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Revista de otorrinolaringología y cirugía de cabeza y cuello

versión On-line ISSN 0718-4816

Rev. Otorrinolaringol. Cir. Cabeza Cuello v.67 n.2 Santiago ago. 2007

http://dx.doi.org/10.4067/S0718-48162007000200003 

Rev. Otorrinolaringol. Cir. Cabeza Cuello 2007; 67: 108-114

TRABAJO ORIGINAL

 

Expresión de óxido nítrico sintetasa en mucosa sinusal de pacientes portadores de sinusitis crónica versus controles

Expression of nitric oxide synthase in sinus mucosa of chronic sinusitis patients vs controls

 

Carla Napolitano V1, Claudia González G2, Carlos Céspedes F3, Ximena Fonseca A2, Carlos Vio L4.

1Médico Jefe Servicio de Otorrinolaringología Hospital Regional de Talca.
2Médico, Departamento de Otorrinolaringología, Hospital Clínico de la Pontificia Universidad Católica de Chile.
3Tecnólogo médico Facultad Ciencias Biológicas, Universidad Católica de Chile.
4Profesor Titular Facultad Ciencias Biológicas, Universidad Católica de Chile.

Dirección para correspondencia


RESUMEN

Introducción: El óxido nítrico producido en las cavidades paranasales juega un importante rol en la fisiología nasal ya que aumenta la frecuencia del batido ciliar, optimiza el barrido mucociliary tiene un efecto bacteriostático y virustático.

Diversos estudios muestran que el óxido nítrico nasal exhalado en pacientes con rinosinusitis crónica es significativamente más bajo que en sujetos sanos. Esto podría estar determinado por una alteración en la difusión del óxido nítrico a través de los ostia de drenaje obstruidos o por una menor producción de óxido nítrico por parte de los portadores de rinosinusitis crónica. En este último caso, esto podría corresponder al evento primario en la etiopatogenia de la rinosinusitis crónica.

Objetivos: Estudiar y comparar cualitativamente con técnica de inmunohisto-química la expresión de las isoformas e-NOS e I-NOS de la óxido nítrico sintetasa en mucosa sinusal de pacientes con rinosinusitis crónica y pacientes controles, sin patología rinosinusal infecciosa o alérgica.

Material y método: Para responder a esta interrogante se realizó un estudio comparativo de casos y controles, con el objetivo de cuantificar con técnica de inmunohistoquímica la expresión de las isoformas endotelial e inducible de la óxido nítrico sintetasa en mucosa sinusal de pacientes con rinosinusitis crónica y pacientes controles sin patología rinosinusal infecciosa o alérgica.

Resultados: Ingresan al estudio un total de 11 pacientes. Seis de ellos son el grupo control y 5 con sinusitis crónica. Ambos grupos presentan resultados similares.

Conclusión: Los resultados no muestran ninguna diferencia en la expresión de óxido nítrico sintetasa, tanto en su isoforma endotelial como inducible, en la mucosa sinusal de pacientes portadores de rinosinusitis crónica comparado con sujetos sanos.

Palabras clave: óxido nítrico, expresión óxido nítrico sintetasa.


ABSTRACT

Introduction. Nitric oxide produced in the paranasal sinuses plays an important role in nasal physiology because it increases ciliary beat frequency, improves mucociliary clearance and has a bacteriostatic and virustatic effect.

Several studies have shown that exhaled nasal nitric oxide was substantially lower in chronic sinusitis patients, compared to healthy subjects. This could be determined by altered nitric oxide diffusion through obstructed drainage ostia, or by chronic sinusitis patients having lower nitric oxide production.

Aims. To qualitatively compare by immunocytochemistry the expression of the iNOS and eNOS isoforms of nitric oxide synthase in the sinus mucosa of chronic sinusitis patients and control subjects.

Materials and methods. A case-control comparative study was carried out in order to compare by immunocytochemistry the expression of inducible and epithelial isoforms of nitric oxide synthase in nasal mucosa of chronic sinusitis patients and control subjects, with no infectious or allergic rhinosinusal pathology.

Results. The results show no difference in the expression of the inducible or epithelial isoform of nitric oxide synthase in the nasal mucosa of chronic sinusitis patients as compared to healthy subjects.

Key word. Nitric oxide, nitric oxide synthase expression.Introducción


INTRODUCCIÓN

El óxido nítrico (ON) está Involucrado en diversos procesos fisiológicos del organismo, como la regulación del tono vascular, la actividad plaquetarla y la neurotransmisión, tanto a nivel del sistema nervioso central como periférico, entre otros1. Particularmente en la vía aérea, el ON ha demostrado tener un Importante efecto bacteriostático2 y viustático3, estimular el barrido mucociliar aumentando la frecuencia del batido ciliar4-5, ser mediador de la Inflamación6, y regular el tono bronquial y vascular pulmonar7,8. En condiciones normales en la vía aérea superior, el ON es producido principalmente por las células epiteliales ciliadas de las cavidades paranasales, y en menor cantidad por la mucosa nasal8.

El ON se genera a partir de la transformación del aminoácido L-arginina en L-citrulina, proceso realizado por la enzima óxido nítrico slntetasa (NOS). Esta enzima presenta tres ¡soformas conocidas: Tipo I o neuronal(nNOS) y Tipo III o endotelial (eNOS), que se expresan en forma constitutiva en las células epiteliales de la vía aérea; y la ¡soforma inducible o Tipo II (¡NOS)9. Existen varias diferencias entre ellas. Las eNOS y nNOS son dependientes del sistema calcio-calmodulina para su activación, no son Inhibidas por cortlcosteroldes y producen pequeñas cantidades de ON10, mientras que la ¡NOS es Independiente del sistema calcio-calmodulina, es activada por cltoquinas prolnflamatorlas y endotoxinas, es inhibida por corticosteroides y produce hasta 1000 veces más ON que las ¡soformas constitutivas10.

Mediante estudios con técnica de inmuno-histoquímica11 se ha podido determinar que las tres ¡soformas de óxido nítrico sintetasa (endotelial, Inducible y neuronal) se expresan constitutivamente en el epitelio slnusal humano sin patología. Estudios posteriores han demostrado que la ¡NOS presente en las cavidades paranasales posee otras diferencias con las ¡NOS de otra ubicación, además de expresarse constitutivamente: es dependiente del sistema calcio-calmodulina y no es inhibida por corticosteroides10. Eso sí, la ¡NOS nasal produce grandes cantidades de ON, al Igual que otras ¡NOS.

La producción de ON puede ser modificada por factores ambientales, ya que se ha observado una disminución del ON exhalado en pacientes tabáquicos12, y con el uso de descongestionantes tópicos como oximetazolina13. No se han reportado alteraciones en la producción de ON con el uso de esferoides tópicos o sistémicos o antimicrobianos en pacientes sanos14.

La etiopatogenla de la rinosinustis crónica aún no se conoce a cabalidad. Determinaciones del óxido nítrico nasal exhalado, medido por quimiolumi-nlscencia, han demostrado una disminución de la medición de ON exhalado nasal en pacientes con rinosinustis crónica comparado con sujetos sanos y pacientes con resfrío común1516, lo que se correlacionó con una disminución de la frecuencia de batido ciliar17. Se desconoce la causa de esta alteración, pero se postula que podría estar determinada por una alteración en la difusión del ON a través de los ostia de drenaje obstruidos, si bien no se puede descartar que se deba a una menor producción de ON por parte de la mucosa slnusal de estos pacientes, ya que no existen estudios inmunohistoquímlcos que cuantlflquen la expresión de la enzima óxido nítrico slntetasa en pacientes con rinosinustis crónica versus pacientes sanos.

Para responder esta Interrogante se diseñó un estudio con el objetivo de estudiar y comparar cualitativamente con técnica de mmunohistoquimica la expresión de las ¡soformas e-NOS e I-NOS de la óxido nítrico slntetasa en mucosa slnusal de pacientes con rinosinustis crónica y pacientes controles, sin patología rinosinusal Infecciosa o alérgica.

SI nuestros resultados mostraran que la disminución del ON nasal exhalado en pacientes con rinosinustis crónica comparado con sujetos sanos se debe a una menor producción de ON por parte de la mucosa slnusal, cabe preguntarse ¿es éste el evento primarlo en la etlopatogenla de la rinosinustis crónica?

MATERIAL Y MÉTODO

Se realizó un estudio comparativo de casos y controles, con análisis ciego, en conjunto entre el Hospital Clínico de la Pontificia Universidad Católica de Chile y el Laboratorio de Ciencias Fisiológicas de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Pontificia Universidad Católica de Chile, entre diciembre de 2003 y octubre 2004. Todos los pacientes Incluidos en el estudio leyeron y firmaron un consentimiento Informado que autoriza al equipo médico a examinar, disponer y utilizar los tejidos u órganos extirpados, con propósitos científicos o docentes.

El grupo en estudio está constituido por pacientes mayores de 18 años con diagnóstico de rinosinustis crónica (clínico y radiológico con Tomografía Computada de Cavidades Paranasales), con Indicación quirúrgica definida por ausencia de respuesta a tratamiento médico (2 cursos de 30 días de antibióticos de segunda línea, cortlcoldes tópicos y orales, y lavados nasales), corroborada por Tomografía de Cavidades Paranasales, que muestre compromiso slnusal después de completado el tratamiento. Durante la cirugía endoscóplca de cavidades paranasales con la técnica de Messerkllnger se tomó una blopsla de mucosa del seno paranasal más afectado.

El grupo control está formado por pacientes mayores de 18 años, con diagnóstico de adenoma hlpoflslarlo con Indicación de abordaje transesfenoidal de hipófisis, y por pacientes con Indicación de descompresión orbitaria endoscóplca, en ambos casos con Tomografía Computada de Cavidades Paranasales prequlrúrglca normal. Durante la cirugía (abordaje transesfenoldal de hipófisis o descompresión orbitaria endoscóplca) se toma muestra de mucosa sana de seno paranasal.

Se excluyeron del estudio los pacientes con antecedentes de tabaquismo, cirugía nasal o de cavidades paranasales previa, clínica de rinitis alérgica y/o test cutáneo positivo, uso de oxlme-tazollna en aerosol nasal en el último mes, y pollposls nasal al examen físico o Tomografía Computada de Cavidades Paranasales.

Una vez obtenidas las muestras, éstas fueron Inmediatamente fijadas en paraformaldehído al 4%, Incluidas en paraflna y cortadas con un grosor de 6 µm. Las secciones fueron Incubadas en el anticuerpo primarlo (antl-eNOS y antl-INOS monoclonal de ratón, Transductlon Laboratories) a una dilución de 1:50 por 2 horas y enjuagadas en PBS. Luego fueron Incubadas con el anticuerpo secundarlo (¡nmunoglobullna cabra antlrratón, Transductlon Laboratories) por 30 minutos y enjuagadas en PBS. Para la tinción, las secciones se hicieron reaccionar con peroxldasa de estreptavldlna por 30 minutos y se enjuagaron en PBS. Finalmente fueron tratadas con solución sustrato-cromogena por 3 minutos y montadas después de tinción control con hematoxlllna.

RESULTADOS

Ingresaron al estudio un total de 11 pacientes: 6 pacientes al grupo control, y 5 al grupo de sinusitis crónica. De los 6 pacientes controles, 5 proceden de abordajes transesfenoldales de hipófisis y 1 de una descompresión orbitaria por orbltopatía de Graves. Las edades promedio fueron de 37 años en el grupo control y 45 años en el grupo sinusitis crónica. En el grupo control el 33,3% de la muestra fue de género femenino, mientras que en el grupo sinusitis crónica, el 60% de la muestra fue de género femenino.

El análisis bajo microscopía de luz de los cortes de mucosa slnusal de los pacientes controles reveló una Intensa ¡nmunoreactlvldad de las ¡soformas endotellal (eNOS) (Figura 1) e ¡nduclble (¡NOS) de óxido nítrico slntetasa. Esta tinción se observó en las células epiteliales ciliadas, glándulas de la submucosa y células endotellales de los vasos de la submucosa, Indistintamente para ambas ¡soformas de la enzima. Las células epiteliales ciliadas presentaron dos patrones distintos de tinción ¡nmunohlstoquímlca, lo que se observó para ambas ¡soformas: 1) un patrón citoplasmático difuso (Figura 1), y 2) un patrón ciliar (Figura 2), en el cual la tinción compromete exclusivamente el borde apical ciliado del epitelio.


Figura 1: Paciente control, tinción (+) para el eNOS, patrón citoplasmático.


Figura 2: Paciente control, tinción (+) para ¡NOS, patrón ciliar.

La microscopía de luz de la mucosa slnusal del grupo portador de sinusitis crónica reveló en 2 casos (40%) una Infiltración Inflamatoria crónica de la submucosa, asociada a epitelio slnusal Inmaduro de tipo regenerativo (disminución o ausencia de células columnares ciliadas).

Al Igual que en los sujetos controles, en la mucosa sinusal de la totalidad de los pacientes portadores de sinusitis crónica se detectó una Intensa ¡nmunorreactividad de óxido nítrico slntetasa, tanto de eNOS como de ¡NOS (Figura 3), en las células epiteliales ciliadas, glándulas de la submucosa y células endotellales de los vasos de la submucosa. Las células epiteliales ciliadas de los pacientes con sinusitis crónica también presentaron los dos patrones de tinción ¡nmunohistoquímica descritos en los pacientes controles para ambas ¡soformas: el patrón citoplasmático y el patrón ciliar, excepto en los dos pacientes que mostraron un epitelio slnusal Inmaduro con disminución o ausencia de células columnares ciliadas, en cuyo caso no se observó el patrón de tinción ciliar, ya que se tiñó el citoplasma de células epiteliales de aspecto inmaduro.


Figura 3: Paciente portador de sinusitis crónica, tinción (+) para ¡NOS, patrón citoplasmático y ciliar.

DISCUSIÓN

No se encontraron diferencias cualitativas al comparar la expresión de óxido nítrico slntetasa (NOS) en la mucosa slnusal de pacientes sanos versus pacientes portadores de sinusitis crónica, tanto en relación al tipo de célula que expresa la enzima (células epiteliales ciliadas, glándulas de la submucosa y células endotellales de los vasos de la submucosa), a la ¡soforma de NOS expresada (¡NOS y eNOS) y al patrón de expresión de NOS (citoplasmático y ciliar), exceptuando en este último caso, a los 2 pacientes que presentaron Inmadurez de las células columnares ciliadas, y por lo tanto, ausencia de patrón ciliar.

Considerando estos resultados, nuestro estudio no apoya la hipótesis de una menor producción de ON por parte de la mucosa de los pacientes portadores de sinusitis crónica, sino que más bien de una menor llegada de ON al sitio de medición de éste, la cavidad nasal, lo que podría explicarse por una menor difusión del ON a la cavidad nasal secundarla a edema de la mucosa slnusal, obstrucción de los ostia de drenaje de los senos paranasales propio del proceso de rinosinustis, o efecto de presión negativa al Interior del seno mal ventilado.

La ¡soforma ¡nducible de la óxido nítrico slntetasa (¡NOS) es más eficiente en la producción de ON que las ¡soformas endotelial y neuronal. De esta manera, un cambio en la proporción de la expresión de las distintas ¡soformas, predominando las menos eficientes, podría haber explicado las bajas mediciones de ON exhalado nasal en sinusitis crónica, pero tampoco encontramos ninguna diferencia en el tipo de ¡soforma expresada entre ambos grupos.

La demostración de la presencia de óxido nítrico slntetasa en la mucosa slnusal de los pacientes portadores de sinusitis crónica abre nuevas perspectivas terapéuticas, haciendo posible el tratamiento de esta enfermedad con dadores de óxido nítrico, como la L-arginina, ya que el requisito para la conversión de L-arginina en ON es la presencia de la enzima que cataliza esta reacción. De esta forma se podría potenciar el batido ciliar y el efecto bacteriostático y viustático que el ON tiene sobre el epitelio slnusal en los pacientes portadores de rinosinustis crónica.

El número total de pacientes que Ingresó al estudio fue bajo, dado por la relativa baja incidencia de las patologías estudiadas (abordaje transesfenoldal de hipófisis, descompresión orbitaria, sinusitis crónica con Indicación quirúrgica), y a los variados y prevalentes criterios de exclusión (rinitis alérgica, tabaquismo, etc.). A pesar de ello, fue suficiente para nuestro análisis cualitativo, ya que todos los pacientes del grupo sinusitis crónica presentaron inmunoreactlvidad para ambas ¡soformas de NOS.

CONCLUSIÓN

Este estudio demuestra la presencia constitutiva de la enzima óxido nítrico sintetasa, en sus isoformas endotelial e induclble (eNOS e ¡NOS), en la mucosa sinusal humana normal.

La mucosa sinusal de los pacientes portadores de rinosinustis crónica expresa ambas ¡soformas de óxido nítrico sintetasa, eNOS e ¡NOS, sin diferencias cualitativas con respecto a los pacientes controles. Este hallazgo hace factible el uso terapéutico de dadores de óxido nítrico, como la L-arginlna, en rinosinustis crónica.

De acuerdo a esto, no habría diferencias en la producción de óxido nítrico entre sanos y portadores de rlnosinusltis crónica. La disminución observada en la medición de ON exhalado nasal en pacientes con rlnosinusltis crónica comparado con sujetos sanos se debería a una menor difusión del ON desde las cavidades paranasales a la cavidad nasal.

Agradecimientos

A la Sociedad Chilena de Otorrinolaringología, Medicina y Cirugía de Cabeza y Cuello y a su Comité de Investigación y Desarrollo, por el financiamiento otorgado para la realización de este proyecto.

Al Dr. Jorge Caro Leteller por su aporte en la Inclusión de pacientes controles a este estudio.

 

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