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Idesia (Arica)

versão On-line ISSN 0718-3429

Idesia vol.35 no.2 Arica jun. 2017  Epub 13-Maio-2017

http://dx.doi.org/10.4067/S0718-34292017005000028 

Coproducción de ficocianina y exopolisacáridos en el cultivo de Arthrospira platensis

 

Co-production of phycocyanin and exopolysaccharides in the cultivation of Arthrospira platensis

 

Hugo Fabián Lobatón Garcia1*, Philipp Schwerna2, Rainer Buchholz2

 

1 Centro de Investigaciones Uniagustiniano - CIU. Uniagustiniana. Bogota, Colombia. Autor por correspondencia: hugo.lobaton@uniagustiniana.edu.co
2 Institute of Bioprocess Engineering. Friedrich-Alexander-University of Erlangen-Nuremberg. Nuremberg, Germany.


RESUMEN

En este estudio se discute una estrategia para la producción simultánea de exopolisacáridos y ficocianina con productividades razonables de estos dos metabolitos de alto valor agregado mediante el cultivo de Arthrospira platensis en un fotobiorreactor tipo columna de burbujeo de 1 litro. Los productos de interés fueron: exopolisacáridos con actividades biológicas prometedoras y ficocianina con propiedades de utilidad para las industrias cosméticas y alimentaria. La concentración de biomasa, nitratos, fico-cianina y exopolisacáridos se determinaron por medio de métodos estandarizados. Los resultados experimentales en este trabajo muestran que la fracción másica de ficocianina se degradó rápidamente después de 50 horas de cultivo, esto como resultado del agotamiento de nitrato en el medio de cultivo. Con la ayuda de un modelo matemático que asocia el incremento de biomasa con el rendimiento teórico de consumo de nitrato se estimó la tasa de utilización de este. El tiempo de agotamiento predicho está de acuerdo con el período en que la ficocianina comienza a disminuir. Adicionalmente, el modelo fue directamente validado con puntos experimentales. Con el fin de reducir las pérdidas en las fracciones de masa de ficocianina y mantener las productividades de exopolisacáridos se estableció una estrategia de nitrato de lote alimentado, aumentando con esta la fracción másica de fico-cianina a 30 mg gbiomasa-1, comparada con la total degradación de este compuesto en el experimento control (no adiciones de nitrato). Además, en estas condiciones de cultivo la formación de exopolisacáridos fue de 120 mg gbiomasa-1 comparado con 20 mg gbiomasa-1 en el experimento control.

Palabra clave: fotobiorreactor, lote alimentado, metabolitos, modelo matemático.


ABSTRACT

This study discusses the effects of nitrate time-course in Arthrospira platensis cultivation, and will focus on the targetproducts: exopolysaccharides with promissory biological activities and phycocyanin with interesting properties for the cosmetic and food industries. Therefore, the possible simultaneous production of both high value products with reasonable productivities will be examined. A. platensis was cultivated in 1 L bubble column photobioreactor. Biomass, nitrate, phycocyanin and exopolysac-charides were estimated with standard methods. The experimental results in this work show that phycocyanin mass fraction degraded as a result of the complete nitrate depletion and nitrate additions during the cultivation, which helped keeping constant this molecule until new limitations appear. Finally, the current work has demonstrated that by controlling nutrient additions such as nitrate, reasonable mass fractions in both products phycocyanin (30 mg gbiomasa-1) and exopolysaccharides (120 mg gbiomass-1) could be obtained.

Key words: photobioreactor, fed-batch, metabolites, mathematical model.


Introducción

Arthrospira platensis es un microorganismo fotosintético con un mercado actual de 3000 T año-1 debido a su valor proteico (70%) (Xie et al., 2015). El proceso productivo indicado es económico, fácil de implementar y mantener. Puede servir como un excelente complemento en la alimentación de una familia rural, pensando en 5 m2 de superficie cultivada por persona. (Ponce López, 2013). Sin embargo, dependiendo de las condiciones de cultivo esta cianobacteria es capaz de producir otros metabolitos con alto valor agregado. Por ejemplo la ficocianina, un pigmento presente en la biomasa de A. platensis, ha despertado el interés en la industria cosmética y alimentaria mundial, debido a su brillante color azul y potentes capacidades antioxidantes para ser usado como colorante natural (Borowitzka, 2013). Otros compuestos de valioso interés son: el ácido gamalinoleico, un ácido graso insaturado esencial, y el Calcio-Spirulan, un polisacárido con actividades antivirales y antibacterianas promisorias (Mader et al., 2016)

Si bien A. platensis se cultiva con éxito en lagunas abiertas tipo "raceway", las bajas productividades de biomasa lograda en este tipo de cultivos (0,04 g DW l-1 d-1) (Jiménez et al., 2003), así como la posible obtención de productos con baja calidad, hace que sea necesario el cultivo de estas cianobacterias en fotobiorreactores cerrados. Productividades en biomasa hasta 20 veces superiores a las obtenidas en los cultivos abiertos han sido encontradas en el uso de fotobiorreactores cerrados (Bezerra et al., 2011; Chen et al., 2013). Aunque el crecimiento es relevante en la producción de cianobacterias, como en otros muchos procesos biotecnológicos, la formación del producto es el objetivo principal. Por lo tanto, para que sea económicamente viable, el cultivo de cianobacterias en fotobiorreactores se requiere de óptimos rendimientos del producto, así como bajos costos operativos y de inversión (Bertucco et al., 2014), adicionalmente, la economía del proceso puede mejorarse mediante la recuperación de más de un compuesto, esto enmarcado en un concepto de biorrefinería a partir de cianobacterias. Estrategias óptimas en el suministro de nutrientes (ejemplo nitrato) así como el uso preciso de la luz, son parámetros claves que podrían hacer que el cultivo de esta cianobacteria logre una mayor eficiencia. La ficocianina es una proteína presente en A. platensis cuya función es capturar la luz para llevar a cabo el proceso fotosintético y, en consecuencia, la intensidad de la luz y el nitrato son un factor crucial en la acumulación de este ficobiliproteina (Chen et al., 2013). Además en el cultivo en lote de A. platensis, los nutrientes (ej. nitrato) disminuyen con el tiempo y, por lo tanto, la composición de metabolitos (ficocianina, proteínas, lípidos y exopolisacáridos) sufre cambios cuantitativos y cualitativos. Por ejemplo, se ha encontrado que la privación completa de nitrato en el medio de cultivo genera una degradación en la ficocianina (Gilbert et al., 1996; Lau et al., 1977). Un estudio más reciente realizado por (Xie et al., 2015) la pérdida de ficocianina después de la resuspensión de A. platensis en un medio libre de nitrato. Una vez se restauró el suministro de nitratos la ficocianina fue resintetizada y su contenido en fracción másica comenzó a aumentar.

Además de la ficocianina, A. platensis cultivada en condiciones de crecimiento fotosintéticas, produce diferentes cantidades de un exopolisacáridos (EPS) dependiendo de las condiciones de cultivo (Borowitzka, 2013; Pulz and Gross, 2004). Los exopolisacáridos están compuestos de seis azúcares neutros, xilosa, rhamose, fructosa, galactosa, manosa, glucosa y dos ácidos urónicos: ácido glucurónico y ácido galacturónico. Además de la presencia de grupos sulfato, cuya localización no es completamente clara (Filali Mouhim et al., 1993).

Es este trabajo se plantea una estrategia de adición de nitratos por lotes en cultivo de A. platensis a fin de obtener simultáneamente productividades razonables de ficocianina y exopolisacáridos.

Materiales y Métodos

Cianobacteria y composición del medio

Arthrospira platensis fue obtenida del instituto NIES en Japón y precultivada en medio Zarrouk. El medio estaba compuesto de (por litro) 13,61 g NaHCO3, 4,03 g Na2CO3, 1,25 g NaNO3, 1 g K2SO4, 1 g NaCl, 0,5 g K2HPO4, 0,2 g MgSO4-7H2O, 0,04 g CaCl2-2H2O y 5 ml de una solución la que consiste de (por litro), 0,7 g FeSO4-7H2O, 0,8 g EDTA, 0.01 g H3BO3, 0,002 g MnSO4-4H2O, 0,001 g ZnSO47H2O, 0,001 g Co (NO3)2-6H2O, 0,001 g Na2MoO4'2H2O. (Lau et al., 1977)

El cultivo semilla se llevó a cabo en un Erlenmeyer constantemente agitado a 110 rpm, 25 °C y una intensidad de luz de 40 μmol m-2 s-1. Cultivos en la fase exponencial fueron usados para los cultivos en la columna de burbujeo.

Cultivo en la columna de burbujeo

A. platensis fue cultivada en un fotobiorreactor tipo columna de burbujeo de 1 litro (Figura 1)caracterizado por (Walter et al., 2003) con un flujo de gas de 1 vvm. El gas fue suministrado como una mezcla de aire y CO2 (1,4% (v/v)). Todos los experimentos fueron llevados a cabo con una temperatura de 30 °C y una intensidad de luz de 600 μmol m-2 s-1 (Iluminado con lámparas fluorescentes alrededor del reactor). La biomasa inicial fue de 0,5-0,7 g l-1 con una presión de 1 bar. Los flujos de entrada y la salida estaban conectados a microfiltros durante todo el tiempo de cultivo a fin de mantener las condiciones de cultivo estériles. Dos condiciones de nitrato se estudiaron: La primera fue nombrada "experimento control con una concentración inicial de nitrato (NO3-) de 0,9 g l-1 y la segunda tenía la misma concentración inicial de nitrato pero se realizaron diferentes adicciones a las 29, 52, 76 y 99 horas de cultivo. Estos tiempos de adición se calcularon por medio de un modelo matemático que relaciona el aumento en biomasa con el consumo de nitrato (ver sección de Resultados y Discusión).


Figura 1. Fotobiorreactor tipo columna de burbujeo.

Las muestras del cultivo fueron tomadas diariamente en tubos de ensayo de 10 o 50 ml, luego centrifugadas a 4.000 rpm, 25 °C durante 10 minutos lo que generó dos fracciones: la biomasa precipitada se sometió a un proceso de liofilización y el sobrenadante se utilizó para determinar la concentración de exopolisacáridos. Después del proceso de liofilización esta fue pesada y se reporta en este trabajo como biomasa seca en (g l-1). La concentración de nitrato en el medio fue determinada por el método colorimétrico establecido por (Bastian et al., 1957). La calibración entre la absorbancia y la concentración de nitrógeno fue establecida usando sodio nitrato como estándar.

Para estimar la ficocianina se tomaron 0,1 g de biomasa seca, se sometieron a un proceso de disrupción celular por medio de un Tissuelyser a 50 Hz por 3 minutos. Seguidamente la biomasa se resuspendió en 4 mL de una solución buffer fosfato (0,15 M), se mantuvo a 4 °C por una hora y se agitó cada 30 minutos. Después de este procedimiento, esta solución fue nuevamente centrifugada a 4.000 rpm, 10 °C y 10 minutos, el sobrenadante azul fue colectado para posteriormente medir la absorbancia en una longitud de onda de 615 nm y 652 nm por medio de un espectrofotómetro. La concentración de ficocianina fue calculada con la ecuación 1 de acuerdo con el trabajo reportado por (Patel et al., 2005).

Los exopolisacáridos se determinaron espectrofotométricamente usando el análisis de antrona propuesto por (Laurentin and Edwards, 2003). Una solución de galactosa se usó como estándar de referencia. La Figura 2 muestra la placa microtituladora de 96 pocillos con diferentes concentraciones de galactosa (columna 1 a la 3) y varios sobrenadantes tratados con la solución de antrona (columna 4 a la 12).


Figura 2. Placa microtituladora con estándar y los sobrenadantes tratados con la solución de antrona.

Resultados y Discusión

Arthrospira platensis fue cultivada en dos condiciones diferentes de nitrato y la concentración de nitrato en el medio de cultivo se estimó por medio de las ecuaciones 2 y 3:

La ecuación 1 relaciona el rendimiento específico de consumo de nitrato Y n/x con la velocidad de formación de biomasa dx/dt. Esteúltimo término fue calculado usando un modelo cinético tipo Monod con la luz y el nitrato como factores limitantes.

La intensidad de la luz fue modelada con la ecuación (one-dimensional two-flux model) propuesta por (Cornet et al., 1992).

El modelo compuesto por las ecuaciones 1, 2 más la intensidad de luz (one-dimensional two-flux model) fueron simuladas simultáneamente en Matlab usando los parámetros y condiciones presentados en la Tabla 1. El propósito del modelo era predecir los tiempos adecuados para la adición de nitrato.

El modelo fue simulado en Matlab y los parámetros y condiciones usadas para la simulación se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1. Resumen de los parámetros y las condiciones usadas en la simulación del cultivo de Arthrospira platensis.

Los tiempos para las adiciones de nitrato se calcularon de acuerdo a las predicciones del instante en que la concentración de este estaría por debajo de 0,5 g l-1. En estos tiempos una solución concentrada de nitrato fue suministrada al fotobiorreactor a fin de obtener nuevamente la concentración inicial de 0,9 g l-1 (NO3-).

La Figura 3A muestra la biomasa en el experimento control y en el cultivo con adicción de nitrato por lotes. Dentro de las 50 a las 150 horas de cultivo, se encontraron concentraciones de biomasa mayores en el experimento control queen el experimento con adicción de nitratos. Sin embargo en el experimento control se encontró que después de 50 horas de cultivo el nitrato se había consumido completamente (ver Figura 3B). Los valores experimentales de nitrato y las predicciones del modelo propuesto (línea punteada o sólida) muestran una buena correlación.


Figura 3. A) Biomasa experimental en el ensayo control y en el ensayo de adición de nitratos por lotes. B) Nitrato experimental y simulado en el ensayo control y en el ensayo de adición de nitratos por lotes. Condiciones experimentales implementadas en la columna de burbujeo. 600 ^mol m-2 s-1, 1,4% de dióxido de carbono, 1 vvm, 30 °C, 0,9 g l-1 concentración inicial de NO3-.

Las bajas concentraciones de biomasa en el experimento con lotes alimentados se deben probablemente a las altas concentraciones de ficocianina. De acuerdo con Cornet et al., 1992, entre mayor es la fracción de ficocianina, mayor será la atenuación de la luz en el reactor. Esto generará una zona dentro del reactor donde posiblemente la intensidad de luz es más baja que la necesaria para llevar a cabo el proceso de fotosíntesis. En el experimento con adición de nitratos la concentración de ficocianina fue más alta que en el experimento control entre las 50 y las 250 horas de cultivo (ver Figura 4).


Figura 4. Fracción másica de ficocianina en el experimento control y en el de adición de nitratos por lotes. Condiciones experimentales implementadas en la columna de burbujeo. 600 pmol m-2 s-1, 1,4% de dióxido de carbono, 1 vvm, 30 °C, 0,9 g l-1 concentración inicial de NO3-.

En aplicaciones biotecnológicas la formación de producto es el principal objetivo. De acuerdo con la literatura, la fracción másica de ficocianina en A. platensis varían entre 20 a 200 mg g-1, con productividades en el rango de 10 a 125 mg l-1 d-1 (Chen et al., 2013; Xie et al., 2015). Con la adición de nitratos se esperaba que la fracción másica de ficocianina permaneciera constante; sin embargo, la concentración de ficocianina comenzó a decrecer después de la tercera adición (76 horas) (Figura 4), pero a una velocidad más baja que en el experimento control. Limitaciones en otros macronutrientes puede ser la razón de dicho decrecimiento. Aun así, las fracciones másicas de ficocianina fueron mejores cuando se comparan con el experimento control.

Estudios han reportado que durante limitaciones de nitrógeno, las cianobacterias consumen las reservas internas de nitrógeno a fin de prolongar su crecimiento. Por ejemplo, se han encontraron pérdidas en la ficocianina tan pronto todo el nitrato se había consumido. La ficocianina, que es una proteína, comienza a ser degradada y usada por la cianobacteria para sintetizar productos de almacenamiento de energía (ej. glicógeno). El tamaño de las células continúa incrementado pero estas no se reproducen más, lo que explica el continuo aumento en biomasa seca momentos después de la limitación (Cornet et al., 1992).

La producción de polisacáridos extracelulares por las cianobacterias se genera como respuesta a cambios en factores externos como nitrógeno o irradiación solar. La información en la literatura sobre el efecto del nitrato en la producción de exopolisacáridos es ambigua. Algunos investigadores han descrito la limitación de nitrógeno como positiva en la formación de exopolisacáridos, probablemente a que esta limitación incrementa la relación carbono/nitrógeno promoviendo con esto la incorporación de carbono en polímeros. Por el contrario, otros investigadores han mostrado que abundante nitrógeno es necesario para la síntesis de EPS, posiblemente debido a la baja energía requerida para la asimilación de nitrógeno comparada con la energía requerida para la fijación de este (Pereira et al., 2009). Además de esto, se ha reportado que la formación de exopolisacáridos puede ser el resultado del drenaje de energía que proviene de un sobreflujo de ATP en el metabolismo central (Cogne et al., 2003), debido a algunas de las situaciones mencionadas anteriormente (exceso o limitación de nitrógeno).

Con respecto a la formación de exopolisacáridos en este experimento (ver Figura 5), es importante resaltar que hasta las 100 horas de cultivo no se reportan datos, debido a que los valores de EPS se encuentran por debajo del valor mínimo de detección del método usado para estimar los exopolisacáridos. Sin embargo, el experimento con adición de nitratos muestra una mayor generación de EPS que el experimento control. En este ensayo la fracción másica de EPS (20 mg g-1de biomasa) permaneció estable durante todo el tiempo de cultivo, mientras que con las adiciones de nitrato se obtuvo un incremento de 25 mg g-1 a 50 mg g-1 hasta las 220 horas de cultivo. Después de este tiempo se tuvo incremento acelerado desde 50 mgg-1 a 120 mg g-1.


Figura 5. Fracción másica en el experimento control y en el experimento de nitratos de lote alimentado. Condiciones experimentales implementadas en la columna de burbujeo. 600 |jmol m-2 s-1, 1,4% de dióxido de carbono, 1 vvm, 30 °C, 0,9 g l-1 concentración inicial de NO3-.

Conclusiones

En el cultivo en lote de A. platensis, la producción de metabolitos es limitada o activada por el agotamiento de los sustratos requeridos. En cultivos con una alta intensidad de luz (600 |imol m-2 s-1), el rápido crecimiento de esta cianobacteria, genera un rápido agotamiento en el nitrato. Bajo estas condiciones de luz, el nitrato es completamente consumido a las 50 horas de cultivo provocando esto una degradación en la ficocianina. Con la implementación de una estrategia de alimentación de nitratos por lotes se logró aumentar la fracción másica de ficocianina a 30 mg gbiomasa-1 y la fracción másica de exopolisacáridos a 120 mg gbiomasa-1 cuando se compara con el experimento control.

Agradecimientos 

Los autores agradecen el apoyo financiero otorgado por COLCIENCIAS, Departamento Administrativo de Ciencia, Tecnología e Innovación de Colombia. Los autores declaran no presentar ningún conflicto de interés.

Literatura Citada

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Fecha de Recepción: 07 Marzo, 2017. Fecha de Aceptación: 11 Abril, 2017.

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