Parasitol Latinoam 62: 16 - 22, 2007 FLAP

ARTICULO ORIGINAL

Avaligao da Vitamina E como imunomodulador e infecgao intrauterina por Theileria equi empotro

EVALUATION OF VITAMIN E AS IMMUNOMODULATION AND INTRAUTERINE INFECTION OF Theileria equi in FOALS

CRISTIANA PORTZ*, F. Q. ALMEIDA**, CARLOS L. MASSARD** e PAULO de F. L. BOTTEON**

* Mestre em Ciencias Veterinárias-Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro (JJFRRJ). Rúa Helia Horn, 113.CEP: 95880-000-Cristo Rei-Estrela-RS-Brasil.
** Professor-Instituto de Veterinária-UFRRJ.

Correspondencia a :

RESUMO

Doze éguas gestantes das ragas Mangalarga Marchador e Bretao Postier foram distribuidas em 3 grupos onde, o primeiro destinou-se ao controle e os demais ao desafio. Quatro éguas Mangalarga Marchador e quatro Bretao Postier foram suplementadas com 80 mg/100 kg de peso vivo/ dia durante trinta dias pré-parto. A proteína total do colostro foi analisada pelo método de Micro-Kjeldahl e a IgG foi estimada através da concentracáo proteica. Amostras de soro dos potros foram analisadas pelo método de ELISA indireto para Theileria equi. A suplementacáo com essa quantidade de vitamina E nao foi suficiente para estimular a síntese de IgG em éguas gestantes. O parto foi assistido e esfregacos de sangue dos potros foram confeccionados, antes da amamentacáo. Seis esfregacos sanguíneos de potros Mangalarga Marchador foram positivos para Theileria equi, antes da amamentacáo sugerindo infeccao intrauterina. Esses potros desenvolveram babesiose assintomática sem sinais clínicos evidentes devido a presenca de anticorpos passivos.

Twelve pregnant mares of Mangalarga Marchador and Bretdo Postier breeds were distributed in three groups where the first one was the control and the others were destined to the challenge. Four Mangalarga Marchador and four Bretdo Postier mares were supplemented with 80mg vitamin E/ lOOKg body weight/day during thirty days until parturation. Total colostrum protein was analysed using Micro-Kjeldahl method and immunoglbulin G was estimated through protein concentration. Serum samples were analysed for specific immunoglobulin G to Theileria equi using enzyme-linked immunosorbent assay method (ELISA). Parturation were assisted and blood smears were done from twelve foals, before suckling. Supplementation with 80 mg vitamin E/lOOKg body weight /day wasn't sufficient to stimulate IgG synthesis in pregnant mares. Six blood smears from Mangalarga Marchador foals were positive to Theileria equi suggesting intrauterine infeccious. These foals developed assimptomatic babesiosis without any clinical sings because the presence of passive antibodies.

Key words: vitamin E, equines, babesiosis, imunomodulation. Theileria equi.

INTRODUQAO

A América do Sul e Central sao consideradas altamente endémicas para a babesiose equina mantendo um rígido controle sanitario de fronteira, impedindo a entrada de animáis soropositivos. O plantel equino da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro apresenta-se endémico para as duas especies causadoras de babesiose devido a constante reinfeccao através dos carrapatos vetores¹. Os animáis infectados por Theileria equi tornam-se geralmente portadores crónicos e fontes de infecgao por longos períodos².

A vitamina E (a-tocoferol) age como protetor de membrana celular, antioxidante biológico, evita danos em fibras musculares cardíacas e esqueléticas, tendo atividade na coagulacao sanguínea, transporte de elétrons, protecao do organismo contra metáis pesados, possuindo ainda mecanismo modulador da resposta imune dos animáis, protegendo os leucocitos e macrófagos durante a fagocitose³. O uso de imunomoduladores promove um fortalecimento do organismo, já que os medicamentos utilizados atualmente nao negativam equinos portadores de T. equi, localizados em regioes onde há presenca dos carrapatos vetores e susceptiveis a reinfeccoes. A suplementacao de éguas gestantes com vitamina E, pode resultar em aumento da concentracao de IgG sérico e transporte passivo aos potros⁴.

Devido aos novos conhecimentos em nutricao equina e a pouca informacao sobre o uso de imunomoduladores, este trabalho objetivou o estudo da suplementacao dietética com vitamina E, de éguas gestantes portadoras de babesiose avallando anticorpos específicos para T. equi nos soros sanguíneos dos seus respectivos potros, assim como a preparacao de esfregacos sanguíneos, antes da amamentacao.

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento realizou-se na Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, Seropédica-RJ (UFRRJ), utilizando éguas gestantes das ragas Mangalarga Marchador e Bretao Postier do Setor de Eqüinocultura do Instituto de Zootecnia, no período de agosto de 2001 a julho de 2002. Foram utilizadas oito éguas da raga Mangalarga Marchador e quatro éguas da raga Bretao Postier, identificadas em fichas individuáis listando o nome, a idade, a raga e a data de cobricao dos animáis. No terco final da gestacao e durante a lactacao, as éguas receberam racao concentrada sendo mantidas em pastos de capim Coloniao durante o dia e, a noite, foram recolhidas em piquetes para observacao do parto.

As éguas foram distribuidas em tres tratamentos descritos a seguir: Tratamento I (Grupo Controle): foram utilizadas quatro éguas da raga Mangalarga Marchador, mantidas em pastos de capim coloniao, e suplementadas com racao concentrada em quantidades equivalentes a 0,5% do peso vivo, durante 30 dias pré-parto; Tratamento II (VitE-MM): foram utilizadas quatro éguas da raga Mangalarga Marchador, consumindo dieta semelhante a do grupo controle, com adicao diaria na dieta, de 80 mg de vitamina E/100Kg de peso vivo, durante 30 dias pré-parto. Tratamento III (VitE-BP): foram utilizadas quatro éguas da raga Bretao Postier, consumindo dieta semelhante a do grupo controle, com adicao diaria na dieta, de 80 mg de vitamina E/100 kg de peso vivo, durante 30 dias pré-parto.

Os potros nao foram suplementados com vitamina E na dieta, entretanto há passagem passiva de a-tocopherol, via colostro. A vitamina E, em pó foi cedida pela ROCHE®, e pesada individualmente para cada égua e oferecida juntamente com a racao, pela manha, urna vez ao dia.

Foram colhidas tres amostras de colostro de cada égua após o parto: a primeira foi colhida imediatamente após o parto e antes do potro mamar, a segunda 24 horas e a terceira 48 horas após o parto, respectivamente. As amostras de colostro foram acondicionadas em tubos FALCON®, devidamente identificados, e armazenados a -20°C. Nessas amostras, foram determinados os teores de proteína total (PT) pelo método Micro-Kedjhal, estimando-se a concentracao de IgG⁵.

As colheitas de sangue dos potros foram realizadas logo após o parto, antes da amamentacao, e ñas semanas subseqüentes totalizando doze semanas, obtidas por colheita de 5 mi de sangue da veia jugular em tubos siliconizados com gel retrator de coágulo. Após a coagulacao do sangue, os soros foram separados, e mantidos a -20 °C, até serem submetidos a técnica de ELISA indireto para a deteccao de anticorpos específicos para T. equi.

Para a realizacao do ELISA indireto foi desenvolvido um ensaio imunoenzimático para a deteccao de anticorpos para T. equi, segundo metodología descrita en 2003⁶. A concentracao ótima do antígeno de T. equi, cedido gentilmente pela Universidade Estadual de Sao Paulo (UNESP-Jaboticabal), foi de 10g/ml de tampao carbonato-bicarbonato 0,05M pH 9,6, a diluicao do soro foi estabelecida em 1:100 e a do conjugado 1:1000. Como branco, empregou-se a leitura dos orificios contendo todos os elementos da reacao com excecao do soro equino. Considerou-se como positivo as reacoes que apresentaram densidade óptica maior que as medias dos controles negativos acrescidas de dois desvios-padrao. A leitura da reacao foi realizada em espectrofotómetro para ELISA (Labsistems® IEMS Reader MF), com filtro de 405 nm. Utilizou-se a microplaca (Nunclon™ Surface® ) para a técnica de ELISA, devido a sua confiabilidade.

Os esfregacos sanguíneos foram confeccionados a partir de amostras de sangue da veia jugular⁷, e avahados para verificacao da presenca ou ausencia de formas evolutivas e de Cruz de Malta, característicos de T. equi.

Foi utilizado um delineamento inteiramente casualizado com tres tratamentos em arranjo de parcelas sub-divididas, onde os tratamentos foram analisados ñas parcelas e o tempo, em semanas, ñas sub-parcelas. Na análise dos parámetros sorológicos dos potros, a primeira semana reférese a colheita das amostras antes da amamentacao do potro e, as semanas subseqüentes correspondem a 3^a, 5^a, 7^a, 9^a e 11^a semana de idade. Os resultados obtidos foram submetidos á análise de variáncia e os valores medios comparados pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade utilizando o programa Sistema de Análises Estatísticas e Genéticas - SAEG (UFV, 2000)⁸.

RESULTADOS

A estacáo de paricáo das éguas ocorreu no período de agosto de 2001 a junho de 2002, coincidindo com a época de altas infestacoes ñas pastagens de larvas, ninfas e adultos de ixodídeos, propiciando a infestacáo dos potros nos primeiros dias de vida. Durante o período experimental, foram colhidos carrapatos dos animáis para identificacáo, observando-se a presenca deAmblyomma caj enríense eAnocentor nitens, e, ausencia de Boophilus microplus. Estes equinos nao foram criados juntamente com bovinos. Com o aumento da populacáo de larvas e ninfas no invernó, a transmissáo ocorre na primavera e veráo, na fase adulta, portante a alta infestacáo de carrapatos nos equinos justifica a denominacáo de área endémica para a babesiose equina, no plantel da UFRRJ¹.

O parto das éguas foi assistido, e as amostras de colostro, de aproximadamente 50 mi, foram colhidas antes do potro mamar e, com 24 e 48 horas pós-parto. As amostras foram analisadas quanto á concentracáo de proteína total (PT), pelo método de Micro-Kjedhal, considerando o fator de conversáo de 6,38. Na (Tabela 1) podem ser observados os valores medios da proteína total e IgG no colostro das éguas das ragas Mangalarga Marchador e Bretáo Postier cujas dietas foram suplementadas com vitamina E.

Em relacáo ao tempo de colheita do colostro, observou-se que as concentracoes de PT foram maiores (P < 0,05) antes do inicio da amamentacao, comparando com as amostras coletadas as 24 e 48 horas, concordando com outros trabajos⁹¹⁰, que relataram diminuicáo de PT e IgG no colostro com o passar do tempo após o parto. Nao foram observadas diferencas significativas (P > 0,05) entre os tratamentos na concentracáo de PT e IgG colostral, indicando que nao houve resposta imumoestimuladora da vitaminaE no colostro das éguas. Estes resultados discordam de Hoffman et al⁴, que relatam aumento do IgG no colostro, após suplementacáo com vitamina E, de éguas no pré-parto, entretanto estes animáis nao eram portadores de Babesia sp. A cor amarelada e a viscosidade do colostro estiveram associadas á concentracáo de PT e, conseqüentemente, a de IgG

A determinacáo do índice de ELISA (IE) foi elaborada segundo descricáo de Botteon⁶. Os índices de ELISA (IE), que variam de 0 a 9 de acordó com a intensidade da resposta, foram classificados nos tres grupos descritos a seguir: grupo 1 -IE de zero, significando ausencia de anticorpos; grupo 2 - IE de 1 a 3, significando soros fracamente positivos; grupo 3- IE de 4 a 6, significando soros de media positividade e grupo 4- IE de 7 a 9, significando soros fortemente positivos. Os valores nao diferiram signifi-cativamente em funcao da suplementacao com vitamina E ñas dietas das éguas das ragas Mangalarga Marchador e Bretao Postier, porém apresentaram diferencas significativas (P < 0,05) em funcao da idade do potro, expressas em semanas, conforme está demonstrado na (Tabela 2).

Segundo Jeffcott¹¹, a transferencia passiva de anticorpos só ocorre através da ingestao do colostro nos equinos. Considerando que aprimeira semana de idade representa a colheita de sangue no dia do parto, antes da primeira amamentacao, explica-se o resultado sorológico negativo pela ausencia de anticorpos. Após a primeira semana de idade, o ELISA classificado eleva-se pela absorcao de anticorpos de forma passiva e, ao mesmo tempo, os potros infestaram-se com os carrapatos A. cajennense e A. nitens ocorrendo, com o passar das semanas, a primo-infeccao. Ñas Figuras 1, 2 e 3 podem ser observados os índices de ELISA (IE) individuáis dos potros para cada tratamento.

Observa-se um aumento de anticorpos após a primeira semana de idade, devido aos anticorpos passivos, e posteriormente, há urna tendencia de reducao com nova elevacao a partir da sétima semana nos potros nascidos de éguas das ragas Mangalarga Marchador e Bretao Postier cujas dietas foram suplementadas com vitamina E. Esta elevacao pode estar relacionada a resposta ativa dos potros após infeccao natural por T. equi. Em alguns potros, pode-se observar carrapatos fixados na conjuntiva e ao redor do ánus, no primeiro dia de idade. Os resultados obtidos sao concordantes com os observados por Shein¹², que relata a primo-infeccao moderada em potros de áreas endémicas. Considerando que, no presente experimento, os potros foram avahados até 12 semanas de idade, os resultados estáo de acordó com as observacoes por outros¹³¹⁴ que relataram infeccoes por T. equi em potros após o nascimento, com hemoparasitemia antes de 42 dias de idade, em áreas endémicas. Embora a resposta ativa tenha ocorrido aproximadamente aos 42 dias de idade, sétima semana, os potros deste presente experimento nao apresentaram qualquer sintoma da infeccao por T. equi. Pode-se observar também, que um potro da raga Mangalarga Marchador e outro da raga Bretao Postier cujas éguas foram alimentadas com dietas

suplementadas com vitamina E, apresentaram índices de ELISA mais elevados do que os do grupo controle, conforme Figuras 2 e 3. Este fato pode ser explicado pela presenca de títulos de anticorpos altos, em ambas as éguas mostrando uma resposta passiva mais eficiente. As éguas do experimento foram acompanhadas diariamente, sendo que apenas urna égua da raga Bretao Postier apresentou prostracáo, febre e mucosas pálidas anteriormente a semana do parto, explicando a resposta passiva mais eficiente. As observacoes hematológicas e sorológicas, desta égua Bretao em particular, estao descritas na (Tabela 3). Esta égua apresentou o maior índice de ELISA, dentre as éguas de ambas as ragas, ocorrendo reducao do hematócrito e da hemoglobina e, monocitose, quando iniciaram-se os sinais clínicos característicos da babesiose com esfregacos sanguíneos positivos para T. equi. Posteriormente, o título de anticorpos decresceu com estabilizacao dos índices de ELISA entre 4 e 5. Os esfregacos sanguíneos realizados ñas semanas 9 a 12 apresentaram Cruz de Malta, sugerindo a multiplicacao do protozoário.

Os potros apresentaram índices de ELISA mais elevados do que suas maes, concordando com os resultados de Tenter & Friedhoff. (1986)¹³, e Cunhaet al (1996)¹⁶, relatando reducao gradual dos títulos de anticorpos para T. equi, com o aumento da idade dos animáis. Em áreas endémicas, os animáis adultos tendem a possuir baixo título de anticorpos devido as constantes reinfeccoes pela infestacáo por carrapatos, já os potros sofrem a primo-infeccáo com altos títulos de anticorpos e, com posterior declínio.

A comparacáo dos esfregacos sanguíneos individuáis dos animáis, no dia do nascimento, revelou que tres potros nascidos das éguas do Grupo controle estavam positivos, tres potros nascidos das éguas da raga Mangalarga Marchador cujas dietas foram suplementadas com vitamina E também estavam positivos e, que nenhum potro nascido de éguas da raga Bretao Postier estava positivo. Este fato poderia ser explicado pela infeccao intrauterina de T. equi, onde ocorre a passagem de eritrocitos parasitados pela barreira placentária, e que parece ser relativamente comum em áreas endémicas¹⁷¹⁹.

DISCUSSÁO

A suplementacáo dietética de vitamina E na dose de 80 mg para cada 100 kg de peso vivo nao foi suficiente para modular a resposta imune ñas éguas e respectivos potros.

Nao houve resposta imunomoduladora da vitamina E no IgG do colostro das éguas.

O ELISA indireto demonstrou ser um ótimo instrumento de verificacáo do grau de imunidade estabelecida por infeccao natural, concordando com Botteon⁶.

Os resultados confirmam a presenca de infeccao intrauterina em áreas endémicas e reforcam a necessidade de mais estudos para possibilitar medidas preventivas, assim como o uso de imunomoduladores nos casos de infeccao crónica por T. equi.

Há necessidade de mais estudos sobre a utilizacáo e quantificacáo da vitamina E como imunomodulador em equinos portadores de babesiose.

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