SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.57 número3-4Cysticercosis occurrence and sanitary risks in groups of inspected and non-inspected swine in BrazilSeroprevalencia de Babesia equi en tres diferentes sistemas de crianza de equinos: Rio de Janeiro - Brasil índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Parasitología latinoamericana

versión On-line ISSN 0717-7712

Parasitol. latinoam. v.57 n.3-4 Santiago jul. 2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-77122002000300009 

Parasitol Latinoam 57: 134 - 140, 2002

ARTÍCULO ORIGINAL

Avaliação in vitro dos fungos Aspergillus flavus e
Penicillium corylophilum em larvas de Musca domestica
(Diptera: Muscidade)

MÁRCIA DE SENNA NUNES*, GISELA L. DA COSTA**,
VÂNIA RITA E.P. BITTENCOURT***, y EDSON J. SOUZA***

In vitro AVALIATION OF THE FUNGUS Aspergillus flavus AND Penicillium
corylophilum
IN LARVAE OF Musca domestica (DIPTERA: MUSCIDADE)

The present study was aimed at the evaluation of two isolates of Aspergillus flavus and two isolates of Penicilium corylophilum on third stage larvae of Musca domestica. The samples tested were isolated directly from M. domestica specimens. Third stage larvae were obtained from pupas of a laboratory colony. Four batches with 20 larvae were used for each of conidia dilution tested (105 to 108 conidia/ml). Larvae were dipped for one minute into conidia dilution, being then moved to dishes and kept under controlled environmental conditions. Two control groups were used: one received a treatment with spreading adhesive and the other one with no treatment at all. Larval surviving rates were: 57.50% and 86.25% for groups treated with 108 conidia/ml of A. flavus; and 63.75% and 72.50% for those who had received the same concentration of P. corylophilum conidia. Larval mortality rates were greater for groups that received higher conidia concentrations, and also increased directly proportional to exposition time. Adult hatching rates on treated groups, were affected by fungi treatment. It was concluded that A. flavus and P. corylophilum presented detrimental effects for third stage larvae of M. domestica.

Key words: Musca domestica, biological control, Penicillium corylophilum, Aspergillus flavus.

INTRODUNÇÃO

Musca domestica (Diptera: Muscidae), é uma espécie de grande importância médico sanitária pois atua como vetor mecânico e/ou biológico de diversos agentes patogênicos, incluindo parasitos do homem e de animais domésticos1.

Infestações por M. domestica causam sérios problemas em criações de animais2, interferindo no ganho de peso como agente causador de estresse, podendo afetar a postura em aves, resultando assim em perdas econômicas significativas. Possui distribuição geográfica mundial, mostrando-se predominante sobre os demais dípteros sinantrópicos3.

No Brasil, a utilização de fungos entomopatogênicos como agentes de controle biológico vem sendo aplicada utilizando-se principalmente as espécies Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana. Poucos são os estudos direcionados ao controle biológico de moscas por fungos entomopatogênicos, avaliando a ação deste sobre diversas formas evolutivas destes dípteros.

Investigadores realizaram infecções experimentais com larvas de terceiro instar e adultos de M. domestica, inoculando suspensões conidiais de B. bassiana isoladas de coletas4. Observaram que as larvas tratadas apresentaram uma baixa viabilidade pupal. Outros verificaram a capacidade de cepas de Penicillium causarem a morte de larvas de segundo instar de Aedes fluviatilis em um período menor que 72 horas5.

O objetivo do presente estudo foi o de avaliar o potencial patogênico de dois isolados fúngicos de Aspergillus flavus e dois isolados fúngicos de Penicillium corylophilum sobre larvas de terceiro instar de M. domestica.

MATERIAL E MÉTODOS

O experimento foi desenvolvido na EPPWON, DPA-IV/UFRRJ, no período de fevereiro de 1999 à junho de 2000. O estudo foi realizado sob condições de temperatura e umidade relativa controladas (28°C ± 1 e > 80%) no Laboratório de Controle Microbiano de Artrópodes de Importância Veterinária e no Laboratório de Biologia de Insetos, ambos localizados na EPPWON.

A coleta dos insetos adultos de M. domestica foi realizada em dois locais (criadouros naturais). O primeiro criadouro foi em baias do Setor de Suinocultura do Instituto de Zootecnia (UFRRJ) e o segundo no Depósito de Lixo Urbano no bairro de Boa Esperança, município de Seropédica, RJ. Realizaram-se coletas das moscas utilizando puçá de tela de nylon e gaiola de madeira revestida late-ralmente por tela nylon (28,5 cm de altura x 27,5 cm de largura x 32 cm de profundidade). Foram realizadas três coletas em cada criadouro nos meses de fevereiro, maio e setembro de 1999. As espécies selecionadas para os bioensaios foram A. flavus e P. corylophilum, por serem as mais prevalentes6.

Selecionouse dois isolados de A. flavus SP3C3 (baias da suinocultura) e LP4C5 (depósito de lixo) e dois de P. corylophilum SP2C8 (baias da suinocultura) e LP3C7 (depósito de lixo). Esta seleção foi feita de acordo com o melhor crescimento fúngico e com o local de coleta.

A criação estoque foi estabelecida a partir de espécimens adultos coletados nos dois criadouros naturais, onde foram realizadas as coletas para o isolamento dos fungos. Os procedimentos para manutenção e obtenção de outras gerações seguiram os métodos preconizados previamente.7

As suspensões de conídios de cada isolado selecionado foram preparadas a partir de culturas fúngicas produzidas em meio BDA dentro de câmara asséptica de fluxo laminar. As culturas dos isolados selecionados para os testes de patogenicidade foram transplantadas para tubos de 28 x 150 mm, contendo meio inclinado e mantidos em câmara climatizada sob condições controladas, durante sete a dez dias para desenvolvimento fúngico. Para preparo das suspensões foram acrescentadas 10 ml de água destilada esterilizada com 0,01% de Tween 80, sobre a superfície de cada tubo, contendo as culturas esporuladas. Após homogeneização e quantificação da suspensão em câmara de Neubauer, as diluições foram realizadas a partir da concentração de 108. Para as demais diluições foram sendo adicionadas 90 ml de água destilada estéril e três gotas de espalhante adesivo. Desta forma, foram preparadas as suspensões 108, 107, 106 e 105.

Para os bioensaios foram utilizadas larvas com aproximadamente 72 h após eclosão4,8. Quatro repetições com 20 larvas cada foram utilizadas para cada uma das diluições das suspensões conidiais dos diferentes isolados fúngicos testados. As larvas foram mergulhadas por um minuto na suspensão conidial respectiva, sendo transferidas para placas de Petri com 3 cm de diâmetro, forradas com papel de filtro e umedecidas com 1 ml de água destilada. Estas placas foram mantidas tampadas em câmara climatizada. Foram mantidos dois grupos controle. No grupo controle positivo as larvas foram mergulhadas por um minuto em solução 0,01% de Tween 80. No grupo controle negativo, as larvas foram mantidas sem nenhum tratamento. As larvas não foram alimentadas durante o experimento. Todos os grupos foram mantidos em fotofase de 14 h à 28°C ± 1 e 80% de umidade relativa. As observações foram realizadas diariamente. As larvas que apresen-tavam qualquer alteração vital ou morte confirmada foram separadas para a observação da presença de estruturas fúngicas, sobre a cutícula. As pupas formadas foram transferidas para tubos de ensaio que foram tampados com algodão devidamente identificados. A avaliação da patogenicidade baseou-se na mortalidade de larvas e emergência do adulto.

A análise de variância (ANOVA) foi seguida por aplicação do teste de Tukey, para comparação entre as médias, calculando-se o coeficiente de variação para verificar a precisão dos dados.Para calcular a concentração letal, CL50 e CL90, foi usada a análise de próbites9,10,11.

RESULTADOS

A porcentagem de sobrevivência larval de M. domestica está representada na Tabela 1. Através da análise de variância e teste de Tukey, observou-se que os percentuais de sobre-vivência larval nos bioensaios com os isolados de A. flavus, não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos. Apesar das porcentagens de sobrevivência larval terem sido menores, principalmente nos grupos tratados com 108 e 107 conídios/ml do isolado de A. flavus SP3C3 (57,5%), quando comparadas estatisticamente, não diferiram entre os demais tratamentos e com os grupos controle, devido ao elevado desvio padrão obtido. As larvas tratadas com o isolado A. flavus LP4C5, não demonstraram ser afetadas por este fungo em nenhum dos tratamentos em relação aos grupos controle. Nos bioensaios utilizando os dois isolados de P. corylophilum, verificou-se diferença significativa entre os tratamentos com as suspensões conidiais nas concentrações 106, 107 e 108 conídios/ml. A sobrevivência larval foi menor na maior concentração utilizada (108), verificando-se os valores médios de 63,75 e 72,5%, para os isolados de P. corylophilum SP2C8 e LP3C7, respectivamente (Tabela 1).


O ritmo de emergência de M. domestica para cada isolado testado, pode ser verificado nas Figuras 1 e 2. A emergência de adultos do pupário ocorreu principalmente no quinto dia após pupação. Não foi observada diferença significativa entre tratamentos e grupos controle nos quatro isolados testados. No isolado A. flavus LP4C5, a emergência estendeu-se até o sétimo dia e nos demais isolados testados, não ultrapassou o sexto dia após pupação.


Figura 1. Ritmo de emergência de Musca domestica, após larvas de terceiro instar terem sido tratadas com suspensões conidiais em diferentes concentrações de dois isolados fúngicos de Aspergillus flavus, obtidos de moscas desta mesma espécie, capturadas em dois criadouros, Setor de Suinocultura (UFRRJ) e Depósito de Lixo (bairro de Boa Esperança), no município de Seropédica, RJ.


Figura 2. Ritmo de emergência de Musca domestica, após larvas de terceiro instar terem sido tratadas com suspensões conidiais em diferentes concentrações de dois isolados fúngicos de Penicillium corylophilum, obtidos de moscas desta mesma espécie, capturadas em dois criadouros, Setor de Suinocultura (UFRRJ) e Depósito de Lixo (bairro de Boa Esperança), no município de Seropédica, RJ.

A porcentagem de emergência de adultos de M. domestica foi menor nos grupos tratados com 108 a 105 conídios/ml, quando comparado aos grupos controle dos dois isolados de A. flavus (Tabela 2). Entretanto, não apresentaram diferenças significativas entre os tratamentos e ou grupos controle, após utilização dos testes estatísticos. As porcentagens de insetos adultos oriundos dos bioensaios com as duas cepas de P. corylophilum diferiram significativamente em todos os tratamentos. Nos bioensaios com estas duas cepas, a emergência dos adultos foi diminuindo significativamente, conforme aumentava a concentração conidial (Tabela 2).


Na Tabela 3, observam-se os valores de con-centrações letais após análise de próbites para mortalidade de 50 e 90% de larvas de M. domestica tratadas com os isolados testados.


DISCUSSÃO

A sobrevivência larval foi mais baixa nos tratamentos com maior concentração conidial (107 e 108) em todos os bioensaios realizados. As altas concentrações dos isolados provocaram mortalidade em um pequeno percentual de larvas nos intervalos de 24 horas após tratamento. Neste período o maior percentual foi verificado no isolado P. corylophilum SP2C8 com menos de 20% de mortalidade larval. Com o passar do tempo houve aumento na mor-talidade proporcional à concentração conidial, sendo observado maior mortalidade nos grupos tratados com as suspensões 107 e 108 do isolado A. flavus SP3C3, 72 horas após tratamento. Como foram utilizadas larvas maduras, as sobreviventes já entraram no estágio pupal após este intervalo de tempo. O tempo para colonização do fungo pode variar de 72 horas a 120 horas, dependendo do patógeno, da espécie hospedeira e das condições ambientais12.

Os resultados dos bioensaios verificados por outros quando testaram vários isolados de Peni-cillium em A. fluviatilis, mostraram que 14 isolados provocaram mortalidade de larvas acima de 50%5, dez isolados causaram morte em um número menor que este, enquanto dez isolados de Penicillium sp. foram ineficientes em concentrações próximas a 106 conídios/ml, num período de 72 horas. Os autores observaram que P. corylophilum provocou 100% de morta-lidade larval em A. fluviatilis.

Já a porcentagem de emergência de adultos foi influenciada pela ação do fungo. A diminuição dos percentuais de emergência foi diretamente proporcional aos aumentos das concentrações das suspensões conidiais dos quatro isolados testados, influenciando a viabilidade pupal.

Autores observaram baixa na viabilidade pupal de M. domestica tratadas com B. bassiana4. Resultados ainda mais eficazes foram registrados quando avaliaram o percentual de emergência de M. domestica, após tratamento de larvas de terceiro instar, com suspensões conidiais em diferentes concentrações de seis isolados entomopatogênicos8. Observaram que M. anisopliae e Tolypocladium cylindros-porum foram as mais patogênicas. Nos grupos tratados com T. cylindrosporum não ocorreu emergência nos tratamentos com suspensões 108 a 105 conídios/ml. Nos bioensaios com M. anisopliae, estes autores verificaram que as concentrações conidiais de 108 e 107 preveniram 100% de emergência e nos grupos tratados com as concentrações de 106 e 105 conídios/ml do isolado M. anisopliae, os percentuais de emergência verificados foram 1 e 16%, respectivamente. A eficácia destas espécies fúngicas como agentes de controle biológico de larvas de M. domestica é notória4,8. Nenhuma das quatro cepas testadas no presente estudo impediu a emergência do pupário em tão alto percentual.

RESUMO

O objetivo do presente estudo foi o de avaliar o potencial de dois isolados fúngicos de Aspergillus flavus e dois isolados de Penicillium corylophilum sobre larvas de Musca domestica. Os isolados avaliados foram isolados de M. domestica. Para a realização dos bioensaios foram selecionados dois isolados de cada espécie fúngica. Larvas de terceiro instar de M. domestica com 72 horas após eclosão, foram obtidas a partir de colônia desta espécie. Quatro repetições com 20 larvas cada foram utilizadas para cada uma das diluições das suspensões conidiais (105 a 108 conídios/ml) dos diferentes isolados fúngicos testados. As larvas foram mergulhadas por um minuto na respectiva suspensão, sendo transferidas para placas e mantidas sobre condições controladas. Dois grupos controle foram mantidos, no primeiro as moscas foram tratadas apenas com espalhante adesivo e no segundo sem nenhum tratamento. As porcentagens de sobrevivência larval foram de 57,50% e 86,25% para os tratamentos com 108 conídios para os bioensaios com A. flavus e 63,75% e 72,50% para larvas tratadas com suspensões nesta mesma concen-tração, nos bioensaios com P. corylophilum. O aumento gradativo da mortalidade larval ocorreu aumento da concentração conidial em relação aos grupos controle. O ritmo e a porcentagem de emergência de adultos das moscas a partir das larvas tratadas foi afetado pela dos isolados fúngicos.

REFERÊNCIAS

1.- FREITAS M G, COSTA H M A, COSTA J O, IIDE P. Entomologia e Acarologia Médica e Veterinária. 5a ed., Precisa Editora Gráfica Ltda, Belo Horizonte, Minas Gerais, 1981, 253 p.         [ Links ]

2.- CAMPBELL J B, BOXLER D J, DANIELSON D M, CRENSHAW M A. Effects of house and stable flies on weight gain and feed efficiency by feeder pigs. Southwest Entomol 1984; 9: 273-4.         [ Links ]

3.- WEST L S. The housefly its natural history, medical importance and control. Comstock Publishing Company, Ithaca, New York, 1951, 584 p.         [ Links ]

4.- STEINKRAUS D C, GEDEN C J, RUTZ D A, KRAMER J P. First report of the natural occurrence of Beauveria bassiana (Moniliales - Maniliaceae) in Musca domestica (Diptera, Muscidae). J Med Entomol 1990; 27: 309-12.         [ Links ]

5.- COSTA G L, MORAES A M L M, OLIVEIRA P C. Pathogenic action of Penicillium specis on mosquito vectors of human tropical diseases. J Basic Microbiol 1998; 38: 337-41.         [ Links ]

6.- SENNA-NUNES M S, COSTA G L, BITTEN-COURT V R E P, DAEMON E. Isolamento de fungos em Musca domestica capturadas em dois criadouros naturais no município de Seropédica, RJ. XI Seminário Brasileiro de Parasitologia Veterinária, Salvador, BA, Resumos, 1999. p. 72.         [ Links ]

7.- SENNA-NUNES M S, MILWARD-DE-AZEVEDO E M V, CARVALHO E H P S, MELLO R P. Estudo comparado do desenvolvimento pós-embrionário de Musca domestica L. 1758, criada em fezes de animais domésticos, sob condições de laboratório. Revta Bras Ent 1991; 35: 203-21.         [ Links ]

8.- BARSON G, RENN N, BYWATER A F. Laboratory evaluation of six species of Entomopathogenic fungi for the control of the house fly (Musca domestica), a pest of intensive animal units. J Invert Pathol 1994; 64: 107-13.         [ Links ]

9.- LITCHFIELD J T, WILCOXON F. Simples method of sitting dose effects curve. J Pharmacol Exp Therapy 1949; 95: 99-113.         [ Links ]

10.- FINNEY D J. Estatistical Method in Biological Assay. 2a ed. Charles Grissin, London, 1964, 68 p.         [ Links ]

11.- FINNEY D J. Probit Analysis. 3a ed. Cambridge University Press, London, 1971, 333 p.         [ Links ]

12.- ALVES S B. Controle Microbiano de Insetos. 2a ed. vol. 4, FEALQ, São Paulo, 1998, 1163 p.         [ Links ]

Agradecimentos. Os autores agradecem ao Técnico de Laboratório Ivan Serafim da Silva, pelo auxílio nas coletas de insetos e manutenção das colônias.


* Departamento de Parasitologia, Faculdade de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Iguaçu, Av. Abílio Augusto Távora, 2134, 26260-000, Nova Iguaçu, RJ, Brasil.

** Departamento de Micologia, Instituto Oswaldo Cruz, Fundação Oswaldo Cruz, Av. Brasil, 4365, 21045-900, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

*** Departamento de Parasitologia Animal, Instituto de Veterinária, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, BR 465, Km 7, 23890-000, Seropédica, RJ, Brasil. vaniabit@ufrrj.br (Endereço para correspondência).