymorphism and serum levels of hs-CRP in Southern Chilean individuals.

Methods: We determined the serum hs-CRP in 157 unrelated adult subjects. The rs3091244 polymorphism was detected by PCR-RFLP.

Results: The genotype distribution for the rs3091244 polymorphism of the CRP gene was as follows: CC 11.5%, CT 45.2%, TT 31.2%, CA 5.0% and TA 7.0%. Individuals carrying the TT and TA genotypes showed higher serum hs-CRP when compared to the reference CC genotype (p = 0.030 and p = 0.002, respectively).

Conclusion: Our data shows that the rs3091244 SNP of the CRP gene contributes to increase the hs-CRP levels, which may imply an increased cardiovascular risk.

Key words: hs-CRP; CRP gene; Risk factors.


 

Introducción

Actualmente, se reconoce a la Proteína C reactiva (CRP), como un predictor de riesgo independiente asociado a la incidencia de enfermedades cardiovasculares (ECV)1. Es así, como diversos estudios se han enfocado en clarificar el efecto directo de CRP sobre el proceso aterogénico, encontrándose acción vía disminución en la producción de óxido nítrico (NO)2, estimulación de la captación de lipoproteínas de baja densidad (LDL)3, facilitación de adhesión y migración de leucocitos mediante estimulación de moléculas de adhesión4, 5 e incluso ejerciendo efecto en la desestabilización de la placa aterosclerótica, mediante incremento en la expresión de la metaloproteinasa-2 (MMP-2)6.

Es por ello, que actualmente, la medición de los niveles de CRP-hs ha cobrado gran importancia, ya que de acuerdo a su concentración se puede categorizar el riesgo cardiovascular relativo de un individuo en bajo (CRP < 1.0 mg/L), moderado (1.0 - 3.0 mg/L) y alto (> 3.0 mg/L)7.

Adicionalmente al mejoramiento de la sensibilidad de los métodos para medir los niveles de CRP-hs sérica, el estudio de variantes en el gen que codifica CRP (CRP), emerge como una alternativa para la predicción de niveles elevados de esta proteína. CRP es codificada por un gen ubicado en el brazo largo del cromosoma 1, compuesto únicamente por 2 exones y 1 intrón, sin embargo, se trata de una región altamente polimórfica, con más de 40 variantes conocidas8. Estas, se han asociado tanto a niveles elevados como disminuidos de CRP9-11, ejemplo de ello, una repetición de dos nucleótidos (GT) con 13 alelos, dos de los cuales están asociados a menores valores de CRP12.

Dentro de las variantes fuertemente asociadas a altos niveles de CRP, se encuentran dos polimorfismos de la región promotora rs3093062 y rs3091244, ambos localizados en regiones responsables de la unión de factores de transcripción. En el caso del polimorfismo rs3091244 C>T>A, en presencia del alelo T, la actividad del promotor se ve exacerbada13. Aunque se ha comprobado este efecto mediante experimentación in vitro, existe discordancia acerca de los genotipos asociados a elevados niveles de CRP-hs en distintas poblaciones.

Así, el objetivo del presente estudio fue evaluar la posible asociación entre los valores de CRP-hs y los genotipos del polimorfismo rs3091244 C>T>A en una muestra de individuos de la población general de la región de La Araucanía.

Métodos

Sujetos

Un total de 157 individuos adultos, sin ningún grado de parentesco entre sí, con edades comprendidas entre 35 y 70 años, todos provenientes de la región de La Araucanía, fueron incluidos en este estudio. Se les aplicó una encuesta para obtener información de historia familiar de enfermedad cardiovascular y de factores de riesgo tradicionales. Además, se les determinó peso, talla y se obtuvieron valores de presión arterial sistólica y diastólica. Todos los individuos, aprobaron participar en este estudio mediante la firma de un consentimiento informado, previamente aprobado por el Comité de Ética Científica del Servicio de Salud Araucanía Sur (Temuco, Chile).

Determinaciones bioquímicas

Se obtuvieron muestras de sangre, luego de ayuno de 12 horas, para la determinación de los niveles séricos de glucosa, colesterol total, triglicéridos y HDL-C mediante métodos enzimático-colorimétricos. La concentración de colesterol de las LDL (LDL-C) fue calculada mediante la fórmula de Friedewald. La concentración de CRP-hs fue determinada mediante método turbidimétrico (CRP-hs Electa-Lab) en un analizador fotométrico Humalyzer 3000.

Genotipificación de la variante rs3091244 del gen CRP

El ADN genómico fue extraído a partir de sangre total anticoagulada con EDTA mediante la técnica descrita por Salazar et al.14. Para la genotipificación, se amplificó un fragmento de 287 pares de bases (bp) del gen CRP mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) con partidores previamente descritos12. Posteriormente, este fragmento fue sometido a restricción enzimática con las endonucleasas HinAl y SpeI en reacciones individuales, para lograr discriminar los alelos C y A respectivamente, mientras que el alelo T, se dedujo por descarte. Los productos de PCR y de restricción enzimática fueron evaluados mediante electroforesis en gel de agarosa al 2% teñido con bromuro de etidio (0.5mg/L) y visualizado en un sistema de fotodocumentación digital.

Análisis estadístico

El análisis de los datos obtenidos se realizó utilizando el programa SigmaStat, versión 3.5 (San Rafael, EE.UU.). Las variables continuas se expresan como media ± desviación estándar. La asociación entre variables fue analizada mediante t de Student. Además, se utilizó Chi-cuadrado (X2) para el análisis de las variables no continuas y para verificar el equilibrio Hardy - Weinberg. El nivel de significancia estadística considerado en este estudio fue p <0,05.

Resultados

Características de los sujetos en estudio

Las características biodemográficas de los 157 individuos investigados en este estudio, se resumen en la Tabla 1. En la Tabla 2, se puede apreciar la categorización de riesgo cardiovascular de los sujetos estudiados, según niveles de CRP-hs; encontrándose diferencias significativas entre los grupos de alto, moderado y bajo riesgo, sólo para los valores de IMC.


Tabla 1. Características clínicas y demográficas de los sujetos estudiados

Variables
n=157

Edad, años

50.8 ± 9.5

Hombres, %

66

Diabetes, %

6

PAS, mm Hg

128 ± 22

PAD, mm Hg

79 ± 11

IMC, kg/m2

29.8 ± 4.6

Índice cintura / cadera

0.92 ± 0.08

Fumadores, %

26

Hipertensión, %

23

Angina, %

1.2

IAM, %

1.2

CRP-hs, mg/L

2.1 ± 2.8

Colesterol total, mg/dL

192 ± 30

LDL - C, mg/dL

126 ± 29

HDL - C, mg/dL

40 ± 9

Triglicéridos, mg/dL

126 ± 57

Glucosa, mg/dL

109 ± 56



CRP-hs: Proteína C reactiva ultrasensible, IAM: infarto agudo al miocardio, IMC: índice de masa corporal, EAC: enfermedad arterial coronaria, PAS: presión arterial sistólica, PAD: presión arterial diastólica, HDL-C: Colesterol de las HDL, LDL-C: Colesterol de las LDL.


Tabla 2: Categorización de riesgo cardiovascular según concentraciones séricas de CRP-hs

Riesgo Relativo

Bajo
<1.0
(n=74)

Moderado
1.0 - 3.0
(n=58)
Alto
>3.0
(n=25)

P*


Mujeres, %

37

31

24

0.462

Hombres, %

63

69

76

Diabetes mellitus, %

2

8

12

0.213

PAS, mm Hg

125 ± 25

129 ± 19

133 ± 23

0.320

PAD, mm Hg

77 ± 12

80 ± 11

81 ± 11

0.223

IMC, Kg./m2

28.5 ± 3.2

30.3 ± 4.9

32.9 ± 6.3

< 0.001

Índice Cintura/Cadera

0.91 ± 0.09

0.92 ± 0.07

0.94 ± 0.10

0.380

Glucosa, mg/dL

96 ± 19

109 ± 70

158 ± 101

0.406

Colesterol total, mg/dL

181 ± 27

208 ± 25

168 ± 38

0.077

LDL-C, mg/dL

115 ± 27

142 ± 21

112 ± 46

0.131

HDL-C, mg/dL

43 ± 8

39 ± 11

35 ± 3

0.468

Triglicéridos, mg/dL

115 ± 59

142 ± 60

109 ± 47

0.609


CRP-hs, Proteína C reactiva ultrasensible; IMC, índice de masa corporal; EAC, enfermedad arterial coronaria; PAS, presión arterial sistólica; PAD, presión arterial diastólica; HDL-C, Colesterol de las HDL; LDL-C, Colesterol de las LDL. Valores de CRP-hs en mg/L. *Test de ANOVA o Chi-cuadrado.


Tabla 3. Distribución de genotipos y frecuencia relativa de alelos para el polimorfismo rs3091244 del gen CRP en 157 individuos de la región de La Araucanía.

Genotipos
Alelos

CC

CT

TT

CA

TA

AA

C

T

A

11.5%

45.2%

31.2%

5%

7%

0%

0.370

0.570

0.060

(18)

(71)

(49)

(8)

(11)

(0)


Equilibrio de Hardy-Weinberg: C>T>A; %2= 1.02 (p=NS). Número de individuos en paréntesis.


Tabla 4. Concentraciones de CRP-hs según genotipo para el polimorfismo rs3091244 del gen CRP.

Genotipos

CC

CT

TT

CA

TA

(18)

(71)

(49)

(8)

(11)

1.17 ± 0.79a, b, c
2.10 ± 2.89
2.90 ± 3.07
2.44 ± 3.79
3.56 ± 2.63

Valores en mg/L, presentados como media ± DE. Número de individuos en paréntesis.
a p = 0.030 vs. Genotipo TT
b p = 0.002 vs. Genotipo TA
c p = 0.022 vs. Genotipos CAITA

Genotipificación de la variante rs3091244 del gen CRP

La distribución genotípica y la frecuencia relativa de los alelos para el polimorfismo estudiado del gen CRP son mostradas en la Tabla 3. La distribución de genotipos fue la esperada según el equilibrio de Hardy-Weinberg. Además, se analizó la concentración de CRP-hs para cada genotipo, observándose diferencias significativas al comparar los niveles entre los portadores del genotipo de referencia (CC) y los genotipos TT (p=0.030), TA (p=0.002), CA/TA (p=0.022), presentando estos últimos, niveles elevados de CRP-hs (Tabla 4).

Discusión

CRP es un importante marcador inflamatorio que ejerce una acción directa en el proceso de aterogénesis y es considerado marcador de riesgo de ECV, pudiendo ser estratificado según sus niveles plasmáticos. Al hacer la clasificación del riesgo cardiovascular de los individuos estudiados, según los diferentes niveles de CRP-hs y relacionarlos con las características clínicas y de laboratorio, se asoció los niveles de CRP-hs por sobre los 3 mg/L a un mayor valor de IMC, datos semejantes a los encontrados por otro grupo con anterioridad15 y que pudieran ser consecuencia de un fenómeno inflamatorio asociado a obesidad, siendo IL-6, secretada por adipocitos, sindicada como activador de la síntesis de CRP en el híga-do16, 17. En otros de los parámetros estudiados, se observa una tendencia al alza (PAS, PAD, glucosa) o a la baja (HDL), sin embargo, no mostraron diferencias estadísticamente significativas entre las tres categorías de riesgo. En el presente estudio, se evaluó por primera vez en el país, la asociación entre los niveles séricos de CRP-hs y el polimorfismo rs3091244, una de las variantes fuertemente relacionada al aumento de CRP18, sin embargo, el genotipo determinante de esta asociación ha mostrado ser distinto entre poblaciones8, 19 20.

Nuestros hallazgos evidencian una predominancia en la frecuencia relativa del alelo T (0.570), y del genotipo CT (45.2%) por sobre los demás genotipos encontrados (TT: 31.2%, CC: 11.5%, TA: 7% y CA: 5%), además de la ausencia del genotipo AA. Se observan discrepancias entre la distribución genotípica y alélica con estudios anteriormente publicados13, 18, debido, probablemente, a las diferencias étnicas de las poblaciones analizadas. Al analizar los valores de CRP-hs entre los portadores del genotipo CC versus CA/TA se observó una diferencia significativa (p=0.022), comprobándose mayores niveles de CRP-hs en individuos que presentan los alelos A y/o T comparado con el alelo C (alelo normal o de referencia); resultado similar al obtenido por otros autores que asocian los mismos alelos a niveles elevados de CRP-hs21, 22. El mecanismo que explicaría los mayores niveles de CRP-hs en estos individuos, podría ser atribuido a una mayor actividad del promotor del gen CRP en presencia de dichos alelos, traduciéndose en mayores niveles plasmáticos de CRP23 y consecuentemente mayor riesgo cardiovascular. Entre las limitaciones que presenta nuestro estudio, podemos comentar que sólo se realizó una medición de CRP-hs a cada individuo, siendo conveniente para calcular las cifras de CRP-hs, realizar dos determinaciones separadas entre 1 a 3 semanas7, 24. Sin embargo, asumimos el sesgo de una única medición, considerando que la CRP-hs presenta escasa fluctuación a corto plazo25. Además, de acuerdo a lo encontrado por Ridker et al. 26, una única determinación puede ser útil como predictor de enfermedad clínica. En resumen, nuestro estudio muestra una asociación entre la variante rs3091244 del gen CRP con niveles elevados de CRP-hs, por lo que podría ser útil como marcador molecular de riesgo cardiovascular, considerando que una elevación en los niveles de CRP significa mayor riesgo para el desarrollo de patologías del aparato circulatorio. Sin embargo, ello debiera corroborarse con otros estudios a lo largo del país, para poder extrapolar estos hallazgos.

Agradecimientos:

Trabajo financiado por Fundación Araucaria & proyecto DIDUFRO DI09-'007, Dirección de Investigación y Desarrollo, Universidad de La Frontera.

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Recibido el 28 de diciembre 2009/Aceptado el 7 de julio 2010 

Correspondencia:

Dr. Luis Antonio Salazar Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera. Av. Francisco Salazar 01145, Casilla 54-D, TemucoFono: (45) 592 895 - Fax: (45) 592 832. lsalazar@ufro.cl