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International Journal of Morphology

versión On-line ISSN 0717-9502

Int. J. Morphol. v.27 n.3 Temuco sep. 2009

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-95022009000300031 

Int. J. Morphol., 27(3):831-836, 2009.

 

Análisis Morfométrico del Efecto del Láser Infrarrojo sobre Hepatocitos de Rata

Morphometric Analisys of Infrared Laser Effect on Rat Hepatocyte

 

*Cornejo, R.; *Matamala, F.; *Silva, H. & **Garrido, O.

 

* Departamento de Ciencias Básicas. Facultad de Medicina. Universidad de La Frontera, Temuco, Chile.

** Instituto de Embriología, Universidad Austral de Chile, Valdivia, Chile.

Dirección para correspondencia:


RESUMEN: El láser infrarrojo emitido por el diodo Arsenurio de Galio (904 nm) proporciona terapia a lesiones articulares por su acción analgésica, cicatrizante y antiinflamatoria, promoviendo a nivel celular síntesis de ATP mitocondrial, modulación de canales de calcio, activando el proceso mitótico e incremento en la síntesis de DNA y de proteínas. Para determinar las dosis que estimulen componentes celulares involucrados en síntesis proteica, del hígado de ratas fueron tomadas muestras de tejido normal e irradiado mediante láser infrarrojo con 1, 2, 4, 8 y 16 Joules/cm2 durante 15 días consecutivos. Fueron tratadas para microscopía electrónica de transmisión y se obtuvieron micrografías con aumentos de 10.000 X. Se realizaron estudios morfométricos, cuantificándose las fracciones volumétricas de núcleos, citoplasma, retículo endoplasmático rugoso (RER), inclusiones de glicógeno, nucleolos, eucromatina y heterocromatina, relación núcleo- citoplasmática y las áreas celulares y nucleares. Los resultados del presente estudio que compara hepatocitos normales e irradiados, indican que existen diferencias significativas en todos los parámetros evaluados. Se concluye que los hepatocitos estimulados alteran su morfología y por ende sus componentes celulares, modificando la función celular determinándose con exactitud la dosis de estimulación infrarroja donde estas células presentan un mayor desarrollo de su maquinaria citoplasmática involucrada en síntesis de proteínas.

PALABRAS CLAVE: Hepatocitos; Láser; Morfometría; Ultraestructura.

 


SUMMARY: The infrared lasser emitted by the Gallium Arsenide diode provides an adequate therapy for articular lessions due to their healing, analgesic, and anti-inflammatory powers. It also promotes at cellular level mitochondrial ATP synthesis, modulates Calcium channels and activate mitotic processes by increasing DNA and protein synthesis. To determine the effective doses which stimulates rat liver protein synthesis, several samples from normal and irradiated tissues to intensities of 1, 2, 4, 8, and 16 Joules/cm2 by 15 consecutive days were taken. These samples were later prepared and observed under transmission E.M. (10000X) and analyzed by morphometric studies, where volume and organelle distribution, such as nucleus, cytoplasm, endoplasmic reticulum, glycogen inclussions, nucleolus, eu and heterochromatin were accounted, together at nuclear-cytoplasmic relationships and the cellular and nuclear areas. Under comparison normal and irradiated hepatocytes presented a significative difference in all evaluated parameters. It can be concluded that at certain specific level of infrared irradiation, hepatocytes alter their morphology by modifyng those cellular components involved in protein síntesis.

KEY WORDS: Hepatocytes; Laser; Morphometry; Ultrastructure.


INTRODUCCIÓN

La utilización del láser infrarrojo corresponde tanto a una óptima terapia en el tratamiento articular consiguiendo un efecto analgésico (Kim & Lee, 1992), cicatrizante y antiinflamatorio exitoso (Pinheiro et al., 1988; Lilge et al., 2000), como a nivel celular induciendo una acentuada síntesis de ATP (Olson et al., 1981; Manteifel et al., 1999) induciendo proliferación celular (Breitbart et al., 1996) como así mismo, variaciones en el metabolismo del colágeno (Gómez Villamandos et al., 1995; Pereira et al., 2002), incremento en las concentraciones de calcio citoplasmático (Breitbart et al.) y síntesis de DNA (Loevschall, 1994).

Con el objetivo de precisar el rol ejercido por las emisiones del láser infrarrojo y describir las respuestas celulares a nivel ultraestructural, se estableció un sistema biológico susceptible de ser estimulado con esta energía y determinar un patrón de comparación entre hepatocitos de rata normales versus aquellos estimulados con intensidades crecientes de: 1, 2, 4, 8 y 16 Joules/cm2 por espacio de 15 días consecutivos y cuantificándose las variaciones morfológicas y morfométricas resultantes.

Considerando que el estudio de la Biología Celular muestra que, en medida que las células son estimuladas, sus componentes sufren modificaciones cualitativas, cuantitativas y topográficas, el análisis de micrografías electrónicas revelará como la particularidad de los distintos componentes se traducen en función celular. Las modificaciones en los aspectos morfológicos y morfométricos permitirán evaluar y comparar células normales y estimuladas, determinando el patrón de modificación ultraestructural que caracteriza la estimulación por radiación, en este modelo biológico (Junqueira & Salles, 1975).

MATERIAL Y MÉTODO

Microscopía Electrónica de Transmisión. A partir del hígado de 18 ratas Sprague-Dawley se obtuvieron muestras de tejido normal e irradiado con dosis de láser infrarrojo equivalente a 1, 2, 4, 8 y 16 J/cm2 por espacio de 15 días. A ellas se le adicionó solución de glutaraldehído 2%, en tampón fosfato 0,15 M, pH 7,2, y se mantuvo a temperatura ambiente por 2 horas. Posteriormente, fue sometido a un lavado en solución de 6 g de NaCl y 73 g de sacarosa, disueltos en 1 litro de agua destilada.

La post-fijación se realizó en solución de tetróxido de osmio 1%, disuelto en la solución de lavado antes descrita durante una hora a 40 C y acetato de uranilo 0,5%, por 18 horas. Luego de lavado el material fue deshidratado en concentraciones crecientes de acetona (30 a 100%) e incluido en Araldita 6005. Se obtuvieron cortes ultrafinos de aproximadamente 70 nm de grosor los que fueron tratados con acetato de uranilo 2%, durante 40 minutos y citrato de plomo 0,5%, por 10 minutos. Las muestras fueron estudiadas y fotografiadas en un microscopio electrónico Phillips EM 300.

Método Estereológico. A partir de los bloques para microscopía electrónica, fueron obtenidos cortes ultrafinos, en los cuales se micrografiaron cada uno de los tipos celulares con un aumento de 10.00 X.

Para la evaluación de las fracciones volumétricas de los componentes celulares, fue sobrepuesto un retículo de puntos en las micrografías electrónicas y se procedió al conteo diferencial de los puntos que incidían sobre los perfiles de los componentes, calculándose la fracción volumétrica que ellos ocupan, mediante la siguiente ecuación (Weibel, 1969):

 

Fv = Fracción volumétrica del componente celular.
PA = Puntos incidentes sobre el componente en estudio.
Pt = Puntos totales incidentes en la célula estudiada.

RESULTADOS

Las estimulaciones con láser infrarrojo sobre hepatocitos con dosis correspondiente a: 1, 2, 4, 8 y 16 Joules/cm2 en comparación con células controles, generan los siguientes datos morfométricos-ultraestructurales:

Existe una clara y constante relación entre dosis crecientes de láser infrarrojo asociado con un sostenido aumento en el área celular y paralelamente una disminución sostenida del área nuclear (Figs. 1, 2 y 3).

Fig. 1. Micrografía electrónica de hepatocito de rata normal- control. 10.000X.

Fig. 2. Micrografía electrónica de hepatocito de rata irradiado con 4 J/cm2. 10.000X.

Fig. 3. Micrografía electrónica de hepatocito de rata irradiado con 8 J/cm2. 10.000X.

Es observable que los hepatocitos irradiados con dosis correspondiente a 4 y 8 J/cm2 presentan fracciones volumétricas de componentes celulares en porcentaje adecuado para realizar una activa función celular, básicamente los relacionados con síntesis proteica. Paralelamente se observa una reducción notoria en relación a las inclusiones de glicógeno en estas células de alto metabolismo (Fig. 4).

Fig. 4. Fracciones volumétricas (%) de R.E.R., mitocondrias y glicógeno evaluados en
hepatocitos de ratanormales e irradiados con láser infrarrojo de 4 y 8 Joules/cm2.

 

Las estimulaciones con dosis elevadas de 16 J/cm2, generan una disminución en las respectivas fracciones volumétricas de los componentes celulares involucrados en síntesis proteica (RER y mitocondrias ).

En lo relativo a la eucromatina, las fracciones volumétricas evaluadas en hepatocitos irradiados con 8 J/cm2 corresponden a 90%, el mayor volumen evaluado con las dosis señaladas, muy superior a la cuantificada en hepatocitos normales, indicando una elevada expresión génica producto de las estimulaciones (Fig. 5).

Fig. 5. Fracciones volumétricas (%) correspondientes a tipo de cromatinas evaluadas en hepatocitos de rata
normales e irradiados con dosis de láser infrarrojo correspondiente a 4 y 8 Joules/cm2.

Finalmente, el volumen ocupado por el nucleolo disminuye sutilmente producto de las estimulaciones infrarrojas respecto al evaluado en el hepatocito normal.

 

Discusión

Existen escasas evidencias experimentales respecto al comportamiento de hepatocitos irradiados con láser infrarrojo o de baja intensidad y, mas aún, estas comunicaciones emitidas son antagónicas en lo relativo a la cantidad de energía empleada en la estimulación utilizada.

En este contexto, nuestros resultados son disímiles en cuanto a la energía utilizada puesto que Greco et al. (1996, 2001) y Vacca et al. (1997) utilizan 0.24 J/cm2 como energía activadora sobre hepatocitos probando grandes modificaciones de la función celular producto de dicha estimulación.

Sin embargo, en este mismo contexto, hemos constatado referencias coincidente en relación a la cantidad de energía utilizada en nuestro trabajo constatando que Vacca et al. (1993) y Streeter (2004) demuestran variaciones en la actividad celular utilizando dosis de 5 y 8 J/cm2 respectivamente en sus experimentos.

En las citadas referencias como en los resultados obtenidos en nuestro estudio, aparece claramente establecido que las estimulaciones con láser infrarrojo provocan modificaciones morfológicas y morfométricas en los hepatocitos y que, por ende, inducen una modificación severa de la función celular de las células irradiadas activando determinados mecanismos. Así, Vacca et al. (1993) comprueban activación en la replicación de DNA mitocondrial; Cieslar et al. (1995) determinaron un notable incremento en las actividades enzimá-ticas tanto de membranas plasmáticas como mitocondriales. Vacca et al. (1997) comunicaron que la irradiaciones infra-rrojas generan aumentos considerables del calcio citoplasmático libre en relación con el potencial de membrana plasmática; del mismo modo, Greco et al. (2001) precisaron que la estimulación con esta energía produce incremento en la concentración de calcio mitocondrial generando de este modo una hiperpolarización de membrana del organelo generador de energía.

Los hepatocitos pertenecen a células ubicadas en el rango de una alta actividad metabólica caracterizadas por una síntesis proteica elevada. Nuestro estudio, como ya fue descrito, estuvo centrado en determinar las variaciones provocadas por la estimulación con láser infrarrojo sobre componentes celulares involucrados en dicha síntesis y en este contexto, nuestros resultados mostraron alto desarrollo del RER, mitocondrias, activa depletación del glicógeno, alto porcentaje de eucromatina, y aumento en el área celular describen una acentuada activación del mecanismo traduccional y por tanto, son coincidentes con los descritos por Greco et al. (1996) quienes observaron una acentuada síntesis proteica tanto citoplasmática como mitocon-drial como resultado de estimu-laciones infrarrojas.

Del mismo modo, Kao & Sheen (2003), demuestran que hepatocitos irradiados con esta energía muestran en un apreciable aumento tanto en la síntesis de proteínas, como en la actividad de enzimas citosólicas. Finalmente, Streeter precisa que en medida que los hepatocitos son irradiados con 8 J/cm2 (dosis semejante a la utilizada en este estudio) responden con un incremento sostenido en síntesis de albúmina de sobre 115% con respecto a los hepatocitos no irradiados.

Los resultados del estudio morfológico y morfométrico realizado apuntan al hecho que la irradiación con láser infrarrojo en dosis entre 4 y 8 J/cm2 sobre hepatocitos de rata induce un notable cambio en la expresión génica asociada con un nuevo estado de diferenciación celular en el cual estructuras y componentes celulares involucrados en síntesis proteica de hepatocitos de rata están en máximo desarrollo, mostrando de manera indiscutible los efectos positivos de la irradiación con láser infrarrojo sobre la funcionalidad celular en este sistema biológico se estimula con la dosis infrarroja adecuada.

El análisis de nuestros resultados muestra que las estimulaciones con láser infrarrojo en este tipo celular generan un aumento sostenido en el área celular debido tal vez a un incremento en la tasa de incorporación tanto de nutrientes como fundamentalmente en la neogénesis de componentes celulares. Concomitantemente, se observa disminución sostenida de las áreas nucleares situación que determinan cambios tanto en la morfología como en la ultraestructura y funcionalidad de los hepatocitos de rata irradiados.

En este mismo contexto, se observaque las dosis de láser infrarrojo con las cuales los hepatocitos presentan un mayor desarrollo de componentes celulares, básicamente los involucrados en síntesis proteica, RER y mitocondrias, corresponden a las que se sitúan entre 4 y 8 J/cm2. Paralelamente, es necesario considerar que los volúmenes de glicógeno disminuyen con las dosis crecientes de láser indicando una constante degradación a glucosas citoplasmáticas para realizar procesos de glicólisis y posterior síntesis de ATP mitocondrial.

Más aún, entre estas dosis, las fracciones volumétricas de eucromatina son los de mayor valor (90%), indicando que la expresión génica y la eventual síntesis proteica es alta respecto al hepatocito normal.

El estudio cumple el objetivo central definiendo con claridad que las dosis de emisiones infrarrojas para una terapia con láser de baja potencia corresponde a estimulaciones entre 4 y 8 J/cm2 y que, por el contrario, dosis mayores como 16 J/cm2 generan disminución de constituyentes citoplasmáticos en procesos semejantes a los de involución celular, en este sistema biológico.

Agradecimientos

Este trabajo es resultado de las actividades de investigación realizadas en el proyecto DIUFRO 08-0022.

 

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Dirección para correspondencia:

Prof. Dr. Ricardo Cornejo Uribe
Departamento de Ciencias Básicas. Facultad de Medicina
Universidad de La Frontera
Casilla 54-D, Temuco
CHILE

Email: rcornejo@ufro.cl

Recibido : 12-03-2009
Aceptado: 27-07-2009