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Parasitología latinoamericana

versión On-line ISSN 0717-7712

Parasitol. latinoam. v.61 n.1-2 Santiago jun. 2006

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-77122006000100005 

 

Parasitol Latinoam 61: 32 - 36, 2006 FLAP

ARTÍCULO ORIGINAL

 

Cinética multiplicativa de clones de Crithidia fasciculata (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) en un sistema de cultivo in vitro

MULTIPLICATIVE KINETICS OF Crithidia fasciculata (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) CLONES IN AN IN VITRO CULTURE SYSTEM

 

OLGER CALDERÓN-ARGUEDAS*, MISAEL CHINCHILLA**, ADRIÁN AVENDAÑO*, y MARÍA JOSÉ CARVAJAL*

* Centro de Investigación en Enfermedades Tropicales (CIET), Departamento de Parasitología, Facultad de Microbiología, Universidad de Costa Rica, San José, Costa Rica. E-mail: olgerc@cariari.ucr.ac.cr
** Laboratorio de Investigación. Universidad de Ciencias Médicas "Dr. Andrés Vesalio Guzmán". San José, Costa Rica.


The multiplicative kinetics in diphasic 40% blood-agar media was studied in five clones and the parental strain of Crithidia fasciculata (Kinetoplastida: Trypanosomatidae). The clones were obtained from cultures in 40% blood-agar and were named as Ia, IIIa, IVa, Va and CAA. In each case, diphasic blood agar media with brain heart infusion broth 3,7% was inoculated with 103 choanomastigotes. The concentration of parasites were estimated weekly during 12 weeks expressing these concentrations in choanomastigotes/mm3. The variability was evaluated by ANOVA tests for repeated measures (α:0,05). Electrophoresis in polyacrylamide gel with sodium dodecil sulfate (SDS-PAGE) was also performed to evaluate the protein profiles of the clones and parental strain. The results showed a short logaritmic growth phase before a long stationary phase. There were not significant statistical differences in the concentration of choanomastigotes/mm3 between the studied systems during each day of observation (p > 0,05). The polypeptide profiles of the extracts showed highly homogeneus patrons. These results could suggest that the minor evolutive pressures that suffer naturally C. fasciculata in its propagative cycle in insects could be related to the observed homogenitiy but its needed more research in topics as inmunology, biology and genetics in order to demostrate this homogenity.

Key words: Crithidia fasciulata, Trypanosoma cruzi, Trypanosomatidae, monogenic trypanosomatid.

RESUMEN

La cinética multiplicativa de la cepa parental y cinco clones de Crithidia fasciculata (Kinetoplastida: Trypanosomatidae) fue estudiada en agar sangre 40% difásico. Los clones fueron obtenidos de cultivos en agar sangre 40% y denominados Ia, IIIa, IVa, Va y CAA. En cada caso, tubos de agar sangre 40% difásico con infusión cerebro corazón 3,7 % como fase líquida fueron inoculados con 103 coanomastigotos de cada clon y la cepa parental. La concentración de parásitos fue estimada semanalmente durante 12 semanas expresando las concentraciones en coanomastigotos/mm3. La variabilidad fue evaluada por análisis de variancia (ANDEVA) para mediciones repetidas (a:0,05) realizadas durante cada día de observación. Electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE) fueron también efectuadas para evaluar los perfiles proteicos de los clones y la cepa parental. Los resultados mostraron una fase de crecimiento logarítmico muy corta que antecedió a una fase estacionaria prolongada. (p > 0,05). No hubieron diferencias estasdísticamente significativas entre la concentración de coanomastigotos/mm3 entre los sistemas estudiados durante cada día de observación. Los perfiles proteicos mostraron patrones altamente homogéneos en todos los sistemas estudiados. Los resultados sugieren que las menores presiones evolutivas que sufre naturalmente C. fasciculata en su ciclo propagativo podrían estar relacionadas con la homogeneidad observada, pero es requerida más información en tópicos como inmunología, biología y genética para demostrar dicha homogeneidad.

 

INTRODUCCIÓN

Los kinetoplástidos son protozoarios parásitos que pueden presentar dos patrones en su ciclo de vida. Los kinetoplástidos monogénicos, cuyos representantes en parasitismo animal son los géneros Crithidia, Herpetomonas, Blastocrithidia y Leptomonas, realizan un ciclo de vida monoxeno1,2. En éste participan como hospe-dadores insectos de los órdenes Diptera, Hemiptera, Siphonaptera e Hymenoptera1,2. Los kinetoplástidos digénicos describen un ciclo diheteroxeno en donde los hospedadores invertebrados están representados por dípteros o hemípteros y los vertebrados incluyen a mamíferos, reptiles y anfibios1,2. En este grupo se ubican los géneros Trypanosoma y Leishmania, importantes patógenos de humanos y animales superiores. Aunque en algunos parásitos como Trypanosoma brucei se han demostrado evidencias de intercambio genético, estos parásitos se multiplican por mecanismos asexuales. Lo anterior explica el por qué dichos organismos experimentan una propagación clonal en la naturaleza3.

Este tipo de propagación podría condicionar la ocurrencia de clones con propiedades biológicas particulares, cuya dominancia determinaría las características biológicas de las diferentes cepas en con contexto biogeográfico3.

Trypanosoma cruzi, el agente causal de la enfermedad de Chagas, ha sido uno de los kinetoplástidos que más se han estudiado en este contexto y con él se ha podido demostrar el fenómeno de heterogeneidad clonal entre clones constitutivos y las respectivas cepas de donde provienen4-6.

Dada la proximidad filogenética entre T. cruzi y Crithidia fasciculata se decidió estudiar el fenómeno de heterogeneidad clonal como una primera aproximación al estudio de este fenómeno en kinetoplastidos monogénicos.

MATERIAL Y MÉTODOS

1.- Cepa de Crithidia fasciculata: Se utilizó la cepa de C. fasciculata del Departamento de Parasitología de la Facultad de Microbiología en la Universidad de Costa Rica. Esta cepa ha sido mantenida por medio de pasajes mensuales en medio difásico de Rugai utilizando como fase líquida solución salina estéril al 0,85% y antibióticos (penicilina 100 UI/mL, estreptomicina, 100 mg/mL).

2.- Obtención de clones: A partir de cultivos en fase de crecimiento logarítmico, se ajustaron inóculos de 3,5 x 103 parásitos, los cuales fueron dispensados en botellas de agar sangre 40%, preparadas de acuerdo con la metodología descrita previamente7.

Transcurridas tres semanas, las colonias fueron picadas con una aguja bacteriológica y sembradas en agar sangre 40% difásico de acuerdo con la metodología citada7 para establecer las líneas clonales. Cinco clones fueron seleccionados para el experimento, los cuales fueron denominados arbitrariamente como Ia, IIIa, IVa, Va y CAA.

3.- Cinética multiplicativa: A partir de cada uno de los cultivos clonales y de la cepa parental se ajustaron inóculos de 3,5 x 103 parásitos los cuales fueron sembrados por triplicado en tubos de agar sangre al 40% con un 5,0 mL de fase líquida constituida por infusión cerebro corazón al 3,7%. Los cultivos fueron observados semanalmente durante doce semanas. En cada uno de los días de observación se realizó la determinación de la concentración parasitaria en el medio, utilizando un hemocitómetro de Neubauer y expresando la concentración en coanomastigotos/mm3. Cada una de las deter-minaciones fue hecha por triplicado.

Para estudiar las variabilidad en las concentraciones parasitarias en cada día de observación, se realizaron análisis de variancia (ANDEVA) para mediciones repetidas8, utilizando un coeficiente de confiabilidad del 95%. Adicionalmente, se realizaron pruebas de Tukey8 para poder estimar las diferencias verdaderamente significativas. Dichas pruebas fueron efectuadas mediante el paquete estadístico Statistica© 6.0.

4.- Preparación de extractos y análisis electroforético de los clones: Con el fin de estudiar la identidad electroforética de los sistemas obtenidos, se prepararon extractos proteicos a partir de cada uno de los clones y de la cepa parental. Para cada uno de los sistemas, 5 x 105 coanomastigotos fueron obtenidos a partir de agar sangre 40% difásico7 mientras experi-mentaban su fase de crecimiento logarítmico y se depositaron en tubos Eppendorf©, los cuales se refrigeraron por 15 minutos. Seguidamente se centrifugaron a 3.000 rpm a 10ºC por 10 minutos. Los botones fueron lavados y resuspendidos en 1,0 mL de solución salina estéril; posteriormente, se hicieron dos ciclos de centrifugación a 3.000 y 4.000 rpm por 10 minutos a 10ºC antes de ser resuspendidos en 1,0 mL de solución salina. Las suspensiones fueron transferidas a viales de criofractura en los cuales se realizaron cinco ciclos de congelación-descongelación. Cada ciclo implicó la colocación de las muestras durante un minuto en un nitrógeno líquido (-70ºC) y seguidamente su transferencia a un baño maría a 37ºC por un minuto. Finalmente, las muestras fueron centrifugadas a 16.000 rpm durante 20 minutos. Los sobrenadantes constituyeron los extractos a utilizar en la evaluación electroforética de los sistemas. La concentración proteica en estos sobrenadantes fue determinada siguiendo un método estandarizado9.

Las corridas electroforéticas fueron realizadas en geles de poliacrilamida al 12% con dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE)10 para lo cual se cargaron 20 mg de proteína en cada pocillo. Posteriormente los geles fueron teñidos mediante un protocolo de tinción de plata11.

RESULTADOS

Los cultivos, tanto de los clones como de la cepa parental, tuvieron una fase de crecimiento logarítmico muy acelerada que antecedió a una fase estacionaria que se prolongó hasta el final del período de observación fijado para el experimento (Figura 1). La morfología de las formas de cultivo permitió visualizar los coanomastigotos típicos de C. fasciculata (Figura 2).

  Figura 1. Cinética multiplicativa de clones y cepa parental de Crithidia fasciculata.

  Figura 2. Coanomastigotos de Crithidia fasciculata teñidos con colorante de Giemsa, procedentes de cultivos "in vitro" en agar sangre 40% difásico (barra: 10 mm).
 

Los análisis de variabilidad no evidenciaron diferencias estadísticamente significativas entre los sistemas (clones y cepa parental) en cada uno de los días de observación (Tabla 1) (p > 0,05).


El análisis electroforético de los sistemas celulares estudiados permitió visualizar una gran homogeneidad en los perfiles proteicos correspondientes a los clones y la cepa parental (Figura 3).

Figura 3. Perfiles electroforéticos de los sistemas celulares estudiados. (PM: marcadores de peso molecular; Ia, IIIa, IVa, Va, CAA: clones evaluados; Crith: cepa parental de Crithidia fasciculata).

DISCUSIÓN

Aunque ciertas características de hetero-geneidad en Crithidia, Leptomonas y Herpetomonas han sido demostradas a nivel de cepas por diferentes métodos2, no se conoce si esta heterogeneidad puede tener lugar en los clones constitutivos como sucede en T. cruzi. En los sistemas de cultivo in vitro los eventos multiplicativos de T. cruzi y C. fasciculata son similares, sin embargo, el presente estudio reveló un comportamiento homogéneo entre los clones y la cepa parental de C. fasciculata que se manifestó en la no ocurrencia de diferencias estadísticamente significativas en los análisis de variabilidad efectuados (p > 0,05). Este com-portamiento resulta diferente al observado en T. cruzi. En un trabajo con T. cruzi y analizando los clones h1y h2 procedentes del aislamiento hSLU 239, derivado de una cepa cardiotrópica, y los clones m1, m2, m3 y m4 obtenidos a partir del aislamiento mSLU 142 procedente de un paciente con megaesófago, se encontró diferencias marcadas en la cinética multiplicativa de cada clon así como en su potencial de diferenciación a tripomastigotos metacíclicos en un sistema de cultivo in vitro con medio LIT4. En otro estudio5, las propiedades patogénicas de estos clones fueron estudiadas demostrándose un potencial patogénico y de virulencia particular para cada uno de ellos. A diferencia de lo que sucede con T. cruzi, el presente estudio permitió determinar un gran potencial multiplicativo en C. fasciculata, razón por la cual el crecimiento logarítmico ocurrió en un intervalo muy corto, pasando luego a una fase estacionaria sostenida. Este compor-tamiento relativamente uniforme sugiere una homogeneidad en cuanto a las propiedades de supervivencia y adaptación que muestran los diferentes clones ante las presiones selectivas derivadas del mismo crecimiento del protozoario en el medio. Los perfiles electroforéticos observados para cada uno de los sistemas evaluados no revelaron diferencias entre sí, por lo que este hallazgo podría interpretarse como una expresión homogénea de las proteínas constitutivas en todos los sistemas celulares evaluados o podría representar que los diferentes clones aislados, en realidad corresponden a réplicas del mismo clon, lo que sustentaría la posibilidad de que la mayoría de la población del cultivo estuviera representada por uno o pocos clones dominantes con características similares, que podrían además ser el resultado del mantenimiento sostenido del protozoario en sistemas de cultivo in vitro.

Como ha sido documentado, C. fasciculata es un organismo monoxeno, el cual utiliza culícidos como sus hospedadores y su diseminación tiene lugar por coprofagia1,2,12. Esta condición supone menores presiones selectivas en comparación con especies heteroxénicas de tripanosomátidos como T. cruzi y Leishmania. En estas últimas, la radiación adaptativa que ha podido tener lugar como resultado de las presiones selectivas representadas por los diferentes tipos de potenciales hospedadores, podría explicar los fenómenos de heterogeneidad y especiación en estos organismos. Llama la atención que a pesar de que los kinetoplástidos monoxenos han sido relacionados con sus hospedadores con base en sus respectivos aislamientos, estos suelen mostrar una baja especificidad por dichos hospedadores por lo que las infecciones en especies poco relacionadas filogenéticamente son probables2,12. Este aspecto permite perfilar como improbable la evolución paralela del sistema hospedador parásito, lo que constituye un argumento adicional para soportar la idea de que las tendencias de especiación son mucho menores a las que han tenido lugar en los kinetoplástidos heteroxenos.

Aparte de contemplar el análisis de la cinética multiplicativa como una aproximación en el análisis de la aparente homogeneidad entre la cepa parental y los clones de C. fasciculata en un sistema in vitro, el estudio de aislamientos recientes donde se aborden además de las características estudiadas otras de carácter inmunológico, biológico y genético son fundamentales para poder aceptar o descartar la homogeneidad perfilada en el presente estudio. Estos conocimientos podrían ser claves en la utilización de los tripanosomátidos monoxenos y sus clones como potenciales controladores biológicos o como candidatos a ser utilizados como organismos transgénicos en los cuales se puedan insertar genes que modulen ya sea la supervivencia del hospedador o la refractariedad que éste pueda mostrar a organismos infecciosos patógenos al ser humano y animales superiores como ha sido exitosamente ensayado con endosimbiontes de los vectores de la enfermedad de Chagas13.

 

REFERENCIAS

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Agradecimientos: Los autores desean expresar su agradecimiento a la Dra. Elizabeth Abrahams Sandí del Departamento de Parasitología en la Facultad de Microbiología de la Universidad de Costa Rica (UCR) por sus valiosos consejos durante la ejecución del presente trabajo, a Iván Coronado de la Sección de Artropodología Médica, Facultad de Microbiología (UCR) por su servicio asistencial y a la Vicerrectoría de Investigación (UCR) por su apoyo económico al proyecto 803-A4-017.