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Parasitología latinoamericana

versão On-line ISSN 0717-7712

Parasitol. latinoam. v.63 n.1-2-3-4 Santiago dez. 2008

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-77122008000100005 

Parasitol Latinoam 63: 29 -33, 2008 FLAP

ARTICULO ORIGINAL

Evaluación de una prueba rápida para el diagnóstico de la infección por Trypanosoma cruzi en suero

EVALUATION OF A RAPID DIAGNOSIS TEST FOR Trypanosoma cruzi INFECTION IN SERUM SAMPLE

 

MYRIAM LORCA*,**, MARÍA DEL CARMEN CONTRERAS*, PATRICIA SALINAS*. ALICIA GUERRA* y SYAMAL RAYCHAUDHURI***

* Unidad Docente de Parasitología Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Santiago, Chile.
** Laboratorio Campvs. Santiago, Chile.
*** Inbios International Seattle Wa. USA.

Correspondencia a :


RESUMEN

Con el fin de evaluar la utilidad práctica, y la sensibilidad y especificidad del test rápido Dipstick test Trypanosoma cruzi Detect, (Inbios, Seattle, WA) se estudiaron 284 sueros humanos de los cuales 145 correspondieron a casos probados de infección chagásica y 139 a individuos sanos de zonas no endémicas. Todos ellos analizados previamente con las Técnicas de ELISA y de Inmunofluorescencia Indirecta para la detección de anticuerpos IgG anti T. cruzi. Además se estudiaron 56 muestras serologicamente negativas para enfermedad de Chagas pero que presentan otras patologías parasitarias y no parasitarias. El "test" rápido de INBIOS demostró una especificidad de 99,3% al igual que la sensibilidad. Y una concordancia con La ELISA y la RIFI de de 98,2%. De acuerdo a estos resultados y a la facilidad de su ejecución, Dipstick test T. cruzi Detect (INBIOS) resulta ideal como tamiz para la vigilancia y los programas de intervención de la enfermedad de Chagas.


We tested a Rapid Diagnostic Test (RDT) to detect Trypanosoma cruzi infection using a total of 284 human sera, some of them from provedcases ofChagas disease (n = 145) and healthy individuals from non-endemic areas (n = 139). Another group included was non chagasic serum samples of individuals of other parasitic and non parasitic disease (n = 56), all of them with known serological test results. The RDT had a specificity of 99,3% and a sensitivity of 99,3%. The agreement with ELISA and IFAT was 98,2%. According to the results and the feasibility of the RDT should be an ideal tool for screening purposes in disease surveillance and intervention programs ofChagas disease.

Key words: Chagas disease, rapid diagnostic test, Trypanosoma cruzi.


 

INTRODUCCIÓN

La enfermedad de Chagas o Trypanosomiasis americana es producida por el protozoo hemoflagelado Trypanosoma cruzi, que infecta a cerca de 16 millones de personas en América Latina1. Además, debido a los efectos de la globalización y al aumento de los viajes y la inmigración desde los países centro y Sudamérica al resto del mundo, la infección se ha difundido en USA, Canadá y Europa2.

Esta zoonosis parasitaria posee diversos mecanismos de infección, la más importante es la vectorial, a continuación la transmisión sanguínea, la transmisión transplacentaria, el trasplante de órganos y actualmente se han descrito algunos brotes epidémicos de infección vía oral14.

La utilidad de los métodos diagnósticos depende de la fase de la infección. En la fase aguda, cursa con altas parasitemias y los métodos diagnósticos directos son los más útiles y frecuentes de usar. Con posterioridad en la fase crónica, el diagnóstico está basado en la detección de anticuerpos por métodos serológicos5.

El diagnóstico serológico está basado en la detección de anticuerpos circulantes mediante reacciones convencionales tales como, la Reacción de Inmunofluorescencia Indirecta (RIFI), la Reacción de Enzyme Linked Immu-nosorbent Assay (ELISA) y Reacción de Hemaglutinación Indirecta (RHAI). La OMS inicialmente recomendó el empleo para el diagnostico rutinario de al menos dos pruebas serológicas de distinto fundamento. Posteriormente, ha recomendado la utilización de la prueba de ELISA como "screening" y su posterior confirmación con alguna reacción serológica de diferente fundamento técnico6.

El diagnóstico serológico se realiza generalmente a través de reactivos comerciales que incorporan mezclas de complejos antigénicos citoplásmaticos (ELISA y RHAI) o al parásito propiamente tal como es el caso de la RIFI. Estos reactivos comerciales, en algunos casos incrementa la sensibilidad pero disminuyen la especificidad debido a reacciones cruzadas con otras infecciones como leishmaniosis6. Mas aún todas estas pruebas tienen problemas relacionados con su manejo técnico, cadena de frío, equipos etc lo cual los restringe a laboratorios especializados.

Todos los países que están afectados por la trypanosomiasis americana necesitan efectuar "screenings" poblacionales frecuentes con diversos objetivo; seleccionar donantes seronegativos, seleccionar embarazadas y niños menores de 15 para tratamiento médico, pero las técnicas convencionales no siempre ofrecen las facilidades técnicas ni de infraestructura como para aplicarlas en el campo. Ello ha demostrado la necesidad de un cambio de estrategia en el diagnóstico serológico de la infección por T. cruzi, la cual puede ser abordada mediante la prueba de diagnostico rápida (RDT) asegurando el diagnóstico y efectividad del mismo en el campo7.

Las pruebas de diagnóstico rápido (RDTs), son relativamente fáciles de realizar, emplean cantidades mínimas de muestra, no demoran más de 10 minutos, su manipulación es fácil y por lo mismo requieren de personal entrenado para efectuarlos sin contratiempos en terreno careciendo de las facilidades de laboratorio810.

Muchos de los RDTs, no requieren refrigeración ni tampoco necesidad de luz eléctrica, por lo tanto un test bien validado ofrece potenciales gigantescos para los diagnósticos de screening de la infección por T. cruzi.

En este trabajo presentaremos los resultados obtenidos con una prueba rápida para enfermedad de Chagas RDT (Trypanosoma Detect™, INBIOS International, Seattle, USA) en comparación con ELISA y RIFI en muestras de suero de individuos con infección por T.cruzi y en individuos no infectados (Sanos y con otras infecciones parasitarias y no parasitarias ).

MATERIAL Y MÉTODOS

Se estudiaron un total de 350 muestras de suero de las cuales : 155 correspondieron a sueros de individuos con infección chagásica demostrada, 139 a individuos no infectados y 56 a individuos no chagásicos con otras patologías no parasitarias y parasitarias.

Todas las muestras fueron estudiadas por ELISA y RIFI para infección por T. cruzi.

Las muestras fueron sometidas a análisis con el Kit. INBIOS de acuerdo a las instrucciones del productor. Los estudios se realizaron en doble ciego.

El test rápido (RDT): Dipstick test T. cruzi Detect, (Inbios, Seattle, WA) se efectuó de acuerdo a las instrucciones de la empresa manufacturadota. La prueba está basada en un antígeno recombinante multiepitope mezclado con una solución de oro. El antígeno recombinante incluía las moléculas ITC-6 e ITC-8.2 derivados de diferentes antigenos de T. cruzi, incluyendo los péptidos 2, TcD, TcF, TcLo, y SAPA11,12.

Diez a 20 ul. de suero fueron dispuestos sobre la tira del "dipstick" y posteriormente se agregaron 3 gotas de la solución buffer reveladora, provista en el Kit. Después de 10 minutos se observó la línea de control rojo. Si el resultado fue positivo apareció una segunda línea por debajo del control en el campo donde se ubicó el antígeno.

La prueba de ELISA se realizó de acuerdo a trabajos previos13. En resumen, se sensibilizaron pocilios de poliestireno con un extracto crudo de formas epimastigotes de Tcruzi a una concentración de 2 ug /mi. Las placas posteriormente fueron bloqueadas con solución de buffer con leche descremada al 5%, lavadas y congeladas hasta el momento de su empleo13.

La prueba RIFI: realizada de acuerdo a la metodología estandarizada14 modificada en nuestro laboratorio5. Se uso formas epimastigotes de cultivo Diamond formalizadas y adheridas a portaobjeto previamente enmarcados. Se efectuó la dilución del suero (1/20) y se incubó por 45 minutos a 37° C. Posteriormente se sometió a intensos lavados con Buffer fosfato Ph 7,2, seguido por un proceso de secado e incubación por 45 minutos a 37 °C, con el segundo anticuerpo conformado por anti IgG humana marcada con isotiocianato de fluoresceína mas azul de Evans como contracolorante. Las laminas posteriormente fueron lavadas y leídas al microscopio de luz UV (Olympus PS -2DC con lámpara de halógeno de 12 volts) con aumento de 40X.

RESULTADOS

Con el fin de evaluar la utilidad del RDT (Dipstick test). Se extrajo la sangre para los exámenes serológicos, previo consentimiento informado del paciente y se guardo en condiciones de -20 C hasta su empleo. Posteriormente, se procedió a realizar las técnicas serológicas convencionales analizando las muestras al azar. y sin conocer los resultados de ELISA ni PJFI.

En la Tabla 1 se muestra la concordancia de 98,2% en los resultados (279/284). La concordancia de los resultados en las muestras positivas alcanzó a un 97,4% y en las muestras negativas de 98,9%.


De acuerdo a estos resultados el reactivo INBIOS tuvo una sensibilidad de 99,3% con 0,01% de falsos positivos sobre el total de casos estudiados y una especificidad de 99,3% con un total de 0,7 de falsos negativos sobre el total de muestras. El estudio fue practicado en doble ciego, primero se estudiaron muestras de suero analizadas previamente con ELISA e IFAT y a continuación con el RDT (Dipstick test).

repetidos con la serologia convencional el resultado fue positivo, mostrando una correlación total en las muestras positivas con una concordancia de 100%. Pero se mantuvieron los resultados en 3 casos falsos negativos.

En la Tabla 3 se observa que no existe reactividad cruzada en los resultados mostrados por el Dipstick y la serología convencional.

DISCUSIÓN

Los distintos problemas diagnósticos existentes en la infección por T. cruzv han obligado a los investigadores a dos acciones fundamentales, en primer lugar mejorar la calidad de los antígenos empleando moléculas recombinantes o péptidos sintéticos en mezclas alternativas a los antígenos convencionales61314. Por otra parte, los soportes de las reacciones se han mejorado de tal forma que se ha incrementado la sensibilidad y especificidad de los mismos6,8,10.


Pero además se ha agregado un tercer componente a las necesidades diagnósticas y es la rapidez y facilidad necesaria especialmente para el trabajo de campo. Esa es la alternativa que evaluamos en el presente trabajo, la "utilidad de una prueba rápida frente a pruebas convencionales" lo que podría ser de gran ayuda para el trabajo de campo y estudios poblacionales17. El análisis del reactivo empleando muestra de suero demostró una concordancia de resultados entre INBIOS y la serología convencional de 98,2% (279/284)11. La especificidad de la prueba en estas muestras alcanzó a 99,3%. (Tabla 2). Inicialmente se encontraron dos falsos positivos (0,07%), pero al repetirlas mediante serología convencional los resultados fueron positivos, mostrando total concordancia (Tabla 2), lo cual nos induciría a pensar que la especificidad real alcanza a 100%. Hecho corroborado también en la Tabla 3, donde no se observó reactividad cruzada donde la técnica presentó una optima especificidad tanto en los sueros no chagásicos normales como también aquellos testeados para reacción cruzada como factor reumatoide, TBC, toxoplasmosis.

Desde el punto de la sensibilidad, esta alcanzo a 99,3% con un 0,01% de falsos resultados negativos. Los cuales al ser repetidos demostraron concordancia con ELISA no así con RIFI que presento títulos "borderline", lo cual nos podría hacer pensar que los pacientes presentan serología discordante incluso en las pruebas convencionales. De acuerdo a los estudios de6, usualmente existe entre dos o más reactivos discordancias cercanas a 2% de la muestra. Debemos resaltar que la propuesta es su empleo para trabajo de campo donde se propone solo el tamizaje pero la confirmación debe hacerse por los métodos convencionales, lo cual haría al reactivo INBIOS muy buen test rápido para el diagnóstico.

Por otra parte, el Dipstick tuvo una muy buena concordancia con la serología convencional RIFI y ELISA. La prueba es fácil de realizar, y requiere pequeñas muestra de suero.

Este tipo de prueba rápida para el diagnóstico de la enfermedad de Chagas tiene muchas ventajas sobre las pruebas convencionales, debido en primer lugar a su aplicación en un gran numero de muestras, las cuales son procesadas sencilla y rápidamente, con mínimos esfuerzos.

En segundo lugar al compararlo con la serología convencional, los métodos de diagnóstico molecular y otros métodos de diagnóstico se requiere experiencia técnica, entrenamiento y personal calificado, el dipstick es una prueba que además no requiere de un laboratorio especializado. Por último desde un punto de vista epidemiológico esta prueba permite su aplicación en intervenciones epidemiológicas in situ, tales como la vigilancia

serológica, detección de poblaciones chagásicas para tratamiento. Reduciendo los costos operacionales de los programas y obteniendo una herramienta de "screening" económica.

REFERENCIAS

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Correspondencia a: Myriam Lorca
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