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Revista chilena de obstetricia y ginecología

versão impressa ISSN 0048-766Xversão On-line ISSN 0717-7526

Rev. chil. obstet. ginecol. v.68 n.4 Santiago  2003

http://dx.doi.org/10.4067/S0717-75262003000400003 

REV CHIL OBSTET GINECOL 2003; 68(4): 287-292

Trabajos Originales

CRIOPRESERVACION DE PRONUCLEOS: ROL EN EL PROGRAMA DE FERTILIZACION ASISTIDA*

Drs. Ricardo Pommer T., Begoña Arguello B.*, Marina Díaz-Fontevilla*, Claudia Martínez**,
Ariel Fuentes G., Irene Furman,*** Alberto Palomino, Emiliano Soto R., Hugo Sovino, Luigi Devoto C.

Instituto de Investigaciones Materno Infantil (IDIMI), Servicio y Departamento de Ginecología y Obstetricia,
Hospital Clínico San Borja-Arriarán, Universidad de Chile.

*Biólogas, **Matrona, ***Psicóloga

RESUMEN

Objetivo: Determinar el rol de la criopreservación (CP) de pronúcleos (PN), como una herramienta para disminuir la incidencia de embarazos múltiples y dar otra oportunidad de transferencia embrionaria, sin requerir estimulación ovárica nuevamente, en parejas con infertilidad que requieren como tratamiento algún tipo de procedimiento de Fertilización Asistida (FA).

Material y Método: Se analizaron los resultados de 545 procedimientos de FA entre marzo del 2000 y junio del 2003.

Resultados: La incorporación de la CP se logra en diciembre del 2001, criopreservando hasta la fecha el 51,3% de las parejas que tiene más de 6 folículos a aspirar. Se han criopreservado 623 PN dando un promedio 6,4 PN por pareja. Se han descongelado 166 PN, sobreviviendo 134 PN, lo que implica un 80,7%. Ciento catorce PN clivaron a embrión de 4 células, equivalente a un 85,1%. Se han transferido 114 PN en 39 ciclos con un promedio de 2,9 embriones por pareja, dando origen a 12 embarazos clínicos (30,7%) con una tasa implantacional del 11,4%. Se observa una reducción del número de embarazos múltiples en dobles del 23% al 15,5%, en triples del 7,6% al 2,2% y la no ocurrencia de cuádruples o más, al comparar el período 2000-diciembre 2001 (sin CP de PN), con diciembre de 2001-junio del 2003.

PALABRAS CLAVES: Criopreservación de pronúcleos humanos

SUMMARY

Objetive: To the role of cryopreservation (CP) of human pronuclei (PN), in our academic In vitro Fertilization Program at the San Borja Arriarán Clinical Hospital - University of Chile as a method of reducing the incidence of multiple pregnancies and providing an additional opportunity of embryo transfer, without requiring another hyperstimultaion ovarian cycle.

Material and Methods: Five hundred and forty five Assisted Fertilization procedures have been performed between march 2000 and june 2003.

Results: The PN cryopreservation program was approved by the Institutional Review Board in december 2001. Since then 51.3% of couples participating in our IVF program have asked for PN cryopreservation. The total number of PN (n= 623) that have been cryopreserved resulting in an average of 6.4 PN per couple.

Presently, 166 PN have been unfrozen with a surviving rate of 80.7% (n= 134). Eighty five percent of the PN (n= 114) cleaved to four to six cells embryo. All of the have been transferred in 39 cycles with an average of 2.9 embryos per couple, originating 12 clinical pregnancies (30.7%) with 11.4% rate of implantation. The PN cryopreservation program has diminished in a significant manner the number of multiple pregnancies in twins (23% to 15.5%), as well as, triplets (7.6% o 2.2%). In addition we have not seen quadruples or more over the time agenda of the cryopreservation program.

KEY WORDS: Cryopreservation, human pronuclear, pregnancy after cryopreservation

INTRODUCCION

Los procedimientos de Fertilización Asistida (FA), a pesar de ser altamente tecnológicos, logran un embarazo en aproximadamente el 30-40% de los casos, dependiendo de la edad del oocito y del procedimiento específico realizado (1-2). Es una técnica no exenta de complicaciones, siendo las principales el embarazo múltiple y el síndrome de hiperestimulación ovárica severo.

Los tratamientos de hiperestimulación ovárica con cualquier propósito, sean o no para FA, incrementan en 20 veces la posibilidad de gestación doble y hasta 400 veces las triples o más. Los embarazos múltiples son fuente de complicaciones tanto para los fetos como para las pacientes. Luego de la semana 20 de gestación hay mayor incidencia de RCIU, Desprendimiento prematuro de placenta, etc., y sobre todo de Parto Prematuro, con largas hospitalizaciones de los recién nacidos en unidades de terapia intensivas neonatales con elevada mortalidad y morbilidad. A esto se suma un elevado costo económico (3, 4, 5). Lo anterior, requiere de medidas por parte de la Unidades de Medicina Reproductiva que apunten a bajar la incidencia de embarazos múltiples, sin perder la eficiencia en el logro de embarazos. La criopreservación (CP) de embriones humanos se realizó por primera vez en 1983 por Trounson y Mohr (6), naciendo el primer niño en 1984. Existen reportes desde 1993, de programas de reproducción asistida utilizando la CP de pronúcleos (PN), como una alternativa para disminuir el número de embriones transferido en cada intento y optimizar los resultados por aspiración folicular, pudiendo realizar varias transferencias con un solo ciclo de estimulación (Veeck L. et al) (7). A nivel nacional, en 1999 se presenta el primer reporte (Pommer y col) (8), pero no se evalúa el impacto en la multigestación.

MATERIAL Y METODO

Se analizan 545 procedimientos de FA realizados entre marzo de 2000 y junio del 2003 en la Unidad de Medicina Reproductiva del Instituto de Investigaciones Materno Infantil (IDIMI) de la Facultad de Medicina, Campus de la Universidad de Chile y del Departamento y Servicio de Obstetricia y Ginecología del Hospital Clínico San Borja Arriarán. Los procedimientos analizados tienen dos orígenes, el primero es de pacientes beneficiarias, ya que este centro es de referencia nacional de Ministerio de Salud para pacientes beneficiarias del Fondo Nacional de Salud (FONASA), para procedimientos de FA, con un cupo de 75 pacientes anuales, las que pueden realizar un solo ciclo de estimulación ovárica. Cada procedimiento tiene una ficha clínica, en donde se consignan los datos biomédicos y resultados de cada uno de ellos. En diciembre de 2001 se implementa la CP de PN en nuestro centro. Todos los procedimientos que se realizan en la Unidad tienen un consentimiento informado firmado por ambos miembros de la pareja.

El diagnóstico etiológico de la infertilidad de la pareja, dictamina el procedimiento primario al cual es sometida, Fertilización In vitro (FIV), Inyección Intracitoplasmática de Espermio al Oocito (ICSI) o Transferencia de Gametos a la Trompa (GIFT). Se realizó estimulación ovárica con gonadotrofinas humanas (HMG) y/o FSH recombinante, más Análogos de GnRh o Antagonistas de GnRh.

La obtención de los oocitos se realizó mediante culdocéntesis bajo visión ecográfica directa con aguja doble lumen (CCD® G-16, France), a las 34 horas post administración 10.000 IU de HCG intramuscular. Los oocitos fueron fecundados en el laboratorio de FA y luego incubados en incubadoras THERMO FARMA® (Mod-3111) a 37° C con 5% CO2. A las 16-18 horas post inseminación se evaluó la fertilización y formación de PN. Los PN que se transferirían en fresco se cambiaron a medio de crecimiento y se criopreservaron los restantes. Criopreservación: La criopreservación, se realiza mediante la aplicación de criopreservantes para proporcionar al PN protección frente a los efectos de la temperatura, durante los procesos de congelación y descongelación (9). El método usado para la criopreservación es el congelamiento lento, con el uso combinado de crioprotectores (1.5 M 1,2 propanadiol) y no penetrantes (0.1 M sacarosa). Para lo anterior se utiliza un programa computacional y un congelador CRYOMED® que lleva la temperatura ambiente a _160° C, temperatura del Nitrógeno líquido en donde son almacenados (Figura 1). Cada PN está en una pajuela claramente identificada.



Figura 1. Proceso de criopreservación y almacenaje de PN.

Descongelamiento de PN: Se descongelan mediante un protocolo que permite regresar de -196° C a la temperatura ambiental en forma gradual, con un crioprotector externo (sacarosa) manteniendo el gradiente osmótico extracelular que previene la entrada de agua excesiva durante el retiro del crioprotector. Cuando el crioprotector ha salido completamente, el embrión se coloca en el medio de cultivo para que inicie su proceso de desarrollo (10).

Transferencia de pronúcleos criopreservados: Utilizamos la modalidad de ciclo medicado, dando dosis ascendentes de valerinato de estradiol oral, a partir del primer día del ciclo menstrual, con el objetivo de desarrollar un endometrio trilaminar con un espesor de 8 mm. El monitoreo ultrasonográfico, determina la ausencia de reclutamiento folicular y confirma el desarrollo endometrial para dar inicio a la administración de progesterona en dosis de 100 mg/24 horas vía intramuscular, desde 4 días antes de la transferencia. El laboratorio de FA, descongela los PN dos días antes de la transferencia, de tal forma de transferir un embrión con 6 a 8 blastómeras. A todas las pacientes con función ovárica, se les administra un análogo de GnRh (3,75 mg depot IM), en el día 20-22 de ciclo anterior, de tal forma que no exista reclutamiento folicular en el ciclo medicado para la transferencia (Figura 2). La transferencia al útero se realiza mediante un catéter ultra soft (CCD®, France), bajo visión ecográfica transabdominal. A los 12 días post transferencia, se realiza la determinación sanguínea de bHCG para confirmar embarazo bioquímico o no, y una ecografía en la semana 6 para determinar los embarazos clínicos. El soporte de estradiol y progesterona se mantiene hasta la semana 12 de gestación en el caso de embarazo.



Figura 2. Esquema de preparación endometrial.

RESULTADOS

En el año 2001, 4 parejas tienen la opción de CP, en el 2002, 129 parejas y hasta junio del 2003, 56 parejas. Noventa y siete parejas deciden CP (51,3%). El número de PN que se CP fue de 623, dando un promedio de 6,4 por pareja (Tabla I). Del total de PN CP, se han descongelado 166 sobreviviendo 134, un 80,7%. Clivaron a embrión 114 de ellos, un 85,1% (Tabla II). Se ha iniciado una preparación endometrial para recibir sus PN en 42 pacientes, 3 de ellas se cancelaron por no tener un endometrio óptimo. Se han transferido 39 pacientes con un total de 114 embriones, en promedio 2,9 embriones por paciente. De las 39 transferidas, se han obtenido embarazos clínicos (> de 6 semanas de gestación), en 12 de ellas (30,7%). Se han visualizado 13 sacos gestacionales, lo que implica una tasa de implantación del 11,4% (Tabla III). Once embarazos únicos y un gemelar. En cuanto a la técnica que originó el PN criopreservado que resultó en embarazo clínico luego de su transferencia, son de FIV 7 de 18 transferencias (38,8%), de ICSI 3 de 14 transferencias (21,4%) y de ovodonación 2 de 7 transferencias (28,5%). La opción de embarazo en fresco global de las pacientes, sin distingo de edad diagnóstico de origen, es de 31,2% para FIV (54 de 173 transferencias), en 30,6% de un ICSI (31 de 101 transferencias) y de 45,6% en ovodonación (21 de 46 transferencias). Hasta la fecha, de los 12 embarazos clínicos uno ha abortado. Los embarazos múltiples generados antes de contar con la CP de PN, año 2000 a diciembre del 2001, fueron 23% de doble, 7,6% triple y cuádruple un caso. Del 15 de diciembre de 2002 al 1 de junio de 2003 se redujo sustancialmente a doble 15,5%, triple 2,2% y la no existencia de cuádruples (Tabla IV).


Tabla I

PAREJAS QUE OPTAN POR CRIOPRESERVAR (CP) PRONUCLEOS


Período

Nº parejas con

Nº de parejas que

 

opción de CP

optan por CP


2001/diciembre

    4

  2

2002

129

66

2003/junio

  56

29


Total

189 (100%)

97 (51,3%)



Tabla II

DESCONGELACION DE PRONUCLEOS (PN)


 

n de PN

%


PN criopreservados

623

 

PN descongelados

166

 

PN sobreviven

134

80,7

PN clivan a embrión

114

85,1



Tabla III

TRANSFERENCIAS Y EMBARAZO EN PRONUCLEOS CRIOPRESERVADOS


 

n

%


Ciclos transferidos

 39

 

Embriones transferidos

114

 

Embarazos clínicos

  12 (12/39

30,7

 

 

 

Sacos gestacionales

  13

 

Tasa de implantación

  13/114

11,4



Tabla IV

EMBARAZOS MULTIPLES CON Y SIN CRIOPRESERVACION


Embarazos

Sin criopreservación

Con criopreservación

múltiples

(2000-2001)

(2002-jun 2003)


Doble

23%

15,5%

Triple

7,6%

2,2%

Cuádruple o más

2,3%

0%


DISCUSION

Los procesos vitales requieren cambios bioquímicos que se llevan a cabo a través del movimiento de moléculas en un medio acuoso. Si el agua, dentro del citoplasma de una célula viva es convertida en hielo a temperatura suficientemente bajas, se detiene el movimiento molecular, la vida de la célula queda detenida en ese momento, con la incorporación de los criopreservantes biológicos y sistemas computacionales que manejan el descenso de la temperatura, no hay formación de cristales de agua en un momento que puedan romper la célula (11).

Dentro de la criobiología humana, existe la posibilidad de criopreservar espermios, oocitos, pronúcleos (PN), embriones desde 2 células a blastocistos, tejido ovárico y testicular.

Pareciera lógico criopreservar espermios y oocitos separados. Los espermios no pierden su potencial, pero hay problemas marcados asociados a la congelación de oocitos que no han podido ser resueltos y que se traducen en una variable y reducida opción de fertilizar, clivar y dar un nacido vivo (12-13-14).

La opción de CP oocitos en estado de PN en nuestro centro, se genera de un criterio biológico y ético, en el primero, se sabe que entre las 17 y 22 horas postinseminación, el oocito está en fase G2 del primer ciclo celular, antes de la disolución de los pronúcleos que son visibles a la microscopia convencional, esto ocasiona la opción de un mínimo daño celular (10); en el segundo criterio, el comité de ética del hospital, consideró adecuado congelar en estado de preembrión, el cual es el oocito en estado de pronúcleo.

Se incorpora la técnica en diciembre de 2001, la criopreservación de pronúcleos con los objetivos de:

Disminuir al número de embriones a transferir al útero.
Disminuir el número de embarazo múltiples.

Postergar el momento de la transferencia embrionaria cuando no son óptimas las condiciones de endometrio o existir riesgo materno elevado de desarrollar un Síndrome de hiperestimulación ovárica severa.

Tener la posibilidad de intentos posteriores de transferencias embrionarias, sin tener que hiperestimular nuevamente a la paciente. Lo que implica una segunda oportunidad con menor costo económico y de estrés.

Implementar la técnica y desarrollarla en un hospital público es positivo, pone esta tecnología al alcance de una mayor población. Desde su incorporación en diciembre del 2001, se han aspirado 189 parejas que podían eventualmente criopreservar, ya que tenían más de 6 folículos. Efectivamente 97 de ellas deciden hacerlo, firmando el consentimiento informado pertinente, lo que representa un 51,3%. Se criopreservaron 623 PN, con un promedio de 6,4 PN por pareja, lo que está de acuerdo con el objetivo de dar una oportunidad posterior, ya que si se embarazan en la transferencia en fresco, pueden venir luego de su parto y lactancia por su segundo embarazo. De no lograrlo en fresco, post menstruación, pueden iniciar su preparación endometrial para una segunda oportunidad.

Se han descongelado 166 PN, sobreviviendo el 80,7% de ellos, con una tasa de clivaje a embrión del 85,1%, lo que está dentro de los estándares internacionales. Se realizaron 39 transferencias de embriones provenientes de PN CP (2,9 embriones por transferencia), dando una nueva opción de embarazo a pacientes que no han sido sometidas nuevamente a una hiperestimulación ovárica, con un costo económico y afectivo significativamente inferior, ya que los fármacos para la preparación endometrial son 1/10 del costo de un ciclo en fresco (HMG/FSH recombinante/HCG).

Para los pacientes beneficiarios de FONASA se les otorga una segunda oportunidad real, con beneficios evidentes, ya que el programa de gratuidad considera sólo un ciclo de hiperestimulación ovárica por paciente seleccionado, por una única vez en la historia.

De los 39 ciclos transferidos se lograron 12 embarazos clínicos (ecografía a las 6 semanas de gestación), un 30,7%, cifra muy superior a lo reportado en el contexto Latinoamericano (14%) y global chileno (18,4%) (1-2), creemos que esto se debe a la selección de pacientes, a la experiencia del equipo humano, ya que hay varios miembros del equipo que lo realizan desde 1995 en otro centro; lo altamente tecnológico de los equipos con que se cuenta y al tamaño de la muestra.

Permitió la reducción del número de embarazo múltiples desde su implementación, ya que se transfirieron 2,4 embriones en los ciclos frescos, versus 2,9 embriones por ciclo antes de diciembre de 2001, lo que ayudó a la reducción del número de embarazos múltiples en dobles del 23% al 15,5%, triples 7,6% al 2,2% y a la no generación de cuádruples.

Además de lo anterior, el contar con un programa de CP de PN, permite su uso como una herramienta terapéutica en pacientes con alto riesgo de desarrollar Síndrome de Hiperestimulación Ovárica Severa, pues se ha demostrad que la postergación de la transferencia de embriones para otro momento, baja considerablemente el riego vital de las pacientes, ya que un embarazo en ese ciclo, tiende a agravar la situación y a prolongarla en el tiempo (15).

En suma, las técnicas de reproducción asistida, siendo tecnológicamente sofisticadas y de un costo elevado, sobre todo por los fármacos requeridos para la hiperestimulación ovárica logran un embarazo entre el 30-40% de los casos (1-2). Esto representa que un 60-70% de las parejas no se embaraza al primer intento y por tanto buscará repetir el procedimiento. Por otra parte, el número de oocitos fertilizados no siempre permite predecir el número de PN aptos y por tanto se tiende a fertilizar mayor número de oocitos. Una vez generados los PN, cuando no existe la posibilidad de CP, se transfieren todos los que clivaron a embrión, porque no se hace descarte de PN. Tener la opción de CP estos PN permite bajar el número de PN por transferencia, reservando el resto para una transferencia posterior.

La CP en nuestra experiencia ha cumplido un rol importante en disminuir la incidencia de embarazos múltiples y permitir una segunda oportunidad de embarazo a toda nuestra población de pacientes sin el costo económico y afectivo que un ciclo de hiperestimulación ovárica implica.

BIBLIOGRAFIA

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DISCUSION

Dr. E. Fernández: Pregunta por la tasa de abortos en estos casos.

Dr. Zegers: Inquiere si el Comité de Etica permite que la pareja elimine los pronúcleos.

Dr. Herrera: Congratula al grupo de trabajo por la presentación porque representan el esfuerzo del ámbito público en los problemas de fertilidad, destaca que es el único servicio público en que se realiza fertilización in vitro.

Dra. Ruiz: Felicita al equipo.

Dr. Pommer: Responde que la tasa de aborto, en pacientes con criopreservación, es un 16%, en ICSI, un 17% y en FIV, un 14%.

El consentimiento es estricto y existen sólo dos opciones para los ovocitos, el uso en si misma o la donación.


*Trabajo de ingreso del Dr. Ricardo Pommer T., leído en la sesión del 18 de agosto de 2003 de la Sociedad Chilena de Obstetricia y Ginecología.

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