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Revista de otorrinolaringología y cirugía de cabeza y cuello

versión On-line ISSN 0718-4816

Rev. Otorrinolaringol. Cir. Cabeza Cuello v.70 n.2 Santiago ago. 2010

http://dx.doi.org/10.4067/S0718-48162010000200002 

Rev. Otorrinolaringol. Cir. Cabeza Cuello 2010; 70:99-108

ARTICULO DE INVESTIGACIÓN

 

TNFα modifica la respuesta de la frecuencia de batido ciliar a la carga viscosa, asociado a alteraciones en el calcio intracelular en células ciliadas respiratorias humanas

TNFα modifies ciliary beat frequency in response to viscous overload, associated to changes in intracellular calcium in human respiratory ciliated cells

 

Claudia González G1, Trinidad Sánchez D2, Alejandra Pérez S2, Ximena Fonseca A1, Manuel Villalón B2.

1    Médico. Departamento Otorrinolaringología, Hospital Clínico Pontificia Universidad Católica de Chile.
2    Doctor en Ciencias. Departamento de Fisiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Pontificia Universidad Católica de Chile.

Dirección para Correspondencia


RESUMEN

Introducción: Secreciones sinonasales patológicas y elevados niveles de factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) se han encontrado en mucosa sin usal de pacientes con sinusitis crónica. Las células ciliadas respiratorias tienen una reserva funcional que les permite autorregular su frecuencia de batido ciliar (FBC) en respuesta a cambios en la viscosidad, modificando los niveles de calcio intraacelular [Ca+2]ic.

Objetivo: Nuestro objetivo es determinóar si TNFα afecta el mecanismo de autorregulación y la homeostasis del calcio intraacelular frente a cambios en la viscosidad.

Material y método: Cultivos primarios de explantes de tejido adenoideo. Registro de FBC mediante microfotodensitometría. Cultivos tratados con TNFα (10 ng/ml) o control durante 24 y 48 horas. Se in crementó la viscosidad agregando dextrano 500 al 10% y 20%. Se midió [Ca+2]ic en células cargadas con Fura 2AM.

Resultados: El tratamiento con TNFα por 48 horas produjo una significativa disminución de la FBC a baja viscosidad, aumento significativo de [Ca+2]ic y caída mayor de FBC en cultivos tratados con tapsigargina (bloqueador bomba calcio-ATPasa retículo). in o se encontró diferencia a alta viscosidad.

Conclusión: Después de 48 horas de exposición a TNFα se observa un efecto negativo en el mecanismo de adaptación de las células ciliadas a un medio con baja viscosidad, probablemente secundario a cambios en la homeostasis del [Ca+2]ic.

Palabras clave: Frecuencia de batido ciliar, factor de necrosis tumoral alfa, TNFα, viscosidad, calcio intraacelular.


ABSTRACT

Introduction: Pathologic sin onasal secretions and elevated levels of tumor necrosis factor alpha (TNFα) have been in oted in sin us mucosa ofpatients with chronic sinusitis. Respiratory ciliated cells have a functional reserve that allows them to autoregulate their ciliary beat in response to the changesin viscosity, modify in g intraacellular calcium levels [Ca+2]ic.

Aim: Our goal was to determinate if TNFα affect this autoregulation to viscosity and calcium homeostasis.

Material and Method: Primary cultures from adenoid tissue expiants. Ciliary beat frequency (CBF) was recorded usin g microphotodensitometry Cultures viere treated with TNFα (10 ng/ml) or control during 24 and 48 hours. Viscosity wasincreased by add in g dextran 500 10% and 20%. [Ca+2]ic was determined in cells loaded with Fura-2AM.

Results: 48 hours treatment with TNFα produced a significant decrease in CBF at low viscosity significant increase in [Ca+2]ic and greater decrese in CBF in cultures treated with thapsigargin (endoplasmic calcium-ATPase pump blocker).

Conclusions: After 48 hours ofexposure to TNFα a negative effect in the adaptation mechanism to a low viscous media is observed in ciliated cells, probably secondary to changesin homeostasis of [Ca+2]ic.

Key words: Ciliary beat frequency tumor necrosis factor alpha, TNFα, viscosity, intraacellular calcium.


INTRODUCCIÓN

El epitelio de toda la vía aérea está cubierto por un epitelio ciliado, cuyos cilios baten constantemente, manteniendo constante el transporte mucociliar. Este último es un importante mecanismo de defensa que permanentemente remueve bacterias y partículas fuera de la vía aérea1. La velocidad de transporte mucociliar es determinada pr in cipalmente por la frecuencia de batido ciliar. in crementos modestos de la FBC pueden resultar en grandes aumentos en la velocidad de transporte ciliar2. La FBC es regulada por señales de diversa in aturaleza3. Lasinfecciones bacterianas tienen un efecto negativo sobre el transporte mucociliar, ya sea por acción de citoquinas o por cambio en las características viscoelásticas del moco (hipersecreción, disminución en el contenido de agua, cambio en la expresión de muclnas), generando un aumento en la viscosidad de las secreciones4. Las células ciliadas son capaces de mantener una FBC relativamente constante sobre un gran rango de viscosidades del medio eterno. Este mecanismo de autorregulación ha sido observado en epitelio de oviducto de hámster, tráquea humana y de conejo5. Probablemente es responsable de evitar el colapso del transporte mucociliar frente a alta viscosidad. Esta respuesta podría generarse localmente dentro de la célula y está acoplada a in crementos en [Ca+2]ic6.

El factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) es una citoquina proinflamatoria producida por diferentes tipos celularesin cluyendo macrófagos, monocitos, linfocitos, queratinocitos y fibroblastos en respuesta a infección, inflamación, daño u otras alteraciones. Se ha observado un aumento en los valores básales de TNFα en secrecionesnasales de pacientes con infecciones del tracto respiratorio alto7, y luego de exposición a antígeno en pacientes con r in itis alérgica8. Los niveles de TNFα son significativamente más altos en secreción nasal de pacientes con sinusitis crónica que pacientesin ormales9 y se mantienen elevados en pacientes con sinusitis crónica con pobre respuesta a tratamiento médico, sugiriendo que la persistencia de mediadores de la inflamación hace a la mucosa más susceptible de infecciones y episodios recurrentes10. Su efecto sobre la frecuencia de batido ciliar in vitro es controvertido. Algunos autores señalan que a bajas concentraciones (0,1 y 1 ng/ml) estimula la FBC, mientras que en altas concentraciones (10 ng/ml), disminuye la FBC11. Por el contrario, otros han observado un efecto estimulador de la FBC luego de la exposición a 10 ng/mL de TNFα12.

Actualmente se desconoce cómo la interacción entre cambios en la viscosidad del medio externo y liberación de citoquinas puede afectar el funcionamiento de la célula ciliada. Planteamos como hipótesis que los niveles elevados de TNFα, observados en enfermedades crónicas de la vía aérea superior, tienen un impacto negativo sobre el transporte mucociliar, alterando el funcionamiento in ormal de las células ciliadas. El objetivo de este estudio es evaluar cómo TNFα afecta el mecanismo de autorregulación a la carga viscosa y [Ca+2]ic.

MATERIAL Y MÉTODO

Muestras de tejido

Se obtuvo tejido adenoideo de pacientes pediátricos (entre 3 y 12 años de edad) sometidos a adenoldectomía por patología obstructiva (hipertrofia adenoidea o adenoamigdal in a), previa autorización de los padres. El diseño del estudio y el consentimiento in formado fueron revisados y aprobados por el Comité de Ética de la Pontificia Universidad Católica de Chile.

El tejido adenoideo fue colocado en solución de suero fisiológico para remover los coágulos y luego en solución sal in a balanceada Hank's (HBSS) a pH 7,4, suplementada con antibióticos (estreptomic in a 10 µg/ml, penicilina G100 U/ml, amfotericlna B 0,125 µg/ml).

En el laboratorio, las muestras de tejido adenoideo fueron lavadas con DMEM-F12 suplementado con antibióticos para remover restos de sangre, luego fueron incubadas toda la in oche a 4°C en medio DMEM F12 con antibióticos y pronasa 0,05% p/v. Al día siguiente el tejido fue transferido a un contenedor con medio DMEM-F12 con suero fetal bov in o (SFB) 5% y el epitelio se removió mecánicamente.

Cultivos primarios

Los cultivos primarios se realizaron con el método intraoducido por Verdugo y cols13, que permite obtener monocapas confluentes de células epiteliales, descrito previamente14. Brevemente, el epitelio adenoideo es cortado en trozos de 2-4 mm, que son depositados en cubreobjetos pretratados con gelatina al 0,1%, y éstos en cámaras de Rose. Las cámaras de Rose se llenaron con 2 mi de medio in HS que contiene 10% de suero de caballo in activado por calor (ph 7,2-7,4) y se mantienen en una incubadora a 37°C.

El medio de las cámaras se renueva cada 48 horas. Después de aproximadamente 5 días se forma una monocapa de células ciliadas que presentan batido ciliar sincronizado. Cuando esto ocurre el cultivo se considera listo para estudio.

Inmunofluorescencia TNF receptor 1 (TNFR1) y TNF receptor 2 (TNFR2)

Los cultivos celulares fueron fijados y procesados por la técnica previamente descrita15. Las secciones fueron incubadas ya sea con anticuerpo policlonal TNFR1 goat-anti rat 1:50 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) o anticuerpo policlonal TNFR2 goat anti-rat 1:100 (Santa Cruz Biotechnology) durante 2 horas a 37°C. Posteriormente fueron incubadas durante 1 hora a 37°C con el anticuerpo secundario donkey anti-goat HRP (Santa Cruz Biotechnology). A cont in uación fueron incubadas con Avld in Biot in Enzyme Reagent (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) durante 1 hora a temperatura ambiente y la reacción fue visualizada por la adición de 3,3'- tetrahidrocloruro diaminobencidina (DAB; 1,2 mg/ml).

Detección del batido ciliar con la técnica de microfotodensitometría

La técnica descrita previamente14, consiste en el análisis de las fluctuaciones de luz que genera el movimiento de los cilios y que son detectadas por un fotodiodo asimétrico montado en el plano fotográfico del microscopio de fase16. El sistema que actualmente está montado en el laboratorio, permite la detección de la frecuencia en células ciliadasin dividuales que contienen aproximadamente 50-100 cilios por célula.

Tratamiento con TNFα

Una vez que los cultivos alcanzaron confluencia, éstos fueron incubados con factor de necrosis tumoral alfa recombinante humano (hrTNFα) (Sigma-Aldrich) (10 ng/ml) o solución control (medio de cultivo) por 24 ó 48 horas. Posteriormente se midió FBC.

Tratamiento con tapsigargina

Se midió FBC basal por 10 minutos, luego se agregó tapsigargina (bloqueador de la bomba calcio-ATPasa del retículo endoplásmico) en concentración final de 2,5 µM. Se realizaron mediciones de FBC y sólo se agregó la solución con dextrano una vez que la FBC volvió a la basal.

Medición de frecuencia úe batido ciliar

Se realizaron lavados del cultivo con HBSS y se midió la frecuencia de batido ciliar en el microscopio a 35°C. Se seleccionaron dos o tres células con una frecuencia basal promedio para ese cultivo, con buena señal y se realizaron mediciones de FBC cada un minuto durante cinco minutos. Cuando la frecuencia permanecía estable se realizaron los experimentos.

Incremento en la viscosidad del medio externo

Se agregó al cultivo dextrano (dextran 500 Sigma Aldrich) diluido en HBSS, en concentración final de 5%, 10%, 15%, 20% y 25% y se realizaron mediciones de FBC durante 20 minutos. Posterior a esto se lavó el medio con HBSS y se controló FBC por cinco minutos, para evaluar que la droga utilizada in o haya alterado la función celular durante el experimento.

Mediciones de niveles de calcio intraacelular o citosólico [Ca2+]i

Se realizaron mediciones de [Ca2+]i utilizando la técnica de espectrofluorometría descrita previamente17. Los cultivos con actividad ciliar espontánea a 37°C fueron cargados con el in dicador fluorescente de [Ca2+]i Fura-2AM ( in vltrogen) (1.5 µM in HBSS) durante 45 minutos a 37°C. Las células fueron excitadas a 349 y 380 in m en un microscopio in lkon Diaphot equipado con un espectrofluorometro Photon Technology international (Lawrencevllle, in J) para análisis de razón entre ambas fluorescencias. Después de 10 minutos de estabilización, la in tensidad de razón fue cont in uamente grabada y los cultivos fueron estimulados con solución de dextrano 10%. La emisión de la in tensidad de fluorescencia fue detectada con un fotomultipllcador y analizada utilizando un programa de análisis de fluorescencia (FÉLIX versión 1.1).

Análisis estadístico

Los datos son expresados como promedio ± EE (error estándar). Los datos de FBC fueron analizados después de la transformación del arcoseno de los porcentajes. Las comparaciones estadísticas entre las diferentes condiciones experimentales fueron realizadas utilizando test T y ANOVA con el programa GraphPad Prlsm4. El criterio para diferencia estadísticamente significativa fue p <0,05.

RESULTADOS

Expresión de los receptores TNFαRI y TNFαR2 en cultivo: La tinción inmunohistoquímica in dicó que el TNFαRI está presente en células ciliadas en cultivo. La marca se concentró en el citoplasma de las células ciliadas. in o se observó inmunorreactividad positiva para TNFαR2. Las secciones tratadas en ausencia de anticuerpo primarlo in o mostraron inmunorreactividad (Figura 1).


Figura 1. Las células ciliadas respiratorias humanas en cultivo expresan el receptor 1 de TNFα (TNFR1). Microfotografía de una inmunofluorescencia in directa de un cultivo primario de células ciliadas. A) TNFR1, se observa inmunorreactividad positiva en el citoplasma celular (flecha). B) Condición control en ausencia de anticuerpo primario.

FBC y carga viscosa: La exposición de células ciliadas humanas a in cremento en la carga viscosa del medio externo produjo una disminución en la FBC hasta alcanzar un in uevo valor estable dentro de los primeros 10 minutos (Figura 2a). La FBC disminuyó aproximadamente 20% dentro del rango de 4,75 a 37cP (soluciones con dextrano 5% a 15%), y 30% en el rango de 73 a 122,4 cP (soluciones con dextrano 20%-25%). En este último intervalo, in o se observó mayor caída en la FBC a pesar del in cremento en la viscosidad (Figura 2b).


Figura 2. Las células ciliadas en cultivo presentan un mecanismo de adaptación a la carga viscosa. A) Curso temporal del efecto de la carga viscosa sobre la FBC. Cultivos expuestos a diferentes concentraciones de dextrano. Los datos corresponden a valores promedio de FBC y se expresan como porcentaje respecto a la FBC basal (100%). B) Relación entre la carga viscosa y la FBC. Se gráfico la FBC promedio una vez alcanzado el in uevo valor basal de FBC posdextrano.

Efecto del tratamiento con TNFα (24 horas) sobre la respuesta a carga viscosa: El in cremento en la carga viscosa con solución de dextrano 10% produjo una caída máxima en la FBC de 11,49%±2,61 en los cultivos tratados con TNFα y 16,81%±6,78 en los controles (p >0,05). La solución con dextrano 20% produjo una caída máxima en la FBC de 29,21 %±4,57 en los cultivos tratados con TNFα y 29,13%±3,85 en los controles (p >0,05) (Figura 3). No se observó efecto significativo del Efecto del tratamiento con TNFα (48 horas) sobre la respuesta a carga viscosa: En los cultivos tratados por 48 horas con TNFα frente al in cremento en la viscosidad con dextrano 10%, se observó una caída máxima en la FBC de 22,11 %±1,91, a diferencia de los controles en que la caída fue de 12,2%±4,21. La diferencia entre el área bajo la curva de ambos grupos durante la exposición a dextrano fue estadísticamente significativa p <0,05. La exposición a dextrano 20% determinó una disminución máxima en la FBC de 25,95%±6,24 en los cultivos tratados y 22,45% en los controles. No se observó diferencia significativa en el área bajo la curva (Figura 4).


Figura 3. El tratamiento con TNFα por 24 horasin o modifica la respuesta de FBC a la carga viscosa. Curso temporal de los cambios en la FBC luego de 24 horas de tratamiento con TNFα (10 ng/ml) o solución control (HBSS, 1cP) expuestos a: A) dextrano 10% (14,4cP) o B) dextrano 20% (73cP). C) Área bajo la curva de la relación entre FBC (Figuras A y B) y el tiempo en respuesta a dextrano 10% y 20%. Cada barra representa el promedio ± EE.


Figura 4. El tratamiento con TNFα por 48 horas disminuye la FBC en respuesta a baja viscosidad. Curso temporal de los cambios en la FBC luego de 48 horas de tratamiento con TNFα (10 ng/ml) o solución control (HBSS, 1cP) expuestos a: A) dextrano 10% (14,4cP) o B) dextrano 20% (73cP). C) Área bajo la curva de la relación entre FBC (Figuras A y B) y el tiempo en respuesta a dextrano 10% y 20%. Cada barra representa el promedio ±EE La disminución déla FBCydel área bajo la curva es significativamente mayor en las células tratadas con TNFα y expuestas a dextrano 10%. *p <0,05.

Efecto del tratamiento con TNFα (48 horas) sobre los niveles de [Ca2+]i en respuesta a carga viscosa: El aumento de la viscosidad extracelular con dextrano 10% produjo un rápido y transitorio in cremento en los niveles de [Ca2+]ic (Figura 5a), tanto en controles como en cultivos tratados. Sin embargo el área bajo la curva fue significativamente mayor en los cultivos tratados con TNFα (Figura 5b).


Figura 5. El tratamiento por 48 horas con TNFα in crementa los niveles de calicó intraacelular en respuesta al estímulo con dextrano 10%.
A) Curso temporal de la concentración de Ca*2 intraacelular expresado como in tensidad de fluorescencia en función del tiempo.
B) Área bajo la curva de la relación entre la concentración de Ca*2 y el tiempo (Figura A). *p <0,05.

Para evaluar el origen del [Ca2+]ic involucrado en esta respuesta se agregó el bloqueador de la bomba de calcio del retículo endoplásmico tapsigargina (2,5 µM a cultivos tratados y controles previo a la exposición a dextrano 10%. Se observó una caída máxima en la FBC de 33,43%±7,6 en los cultivos tratados con TNFα (48 horas) y tapsigargina, con un área bajo la curva significativamente menor que los cultivos tratados solamente con TNFα (Figura 6a). Los cultivos controles tratados con tapsigargina presentaron una disminución máxima en la FBC de 14,75%±2,19. in o se observó diferencia significativa en el área bajo la curva en comparación con los controles sin bloqueo (Figura 6b).


Figura 6. El calcio intraacelular está involucrado en la respuesta de FBC a baja viscosidad luego del tratamiento por 48 horas con TNFα. A) Curso temporal de los cambios en la FBC en cultivos tratados por 48 horas con TNFα (10 ng/ml) o solución control (HBSS) expuestos a dextrano 10% en presencia o ausencia de tapsigargina 2,5µM (bloqueador de la bomba Ca*2 ATPase reticular). B) Área bajo la curva de la relación entre FBC y tiempo (Figura A). Cada barra representa el promedio ± EE para los diferentes tratamientos. 'Diferencia estadísticamente significativa (p <0,05). Observe que luego de la exposición a dextrano 10%, la FBC de los cultivos controlesin o es afectada por el tratamiento con tapsigargina, mientras que los cultivos tratados con TNFα (48 horas) mostraron una mayor disminución en la FBC luego del tratamiento con tapsigargina.

DISCUSIÓN

Nuestros resultados sugieren que el mecanismo de autorregulación de las células ciliadas frente a la carga viscosa descrito en otros sistemas, se encuentra presente también en las células ciliadas de vía aérea superior. Este mecanismo permite al epitelio adaptar su FBC a diferentes viscosidades, evitando el colapso del transporte mucociliar. Observamos que cultivos de células ciliadas tratados con una citoqu in a pro inflamatoria (TNFα) por 48 horas, en condiciones de baja viscosidad (dextrano 10%) reducen significativamente la FBC. Estos cambios se correlacionan con alteraciones en la respuesta del [Ca2+]ic.

El aumento de la viscosidad del medio externo provoca una disminución en la FBC de los cilios que transportan moco en diversos sistemas6'18. in uestros resultados son similares a lo descrito en el epitelio de tráquea de conejo5 y en epitelio de oviducto513. En condiciones de baja viscosidad (dextrano 10%) se produce una disminución de la FBC importante, mientras que intervalos mayores de viscosidad (dextrano 20% y 25%) la FBC disminuye levemente o permanece relativamente constante. Andrade y col, demostraron que los cambios en la viscosidad del medio externo se asocian a cambios en [Ca2+]ic, sugiriendo que el calcio participa como señal que acopla las variaciones en la viscosidad del medio externo con las modificaciones en la FBC6. Además demostró que las modificaciones de la FBC a baja viscosidad son dependientes de los depósitos de [Ca2+]ic, mientras que a alta viscosidad se gatilla el mecanismo de regulación dependiente del calcio extracelular.

El factor de necrosis tumoral alfa (TNFα) es una citoquina proinflamatoria producida por varios tipos celularesin cluyendo células epiteliales y macrófagos. Se han encontrado niveles elevados de expresión de genes de TNFα en pacientes con sinusitis crónica hiperplástica comparado con controles19 y niveles elevados de esta citoquina en mucosa nasal de pacientes con sinusitis crónica comparado con controles20. Por otra parte la persistencia de niveles elevados de mARN de TNFα, además de otras citoquinas (IL-1 beta, IL-6, IL-8, MCP-1) se asoció a persistencia de alteraciones en la tomografía de cavidades paranasales y persistencia de alteraciones endoscópicas en pacientes con sinusitis crónica10. Estos hallazgos sugieren un rol importante de esta citoquina en la patogenia de esta enfermedad.

Existen dos subtipos predominantes de receptores para TNFα, p55TNF o TNFR1 y p75TNF o TNFR2. La gran mayoría de las respuestas conocidas de TNFα ocurren por activación de TNFR121. Nuestros cultivos mostraron inmunorreactividad positiva en el citoplasma de las células ciliadas para TNFR1 en condiciones básales, in o así para TNFR2, posiblemente porque este último receptor se expresa en menor cantidad.

En enfermedades crónicas de vía aérea superior e inferior como el caso de la rinosinusitis crónica se ha observado un aumento en la viscosidad de las secreciones mucosas con un promedio de 16 poise22. sin embargo in o existen estudios in vitro que evalúen el efecto de la suma de niveles elevados de una citoquina proinflamatoria y aumento de la carga viscosa sobre la FBC de las células del epitelio respiratorio.

Nuestros resultados muestran que la FBC presenta una caída significativamente mayor en respuesta a baja viscosidad cuando las células han sido expuestas por 48 horas a TNFα. no se observó alteración en la respuesta de FBC a viscosidades más altas ni con menos tiempo de exposición a esta citoquina. Esto se asoció a [Ca2+]ic significativamente más altos en los cultivos pretratados con TNFα. Estos efectos son similares a lo descrito en epitelio respiratorio humano en fibrosis quística, en que se observó que agentes proinflamatorios aumentan el tamaño de los depósitosintraacelulares y la respuesta de calcio23,24. Considerando que la respuesta de la FBC a baja viscosidad depende de los depósitos de [Ca2+]ic, planteamos como hipótesis que el tratamiento con TNFα modifica la homeostasis del calcio celular proveniente de los depósitosintraacelulares.

En vía aérea inferior diferentes autores han demostrado el rol de TNFα en modular la hiperreactividad de vía aérea alterando la homeostasis del calcio en las células del músculo liso, en que el pretratamlento con TNFα facilita la movilización de [Ca2+]ic inducida por broncocons-trlctores, efecto que probablemente involucra la expresión de proteínas25. En células de músculo liso traqueal se demostró que TNFα mediante la activación del RITNFα estimula la expresión de ICAM 1 por una vía de señalización sensible a tapsigargina26 (depleta los depósitos de [Ca2+]ic). Estos hallazgosin dican que la expresión de genes mediada por TNFα en células musculares lisas es íntimamente dependiente de los depósitos de [Ca2+]ic que pueden ser depletados por tapsigargina. En in uestro estudio al depletar los depósitos de calcio intraacelular, las células pretratadas con TNFα presentaron una caída en la FBC en respuesta al in cremento en la viscosidad del medio con dextrano 10%, significativamente mayor que las célula sin o tratadas con tapsigargina y significativamente mayor que las células controles (sintraatamiento con TNFα). En las células pretratadas 48 horas con TNFα la respuesta de la FBC y los mayores niveles de [Ca2+]ic observados en respuesta a baja viscosidad, sugieren que TNFα parece modificar el mecanismo de respuesta a la viscosidad del medio externo haciendo a las células dependientes de los depósitos de calcio intraacelular. Estos resultados apoyan la idea que epitelios expuestos a citoquinas presentan una hiperreactividad en el retículo endoplásmlco liso24.

En condición control o en ausencia de citoquinas proinflamatorias, es posible que en el epitelio respiratorio humano la exposición a baja viscosidad (dextrano 10%) in o dependa del [Ca2+]ic de la misma manera que lo descrito para células del oviducto. Es probable que el mecanismo de control de FBC frente a variaciones de viscosidad obedezca a un mecanismo mixto, dependiente de depósitos de [Ca2+]ic y de influjo de calcio extracelular. Al observar el gráfico de FBS versus viscosidad (Figura 2B), la viscosidad asociada a dextrano 10% se ubica en el punto de inflexión de la curva, entre caída significativa de FBC y la activación de un mecanismo de autorregulación observado para viscosidades mayores.

En conclusión in uestros resultados demuestran que los cultivos de células ciliadas respiratorias humanas expresan los receptores de TNFα R1 y R2. Además la exposición a TNFα por 48 horas afecta la respuesta de la FBC frente a cambios en la viscosidad, probablemente alterando la homeostasis del calcio intraacelular por un mecanismo dependiente de depósitosintraacelulares sensibles a tapsigargina. Esin ecesario realizar estudios adicionales para establecer el efecto que procesosinflamatorios crónicos pueden tener sobre los mecanismos de control del transporte mucociliar, a nivel de las vías de señalización molecular y sus implicancias clínicas.

Fuente de apoyo económico:

1. Fondos investigación Sociedad Chilena de Otorrinolaringología, Medic in a y Cirugía de Cabeza y Cuello.

2. Fondecyt 1080679.

 

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