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Información tecnológica

versión On-line ISSN 0718-0764

Inf. tecnol. v.20 n.4 La Serena  2009

http://dx.doi.org/10.4067/S0718-07642009000400007 

Información Tecnológica Vol. 20 Nº4 2009, pág.: 51-61
doi:10.1612/inf.tecnol.4075it.08

QUÍMICA Y APLICACIONES

Modelado Molecular e Interacción Enzima-Ligando (Docking) de Antiinflamatorios Derivados de 4-Hidroxi 1,2-Benzotiazinas-3-Carboxamidas, 1,1-Dióxido

Molecular Modelling and Docking Studies of Antiinflammatory Derivatives of 4-Hydroxi, 1,2-Benzothiazine 1,1-Dioxide

Javier H. Gris, Martín A. Dragonetti, Beatriz M. Fernández y Albertina G. Moglioni
Universidad de Buenos Aires, Facultad de Farmacia y Bioquímica, Cátedra de Química Medicinal, Junín 956, (1113) Buenos Aires-Argentina
(e-mail: javierg@ffyb.uba.ar)


Resumen

Este trabajo tiene como objetivo visualizar por métodos computacionales, el modo de interacción de los oxicanes con la ciclooxigenasa, lo que llevaría a proponer un mecanismo de acción a nivel molecular, hasta el momento desconocido y reconocer los grupos funcionales indispensables para la acción analgésica y antiinflamatoria. Se exploró el espacio conformacional y se efectuó la interacción enzima-ligando (docking) de meloxicam, piroxicam, lornoxicam, normeloxicam y 4`meloxicam, utilizando el programa Flex X. Los oxicanes presentan un modo de unión a la ciclooxigenasa similar al de otros antiinflamatorios no esteroideos (AINEs), aunque con ciertas diferencias significativas. Se aprecia que modificaciones estructurales muy pequeñas determinan drásticas modificaciones en la selectividad por las isoformas ciclooxigenasa.

Palabras clave: ciclooxigenasa, oxicanes, meloxicam, modelado molecular, interacción enzima-ligando


Abstract

This work points to visualize by computer methods, the way of interaction of oxicanes with ciclooxygenasa, in order to propose a mechanism of action at molecular level, nowadays unknown, and to recognize the functional groups indispensable for analgesic and anti-inflammatory action. The conformacional space was explored and docking of meloxicam, piroxicam, lornoxicam, normeloxicam and 4`meloxicam was performed using the program Flex X. Oxicams present a mode of union to ciclooxigenasa similar to other nonsteroidal anti-inflammatory drugs (NSAID's), although they show certain significant differences. It is observed that very small structural modifications determine drastic modifications in the selectivity by ciclooxygenasa isoforms.

Keywords: cyclooxygenase, oxicams, meloxicam, molecular modelling, docking


INTRODUCCIÓN

Los antiinflamatorios no esteroideos (AINEs) constituyen uno de los grupos de medicamentos más prescriptos, con múltiples usos terapéuticos tanto en el tratamiento de dolencias musculoesqueléticas, como en otra amplia gama de indicaciones debido a sus efectos analgésicos, antipirético, antiinflamatorio y antiagregante plaquetario (Cronstein y Weissmann, 1995). Sin embargo, su uso se ve limitado por la posible aparición de efectos adversos, potencialmente letales, como puede ser la enfermedad ulcerosa péptica o la insuficiencia renal.

Tanto los efectos terapéuticos como su potencial toxicidad se deben a la inhibición de la enzima ciclooxigenasa (COX) y, en consecuencia, a la inhibición de prostaglandinas (PG) y tromboxanos. La enzima COX tiene dos zonas catalíticas: la ciclooxigenasa y la peroxidasa. Los AINEs inhiben la COX, pero no la actividad peroxidasa de la enzima. Se conocen al menos dos isoformas distintas de la ciclooxigenasa (también llamada prostaglandina H sintetasa): COX-1 y COX-2, las cuales son similares en un 60% y ambas catalizan la síntesis de PG a partir del ácido araquidónico. La diferencia más importante entre ellas, es su patrón de regulación y expresión tisular (Vane, 1971; Blobaum y Marnett, 2007).

La COX-1 o constitutiva, se expresa habitualmente en la mayoría de los tejidos; especialmente en las plaquetas, células endoteliales, tracto gastrointestinal, microvasculatura renal, glomérulo y túbulos colectores. Su expresión aumenta de dos a cuatro veces cuando se estimula y los glucocorticoides no la inhiben; es responsable de la regulación del flujo sanguíneo renal, excreción de sodio y de la protección de la mucosa gátrica (Abramson y Weissmann, 1989).

La COX-2 o inducible, es indetectable en la mayoría de los tejidos en situación basal. Sin embargo, con el desarrollo de los inhibidores selectivos se ha podido comprobar que la COX-2 participa no sólo en la mediación de la inflamación sino también en funciones reguladoras y otras circunstancias patológicas. Aparece en determinadas situaciones en riñón, cerebro (células endoteliales y neuronas corticales excitadoras), mucosa colónica en algunas neoplasias y osteoclastos. Aumenta entre diez y ochenta veces en presencia de citoquinas inflamatorias, factores de crecimiento o endotoxinas, a nivel de las células migratorias (monocitos y macrófagos), sinoviocitos, fibroblastos, células epiteliales o endoteliales y condrocitos. Debido a que se expresa en focos inflamatorios, se ha postulado que el desarrollo de AINEs con inhibición selectiva sobre la COX-2 podría conservar las propiedades antiinflamatorias de los AINEs, minimizando sus efectos adversos, en especial los gastrointestinales y renales (Jouzeau et al., 1997; Anzini et al., 2008).

La estructura tridimensional de la COX-1 y COX-2 humanas han sido determinadas por cristalografía de rayos X y los sitios activos de ambas isoenzimas han sido identificados utilizando cristales de complejos flurbiprofeno-enzima, indometacina-enzima (no selectivos), SC-558-enzima y celecoxib-enzima (selectivos hacia la COX-2), por lo que se conoce el modo de unión de estos AINEs y su mecanismo de acción (Kurumbail et al., 1996).

El sitio activo de la COX humana se encuentra en el exterior de la membrana citoplasmática y está constituido por un canal hidrofóbico largo y angosto, en el que se destaca un residuo de arginina (Arg120) que interacciona con el carboxilo de los AINEs tradicionales. En el extremo opuesto a la Arg120 hay un resto de tirosina (Tyr385) y un residuo de serina (Ser530), este último es acetilado por la aspirina y es lo que determina la inhibición irreversible de la COX (Blobaum y Marnett, 2007).

Para explicar la selectividad de los AINEs, parece crítica la presencia de un aminoácido clave en la posición 523 del sitio activo de ambas isoenzimas, concretamente la isoleucina para la COX-1 y la valina para la COX-2, esta última al tener menor volumen determina una abertura en la pared del canal del sitio activo de la COX-2 llamado bolsillo adicional o “pocket”, lo que permite el acceso a un lugar de acoplamiento de muchas estructuras selectivas como sulfonas o las sulfonamidas (Rowlinson et al., 2003).

Varias familias químicas de inhibidores selectivos de la COX-2 han sido descriptas en la literatura científica, tales como los diarilheterociclos, cuyo primer representante comercializado fue el celecoxib, el cual resultó 16 veces más selectivos hacia la COX-2; análogos de sulfonamidas acídicas, hoy llamadas clase de las sulidas o arilsulfonamidas y cuyo primer representante fue la nimesulida que resultó ser cuatro veces más selectivo por la COX-2 (Dannhardt  y Kiefer, 2001; Desiraju et al. 2000; Gonzalez et al., 2002).

Las enolcarboxamidas con actividad antiinflamatoria o también llamados oxicanes, constituyen una familia química de compuestos que desde el punto de vista farmacológico pertenecen al grupo de los  AINEs y estructuralmente se caracterizan por presentar un esqueleto de 4-hidroxi-1,2-benzotiazinas-3-carboxamidas 1,1-dióxido. Como grupo, los oxicanes se destacan del resto de los AINEs por su larga duración de acción (Lombardino et al., 1971, 1973; Lazer et al., 1997). El fármaco líder del grupo es el piroxicam (figura 1), el cual es un inhibidor no selectivo de la COX. No se conoce para el mismo la forma de unión a estas enzimas, dado que no ha sido posible obtener complejos cristalinos del mismo con la COX, para el estudio por difracción de rayos X. 

Por modificación molecular del piroxicam, se ha obtenido el meloxicam (figura 1), que resultó ser unas ocho veces más selectivo hacia la COX-2 y clínicamente demostró menos efectos colaterales a nivel gastrointestinal (Bianchi y Panerai, 2002). Para el meloxicam tampoco fue posible la formación de complejos con la COX, por lo que se desconoce su mecanismo de acción a nivel molecular, es decir cómo interacciona con la enzima.

Piroxicam

meloxicam

Fig. 1: Estructura química de los representantes más importantes de los oxicanes

En septiembre de 2004 el laboratorio Merck Sharp & Dome retiró del mercado mundial el producto rofecoxib, motivados en la necesidad de verificar si el fármaco contribuía al incremento de posibilidades de infarto del miocardio o accidente cerebrovascular (Tejer y Doval, 2004; Dogné et al., 2005). Posteriormente otros representantes de esta misma familia química fueron retirados del mercado farmacéutico por sus efectos colaterales, entre los cuales se encuentran el parecoxib, valdecoxib y lumiracoxib. Este hecho constituye un estímulo adicional en la búsqueda de nuevos analgésicos/antiinflamatorios con mejor perfil terapéutico; los oxicanes constituyen una familia ideal en esta búsqueda. Los escasos conocimientos de la relación estructura actividad en la familia química de los oxicanes, conducen a la necesidad de un estudio teórico previo a la síntesis de análogos del piroxicam, con mayor selectividad hacia la COX-2.

Este trabajo tiene como objetivo visualizar por métodos computacionales, el modo de interacción de los oxicanes con la COX-1 y la COX-2, lo que llevaría a proponer un mecanismo de acción a nivel molecular y reconocer para esta familia los grupos funcionales indispensables para la acción analgésica y antiinflamatoria. Esto permitirá el diseño de análogos de oxicanes con mayor selectividad hacia la COX-2 que posteriormente serán sintetizados y evaluados.

MATERIALES Y MÉTODOS

Se llevaron a cabo estudios de modelado molecular de todos los compuestos seleccionados para este estudio: piroxicam (inhibidor no selectivo), meloxicam, lornoxicam (análogo bioisostérico del piroxicam por reemplazo del anillo benceno por tiofeno), normeloxicam y 4’-meloxicam (Figura 2).



piroxicam 


meloxicam


4’-meloxicam 


 normeloxicam


lornoxicam

 Fig. 2: Estructura de los compuestos seleccionados para el estudio

El piroxicam es un AINE no selectivo de la COX, se lo eligió como prototipo de los inhibidores no selectivos, el meloxicam es un inhibidor selectivo de la COX-2 y fue elegido como prototipo de esta familia de compuestos. El normeloxicam y el 4'-meloxicam son inhibidores no selectivos de la COX y fueron elegidos para analizar la influencia que tiene el metilo de la posición 5 del sulfatiazol en la selectividad del meloxicam; lo que se puede observar es que si este grupo se elimina o bien se lo modifica a la posición 4'del tiazol se pierde la selectividad por la COX-2 (Pairet et al., 1998).

El lornoxicam es un inhibidor no selectivo de la COX, se incluyó en este estudio para evaluar la influencia del anillo benceno en la interacción con la enzima y los efectos del reemplazo de este anillo por otros equivalentes.

La estrategia de trabajo para realizar los estudios conformacionales fue la siguiente:

1.- Se efectuó un barrido del espacio conformacional mediante Dinámica Molecular, por el método de Mecánica Molecular MM+. Mediante esta técnica se simula el calentamiento del sistema a temperaturas superiores al cero absoluto, lo cual se mantiene durante un tiempo adecuado del orden de los picosegundos. La molécula sufre estiramientos y rotaciones a lo largo del proceso y de esta forma las barreras energéticas entre las distintas conformaciones de la molécula pueden superarse y es posible alcanzar el mínimo absoluto. Posteriormente se procede al enfriamiento de la molécula, donde la temperatura desciende lentamente y por lo tanto la energía potencial y cinética decaen y de esta manera la geometría caería en una zona próxima a un mínimo. Se efectuaron corridas de Dinámica Molecular de hasta 22 picosegundos, a temperaturas comprendidas entre 600 y 1500 ºK; con un paso de 0.005 picosegundos. Esto se repite hasta obtener suficientes conformaciones.

2.- Se optimizaron todas las conformaciones obtenidas mediante el método semiempírico Austin Model 1 (AM1); el cual fue elegido teniendo en cuenta los grupos funcionales presentes en la molécula como por ejemplo los grupos sulfóxido y carboxamido, ya que este método de cálculo presenta un mejor tratamiento de este tipo de funciones, de acuerdo a la experiencia obtenida con tabajos previos. Durante las optimizaciones se dejan completamente libres todos los parámetros geométricos. Se utilizó un algoritmo de minimización basado en gradientes conjugados (Polak Ribiere) y la optimización se continúa hasta convergencia de RMS del gradiente a 0.01 Kcal/Å Mol.

Los cálculos fueron realizados utilizando el programa Hyperchem®  para windows.

La siguiente ilustración muestra algunos conceptos del proceso de minimización. Para simplificar se muestra el proceso para una sola variable independiente y de esta manera poder representarlo en dos dimensiones.

En la figura 3, se observa que la geometría del modelo de partida determinará que mínimo será el que finalmente se alcance. Así por ejemplo, si se comienza en el punto (b), el mínimo que se alcanzará será el mínimo global (a). Sin embargo si se parte del punto (d) lo que se alcanzará será el mínimo local (f). Es posible que, si se indica  un valor del gradiente mínimo lo suficientemente grande, la minimización u optimización finalizará en el punto (e) y no en el (f). Esto se podrá controlar disminuyendo el valor del criterio de convergencia (gradiente de energía). Otro punto crítico se observa  en (c) ya que en un punto silla, también el valor de la derivada de la energía es igual a cero pero en este caso corresponde a la transición entre dos mínimos.

Fig. 3: representación del proceso de optimización

3.- Se efectuó el docking con la COX de las conformaciones de mínima energía de los compuestos en estudio, obtenidas en el proceso anterior; utilizando el programa de docking Flex X. Este programa permite predecir los potenciales modos de unión del ligando en el sitio activo de la enzima como así también las interacciones involucradas.   

En el análisis de las geometrías obtenidas, inicialmente se descartaron aquellas que presentaron una diferencia de calores de formación  (ΔHf) mayor a tres Kcal/mol respecto a la conformación de menor energía. De las conformaciones restantes, luego de efectuar mediciones de parámetros como longitudes, ángulos de enlace y ángulos diedros, se descartaron las conformaciones que resultaron idénticas.

De esta forma se determinaron para los distintos compuestos, las conformaciones de mínima energía y por lo tanto las más estables, las cuales fueron seleccionadas para realizar el docking con la COX.

El docking del meloxicam, piroxicam, lornoxicam, normeloxicam y 4`meloxicam fue llevado a cabo utilizando el programa FlexX versión 3.0.2 para Linux. Para todos los cálculos se utilizaron los parámetros estándar del programa, lo único que se definió como se menciona abajo es el radio para definir los residuos del sitio activo.

El sitio activo de la COX-1 y la COX-2 fue definido utilizando los datos cristalográficos del complejo COX-2/SC558 (PDB ID: 6COX) y COX-1/ibuprofeno (PDB ID: 1EQG) con un radio seleccionado de 8 Å. Todas las soluciones del docking con la COX-1 y la COX-2 fueron ordenadas de acuerdo a la función de scoring. Se obtuvieron RMS de 0.01, 0.06 y 0.02 para las mejores soluciones  de meloxicam, normeloxicam y 4`meloxicam. Finalmente, ploteados 2D de las soluciones seleccionadas fueron generadas utilizando el programa ligplot® (Figura 4). Por otro lado, los complejos 3D fueron visualizados y analizados utilizando el programa Flex V®. El índice de selectividad (IS= [CI50COX-1]/ CI50 COX-2]) para comparar el análisis teórico con los resultados experimentales, fueron obtenidos de la literatura (Pairet et al., 1998; Lazer et al. 1997).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Meloxicam

En el análisis de los complejos COX-1/meloxicam y COX-2/meloxicam se observó que se establecen interacciones hidrofóbicas entre los residuos adyacentes de ambos sitios activos y el grupo benceno del esqueleto de benzotiazina (Figuras 4 y 5).  Dos enlaces hidrógenos se establecen  entre el anillo tiazina y los residuos de serina (Ser530 -O13-) y valina (Val523 - O11- ) de la COX-2; mientras que un solo enlace hidrógeno se establece entre el anillo tiazina y un residuo de serina (Ser530-O13-)de la COX-1. En lo que respecta al anillo tiazol, se observó en ambos complejos la presencia de dos enlaces hidrógeno con el residuo de arginina (Arg120); pero el complejo COX-2/meloxicam mostró un enlace hidrógeno adicional con la tirosina (Tyr355) y una interacción hidrofóbica con la tirosina (Tyr355). El índice de selectividad para el meloxicam es de 13,1 (Pairet et al., 1998).

Fig. 4: Interacciones del meloxicam con la COX


Fig. 5: Interacciones del meloxicam con la COX-1

Piroxicam y lornoxicam

Como se trata de Aines no selectivos, en el caso de estos compuestos se procedió al docking sólo con la COX-1 que es el blanco principal de acción de estos compuestos. No se observan diferencias significativas en las interacciones observadas entre el meloxicam y la COX-1 respecto de estos compuestos. Se observan el mismo tipo de interacciones, es importante destacar que se trata de análogos estructurales, las diferencia entre piroxicam y lornoxicam es el reemplazo de un anillo benceno en el piroxicam por un anillo tiofeno, es decir es un reemplazo de anillos equivalentes y como era de esperar los compuestos resultantes de este tipo de reemplazo presentan el mismo tipo de actividad.

Normeloxicam

En el caso del análisis de los complejos COX-1/normeloxicam y COX-2/normeloxicam, se observaron las mismas interacciones hidrofóbicas entre los residuos adyacentes de ambos sitios activos y el anillo benceno del esqueleto de benzotiazina, que se indicaron para los complejos del meloxicam (Figuras 6 y 7). Un único enlace hidrógeno, entre la serina (Ser530 - O13-) y el anillo tiazina, se observó en ambos complejos del normeloxicam con la COX.  Respecto al grupo N-tiazol, en los complejos se observaron 2 enlaces hidrógeno con los residuos de Arginina (Arg120).

El valor de índice de selectividad para el normeloxicam, no se encontró en la literatura, sólo se reportó el %  de inhibición de COX-1 y COX-2, el cual resultó útil como un indicio de la selectividad para este compuesto (Lazer et al., 1997).

4`-meloxicam

En los complejos del 4'meloxicam con la COX-1 y COX-2, en ambos casos se observaron las mismas interacciones hidrofóbicas, descriptas en los casos anteriores, entre el anillo benceno y los residuos adyacentes del sitio activo (Figuras 8 y 9). Dos enlaces hidrógenos se observaron entre la porción del anillo tiazina y la COX-2, uno con el residuo de Serina (Ser530 -O13-) y otro con el residuo de valina (Val523 -O11-); mientras que en el complejo con la COX-1 sólo se observó un enlace hidrógeno con el residuo de serina (Ser.530). Respecto al grupo N-tiazolil, en ambos complejos se observaron dos enlaces hidrógeno, uno con el residuo de arginina (Arg120), pero en el complejo con la COX-2 se observó un enlace hidrógeno adicional con el residuo de tirosina (Tyr355).

l índice de selectividad experimental para el 4`-meloxicam es de 1.82 (Pairet et al., 1998).          

Fig. 6: Interacciones del normeloxicam con la COX-2


Fig. 7: Interacciones del normeloxicam con la COX-1


Fig. 8: Interacciones del 4' meloxicam con la COX-2


Fig. 9: Interacciones del 4’ meloxicam con la COX-1

CONCLUSIONES

Con el estudio de docking realizado con el meloxicam y sus análogos se puede establecer que:

1. El anillo benceno del esqueleto de benzotiazina contribuye a la estabilidad de los complejos con la COX. El mismo puede ser reemplazado por anillos con propiedades fisicoquímicas equivalentes, sin que se observen diferencias significativas en los complejos. Esto está en concordancia con los valores experimentales, ya que por ejemplo el lornoxicam presenta una actividad comparable con la del meloxicam.

2. El enlace hidrógeno adicional presente en los complejos del meloxicam con la COX-2, sería en parte responsable de la selectividad de esta molécula por la COX-2.  Por otro lado sólo el meloxicam presenta una interacción hidrofóbica adicional entre el residuo de Tyr 355 y  el grupo N-tiazolil. Siendo este residuo parte del bolsillo adicional o “pocket” presente en la COX-2,  esta interacción contribuiría a la selectividad del meloxicam por la COX-2. Esta observación se encuentra en concordancia con los valores experimentales expresados en forma de índice de selectividad. Es decir que el contacto hidrofóbico con la Tyr 355 sería el verdaderamente determinante de la selectividad presentada por el meloxicam.

3. A partir de este estudio realizado se puede concluir que los oxicanes presentan un modo de unión a la COX similar al de otros AINEs, aunque con ciertas diferencias significativas derivadas en primer lugar por la falta de un grupo ácido como es el grupo carboxilo. Se aprecia que modificaciones estructurales muy pequeñas determinan drásticas modificaciones en la selectividad por la COX. Se confirmó que el grupo 5`-metilo del anillo tiazol del meloxicam es el responsable de la selectividad de este compuesto por la COX-2. Y justamente es esta porción de la estructura de estos compuestos, la que se tiene que modificar para lograr análogos con mayor selectividad por la COX-2.

REFERENCIAS

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