EXPRESIÓN DE FILAMENTOS INTERMEDIOS DURANTE EL DESARROLLO
EMBRIONARIO DE CERDO (Sus scrofa) Y BOVINO (Bos taurus).

INTERMEDIATE FILAMENTS EXPRESSION DURING EMBRYONIC DEVELOPMENT OF PIG
(Sus scrofa) AND BOVINE (Bos taurus)

*	Angel Rodríguez
*	Mariana A. Rojas
*	M. Angélica Montenegro
**	Javier Regadera

 

RODRÍGUEZ, A.; ROJAS, M. A.; MONTENEGRO, M. A. & REGADERA, J. Expresión de filamentos intermedios durante el desarrollo embrionario de cerdo (Sus scrofa) y bovino (Bos taurus). Rev. Chil. Anat., 18(2):237-244, 2000.

RESUMEN: Utilizando la técnica de inmunoperoxidasa y un panel de anticuerpos monoclonales, se realizó un estudio para caracterizar la expresión de citoqueratinas y vimentina, proteínas constituyentes de los filamentos intermedios, en los tejidos en diferenciación de embriones de cerdo y bovino, en diferentes etapas de la embriogénesis.

Ambas especies presentaron características similares en la expresión de citoqueratinas y vimentina. En los embriones prefetales, mayores de 18 mm de longitud cráneo-caudal, ya existe un patrón de citoqueratinas en la mayoría de las células epiteliales, ya que éstas se tiñeron intensamente con los anticuerpos antiqueratinas AE1/AE3 y AE1. En embriones menores, sólo reaccionaron moderadamente con estos anticuerpos, el mesonefros, tubo digestivo y epitelio celómico.

La vimentina aparece en embriones más pequeños en el endotelio vascular, en el mesonefros y en algunas células conectivas y del tubo neural. En embriones mayores, además, aparece inmunotinción con este anticuerpo, en el endocardio, dermis, plexos coroídeos, osteoblastos y odontoblastos. La citoqueratina 18 y los controles negativos de las inmunotinciones empleadas, no mostraron reacción positiva en ninguna de las estructuras embrionarias de ambas especies.

Nuestros resultados enfatizan la importancia de los filamentos intermedios, especialmente de las citoqueratinas, como marcadores de diferenciación de los tejidos embrionarios y sugieren que en aquellos órganos que comienzan a funcionar tempranamente en el embrión, como el mesonefros y la red vascular, el citoesqueleto se organiza más tempranamente.

PALABRAS CLAVE: 1. Citoqueratina; 2. Vimentina; 3. Filamentos intermedios; 4. Bovino; 5. Cerdo; 6. Desarrollo embrionario. INTRODUCCION

Los filamentos intermedios corresponden a una gran familia multigénica de proteínas fibrilares que incluyen las citoqueratinas, características de los epitelios (MOLL et al., 1982) y las vimentinas que son típicas de las células de origen mesenquimático (STEINER & ROOP, 1988), entre otras.

Las citoqueratinas (CK) constituyen el principal componente del citoesqueleto de las células epiteliales, donde forman un gran grupo de filamentos intermedios cuyo diámetro oscila entre 8 y 10 nm. Hasta el momento, se conocen 20 polipéptidos diferentes de queratinas (CK 1-20) que se caracterizan por su estabilidad y su baja solubilidad en tampones fisiológicos (MOLL et al.; SUN et al., 1985). Según su comportamiento bioquímico, se pueden clasificar en dos grupos (SUN et al.). Las de grupo I (CK 9-20), comprenden proteínas relativamente pequeñas, de bajo peso molecular y de punto isoeléctrico ácido, mientras que el grupo II (CK 1-8), está constituido por proteínas más grandes, con un altopeso molecular (56 a 67 kDa) y un punto isoeléctrico relativamente básico.

Los dos grupos de citoqueratinas se comportan como heteropolímeros obligados, es decir, se requiere un miembro de cada grupo para la formación de un filamento de queratina. Como consecuencia de esto, cada epitelio expresa por lo menos dos citoqueratinas diferentes, ya que generalmente, cada una de las queratinas ácidas se coexpresa con otra queratina básica específica, formándose pares de queratinas (CREWTHER et al., 1983; ROJAS et al., 1998; STEINER & ROOP). Por ejemplo, las CK 5 y 14 se encuentran juntas en todos los queratinocitos, la CK 1 y 10 están en los epitelios queratinizados, la CK 4 y 13 en epitelios estratificados no queratinizados y la CK 8 y 18 en epitelios simples (CREWTHER et al.).

En general, se ha establecido principalmente en los tejidos adultos de la especie humana, que las citoqueratinas de bajo peso molecular (40kDa) se encuentran en epitelios simples y glandulares, las de peso molecular intermedio en epitelios estratificados y las de alto peso molecular (67 kDa) en epitelios queratinizados.

En los epitelios simples sólo están presentes las queratinas 7, 8, 18 y 19 (BOSCH et al., 1988; SAWAF et al., 1991). En los epitelios glandulares, ductales, seudoestratificados, estratificados no queratinizados y en el urotelio se pueden expresar las CK 4, 6, 13, 15 y 17 (ROJAS et al.). Los epitelios ortoqueratinizados se caracterizan por la presencia de CK 1, 2, 10 y 11 que son específicas de la diferenciación tipo epidermis. Estas citoqueratinas se expresan bien en las células superiores del estrato poliédrico y en el estrato granuloso, pero están ausentes en el estrato basal y en las células profundas del estrato poliédrico (FUCHS & GREEN, 1980; MONTE-NEGRO et al., 1998).

Se ha demostrado que las citoqueratinas 6 y 16 se expresan en queratinocitos con alto recambio y las CK 5 y 14 son específicas de la estratificación expresándose en el estrato basal de los epitelios estratificados.

La vimentina es una proteina citoesqueletal, cuyo peso molecular es de 58 kDa y tiene 464 aminoácidos. En contraste con otros filamentos intermedios, la expresión de vimentina no está relacionada con un solo tipo celular (DUPREY & PAULIN, 1995). La vimentina se expresa ampliamente al inicio del desarrollo embrionario del ratón y puede ser detectada en tejidos originados tanto en el ectoderma como en el mesoderma, pero progresivamente su expresión se debilita y se va restringiendo a unos pocos tipos celulares. En la mayoría de los casos, los filamentos intermedios específicos de cada tejido, reemplazan a la vimentina en forma progresiva, aunque a veces se puede observar coexpresión de los dos tipos de filamentos intermedios en la misma célula (DUPREY & PAULIN).

El perfil de citoqueratinas de un epitelio se correlaciona positivamente con la complejidad del epitelio (JACKSON et al., 1981; TSENG et al., 1982). La expresión de citoqueratinas es en realidad el indicador más fundamental del estado de diferenciación de un epitelio, ya que otros indicadores de diferenciación proteicos, se expresan posteriormente al establecimiento de la expresión de citoqueratinas.

Las citoqueratinas más pequeñas, características de los epitelios simples, son las primeras que aparecen durante la embriogénesis. En el ratón, las CK más tempranas sintetizadas, son polipéptidos de composición muy simple equivalentes a las CK humanas 8 y 18. Más tarde en la embriogénesis, después del inicio del desarrollo de los órganos, se expresan los patrones específicos coordinadamente regulados, dando como resultado un patrón de CK epitelial fetal que es similar, pero no idéntico a los tejidos adultos (QUINLAN et al., 1985).

La expresión de filamentos intermedios se ha caracterizado en embriones de ratón. En etapas muy tempranas de la embriogénesis (hasta mórula), se detecta una baja expresión de CK 8 y 18. Esta expresión aumenta en el blastocisto, especialmente en el trofoblasto. La vimentina se detecta por primera vez en las células del mesoderma que se invaginan por la línea primitiva. La expresión de vimentina es intensa en células precursoras neurales y mesenquimáticas, en la notocorda, en los vasos sanguíneos y en la somatopleura y esplacnopleura. En células precursoras neurales, la vimentina es reemplazada progresivamente por neurofilamentos. En etapas tempranas, no se observa inmunoexpresión de vimentina en los somitos, ni en las estructuras cartilaginosas derivadas de los esclerotomos (JACKSON et al., DUPREY & PAULIN).

Debido a que el citoesqueleto media variadas funciones celulares durante el desarrollo embrionario y a que los filamentos intermedios que lo constituyen representan excelentes marcadores de diferenciación, nos propusimos estudiar la expresión de algunas citoqueratinas y de vimentina, durante el desarrollo embrionario de dos especies de mamíferos que presentan ventajas y constituyen buenos modelos para el estudio de los procesos del desarrollo: cerdo (Sus scrofa) y bovino (Bos taurus).

MATERIAL Y MÉTODO

En este estudio se utilizaron 12 embriones y fetos de bovino (Bos taurus) entre 10 y 80 mm de longitud cráneo-caudal (LCC) y 10 embriones y fetos de cerdo (Sus scrofa) cuya longitud cráneo-caudal fluctuaba entre 15 y 38 mm. Los embriones fueron colectados desde la Planta Faneadora "Lo Valledor", en Santiago. Su edad se estimó comparando la longitud cráneo-caudal y las características morfológicas externas según lo descrito por WINTERS et al., (1972). Varios autores utilizan este método para determinar la cronología de sus especímenes (NICHOLS, 1944; WARNER, 1958; BRYDEN et al., 1972; ROJAS et al., 1984; ROJAS & MONTENEGRO, 1994 y 1996). El método se justifica por la dificultad de obtener especímenes de edad conocida, sin recurrir a la laparotomía o al sacrificio de los animales.

Las muestras se fijaron en formol tamponado al 10%, se postfijaron en Dubosq-Brasil y se procesaron por el método histológico corriente que consiste en deshidratación en alcoholes ascendentes, impregnación e inclusión en parafina, cuidando de no exceder los 60 C para no alterar los antígenos del tejido.

Se realizaron cortes seriados de 5 µm, algunos de los cuales se tiñeron con hematoxilina-eosina-azul Alcián y con la técnica de Masson. Otros cortes se sometieron a la técnica de inmunoperoxidasa para identificar citoqueratinas y vimentina en los tejidos embrionarios, utilizando los siguientes anticuerpos:

- Anticuerpo monoclonal antipanqueratinas AE1-AE3, en una dilución de 1:200 (Sigma, Cocktail CK22). Este complejo de queratinas reconoce las queratinas ácidas y básicas (CK 1 a 19).

-Anticuerpo monoclonal AE1, en una dilución de 1:200 (Sigma, producto N C2562). Este anticuerpo es específico para identificar queratinas ácidas 10, 13, 14, 15, 16, 18 y 19. todo de avidina-biotina-peroxidasa, (HSU et al., 1981) y se procedió de la siguiente forma:

- Desparafinación de las muestras en baterías de xilol y posterior hidratación con alcoholes descendentes.

- Inhibición de la peroxidasa endógena del tejido con perhidrol al 3% (H₂O₂ al 3%).

- Digestión enzimática (tripsina al 0.1% en cloruro de calcio a pH 7.8).

- Bloqueo con suero de bovino no inmune, diluido 1:20 (Dako).

- Incubación con el anticuerpo primario, en cámara húmeda, utilizando las diluciones indicadas anteriormente.

- Incubación con el anticuerpo secundario (antisuero biotinilado) diluido 1:400 (Zymed).

- Incubación con estreptavidina­peroxidasa diluida 1:800 (Zymed).

- Revelado con diaminobenzidina (DAB).

- Tinción nuclear de contraste con Hematoxilina de Harris.

- Deshidratación, aclaramiento con xilol y montaje con entellán (Merck).

Entre cada paso se hicieron lavados con buffer fosfato (PBS) a pH 7.2, excepto entre el bloqueo con suero no inmune y el anticuerpo primario.

Para asegurar la especificidad de la reacción inmune, se realizaron controles positivos y negativos. Para el control positivo se utilizaron cortes de tejido que, se conoce, dan positiva la reacción con los anticuerpos primarios usados. Para el control negativo se utilizaron cortes adyacentes a los tratados con el anticuerpo primario y se sometieron a la misma técnica, con la excepción que el anticuerpo primario se reemplazó por suero de ratón no inmune (Dako). En estos casos no se observó reacción positiva.

RESULTADOS

De acuerdo a las características externas y al grado de diferenciación de los órganos, los embriones más tempranos estudiados de ambas especies, (hasta 35 mm LCC en cerdo y 40 mm LCC en bovino), corresponden al período prefetal. Los embriones de menos de 15 mm LCC aún presentaban arcos branquiales. Los especímenes mayores mostraron características fetales ya que han adquirido las características de la especie (Figs. 1 y 2).

Fig. 1. Corte sagital de embrión de cerdo de 18 mm LCC. Se observan esbozos de diferentes órganos. H&E, Azul de Alcián. 40X. Fig. 2. Corte sagital de embrión de bovino de 18 mm LCC. Se observan esbozos de diferentes órganos. H&E, Azul de Alcián. 40X.

Dependiendo de la edad gestacional, los anticuerpos antiqueratinas AE1/AE3 y AE1 reaccionaron con la mayoría de los tejidos epiteliales embrionarios, mostrando características similares en ambas especies.

En los embriones de bovino de 10 y 15 mm (LCC) y de cerdo de 15 mm LCC, se observó reacción positiva moderada con los anticuerpos AE1/AE3 y AE1 en la notocorda, en el epitelio cúbico simple del revestimiento celómico, en el epitelio prismático simple del tracto digestivo, incluyendo la faringe embrionaria, y de las vías biliar y pancreática, en los túbulos distales y colectores del mesonefros. En esta etapa la epidermis mostró reacción negativa con estos anticuerpos en esta etapa.

La inmunotinción de estas estructuras con estos anticuerpos fue intensa en embriones mayores de 18 mm LCC. Además, en estos embriones se observó reacción intensamente positiva en la epidermis, en el epitelio prismático que tapiza la tráquea y los esbozos bronquiales, en los acúmulos celulares del metanefros, en el oído interno y en el seno urogenital. La reacción fue más intensa en el citoplasma apical y periférico de las células epiteliales (Figs. 3 y 4).

Fig. 3. Inmunotinción de citoqueratinas AE1/AE3 en los primordios bronquiales (flechas) y en el epitelio celómico (puntas de flechas). Embrión de bovino de 18 mm LCC. 50X. Fig. 4. Inmunotinción de citoqueratinas AE1/AE3 en el epitelio del seno urogenital. Embrión de bovino de 18 mm LCC. 100X.

La epidermis presenta características diferentes dependiendo de la región. En la región cefálica, en el dorso y vientre del embrión, está constituida por un epitelio cúbico monoestratificado; en cambio, en la cara y región genital, el epitelio se presenta estratificado con un estrato basal formado por dos capas de células cúbicas y un periderma superficial de células planas. Todas las células epidérmicas de las distintas partes del cuerpo embrionario dieron reacción positiva con los anticuerpos AE1/AE3 y AE1, pero su expresión fue más intensa en el periderma (Figs. 5 y 6).

Fig. 5. Inmunotinción de citoqueratinas AE1/AE3 en la epidermis. Embrión de cerdo de 20 mm LCC. 400X. Fig. 6. Control negativo en corte adyacente al de la Fig. 5. Se observa tinción negativa en la epidermis.

En los fetos de cerdo y de bovino (40 mm LCC), el periderma está formado por varias capas de células planas, pero la epidermis aún no está queratinizada y presentó inmunotinción intensamente positiva, lo mismo que los esbozos del páncreas, el metanefros, el epitelio intestinal, y algunas células del timo. En los gérmenes dentarios, en la región apical de los ameloblastos se observó inmunotinción moderada con los anticuerpos antiqueratina AE1/AE3 y AE1 (Figs. 7, 8 y 9).

Fig. 7. Inmunotinción de citoqueratinas AE1/AE3 en ameloblastos (flechas). Feto de bovino de 80 mm LCC. 200X.

Fig. 8. Inmunotinción de citoqueratinas AE1/AE3 en el metanefros. Feto de bovino de 41 mm LCC. 100X. Fig. 9. Inmunotinción de citoqueratinas AE1/AE3 en el epitelio del tubo digestivo Embrión de cerdo de 31 mm LCC. 200X.

Con el anticuerpo antiqueratina 18, la reacción fue negativa en todas las estructuras embrionarias de ambas especies, en las diferentes edades estudiadas.

Con el anticuerpo antivimentina, se observó reacción positiva intensa en varias estructuras de los embriones más pequeños de ambas especies como, el endotelio y en los leiomioblastos de la pared de los vasos sanguíneos, en algunos fibroblastos del tejido conectivo y en los glomérulos del mesonefros. La expresión de vimentina fue moderada en el estroma del mesonefros y en la zona adluminal del sistema nervioso central (Figs. 10 y 11).

Fig. 10. Inmunotinción de vimentina en el endotelio de los vasos sanguíneos (flechas). Embrión de bovino de 15 mm LCC. 200X. Fig. 11. Control negativo en corte adyacente al de la Fig. 10. Se observa tinción negativa en el endotelio vascular.

En embriones prefetales de ambas especies (mayores de 18 mm LCC), además de las estructuras anteriores, se observó reacción positiva intensa con el anticuerpo antivimentina en el endocardio, en los plexos coroídeos, en la dermis de la piel y en los acúmulos celulares del metanefros (Fig. 12).

Fig. 12. Inmunotinción de vimentina en la dermis de la piel. Embrión de bovino de 15 mm LCC. 200X.

En los fetos de cerdo y de bovino, se observó intensa tinción positiva antivimentina en los odontoblastos de los gérmenes dentarios y en los osteoblastos presentes en las zonas de osificación (Figs. 13 y 14).

Fig. 13. Inmunotinción de vimentina en osteoblastos (flechas). Feto de bovino de 80 mm LCC. 200X. Fig. 14. Inmunotinción de vimentina en odontoblastos (flechas). Feto de bovino de 80 mm LCC. 200X.

En los controles negativos, no se observó reacción con ninguno de los anticuerpos utilizados.

DISCUSIÓN

El análisis de nuestros resultados muestra que los filamentos intermedios de citoqueratinas aparecen tempranamente en la vida embrionaria. En este estudio las evidencias de la expresión de queratinas se basaron principalmente en la reacción del anticuerpo antiqueratina AE1/AE3, que indica presencia de un grupo de citoqueratinas ácidas y básicas. Se ha demostrado que las citoqueratinas 8 y 18 aparecen primero durante la embriogénesis y son características de epitelios muy simples (QUINLAN et al.,). En nuestro estudio la CK 18 fue negativa ya que los embriones más pequeños estudiados corresponden al período prefetal, cuando ya se ha iniciado la diferenciación de los tejidos. En estos embriones prefetales, aparece expresión de CK con el anticuerpo AE1/AE3 en algunos epitelios embrionarios como el epitelio digestivo y celómico. Sin embargo, se observa que la inmunotinción va aumentando a medida que avanza la gestación. Así, en embriones del período fetal, la expresión de CK con el anticuerpo AE1/AE3 es más intensa y se extiende a la mayoría de los epitelios embrionarios.

En el ratón, los primeros filamentos intermedios se detectan en embriones preimplantacionales tempranos. Existe una baja expresión de CK 8 y 18 en la mórula y esta expresión aumenta en el blastocisto especialmente en el trofoblasto. En embriones de ratón postimplantacionales, se comienza a establecer un patrón de citoqueratinas en todos los epitelios embrionarios que es parecido, pero no idéntico al de los tejidos adultos (JACKSON et al., DUPREY & PAULIN).

La expresión de este tipo de filamentos intermedios de citoqueratinas es, generalmente, concomitante con la formación de uniones intercelulares del tipo desmosomas.

Otros filamentos intermedios, además de las cito-queratinas, no se expresan antes de la etapa de línea primitiva. La primera identificación positiva de la formación de vimentina se obtuvo en embriones de ratón de 9 días, ya que la mayoría de las células que constituyen los embriones preimplantacionales, son células epiteliales con típicos desmosomas asociados a filamentos intermedios de citoqueratinas ((JACKSON et al., DUPREY & PAULIN). Las células embrionarias expresan primero filamentos de CK y más tarde empiezan a expresar vimentina.

Se ha observado una fuerte expresión de vimentina en las células mesenquimáticas y precursoras neurales en los embriones de ratón postimplantacionales tempranos. La vimentina se va expresando en distintos tejidos, a medida que progresa el desarrollo entre los 9 y 14 días post coito. La vimentina aparece en vasos sanguíneos, somatopleura, esplacnopleura, corazón, mesénquima cefálico, mesénquima intestinal, hepático y renal, ganglios espinales, ganglios simpáticos, médula espinal. De este modo, la vimentina se expresa ampliamente primero y progresivamente se va restringiendo a unos pocos tipos celulares (DUPREY & PAULIN).

En nuestro estudio, las observaciones con el anticuerpo antivimentina, están de acuerdo, en general, con lo descrito en embriones de ratón del período prefetal. En embriones prefetales de bovino y cerdo, se observa reacción vimentina positiva en la pared de los vasos sanguíneos, dermis de la piel, endocardio, fibroblastos del tejido conectivo en general, osteoblastos, odontoblastos y zona adluminal del sistema nervioso central.

En vertebrados no todos los órganos inician simultáneamente su función. Por ejemplo, el mesonefros ya es activo en embriones de cerdo de 7 mm LCC (TIEDEMANN, 1983), los vasos sanguíneos y la sangre aparecen muy tempranamente en el desarrollo y el corazón inicia sus latidos a principios de la 4 semana en el embrión humano. Sin embargo, la formación del tegumento externo en general, es mucho más tardío. Nuestras observaciones nos muestran que aquellos órganos que empiezan a funcionar más tempranamente en el embrión, desarrollan precozmente su citoesqueleto. En los embriones de cerdo y bovino menores de 15 mm LCC, la pared vascular mostró una reacción positiva intensa para la vimentina y en el mesonefros la inmunotinción fue muy marcada tanto para vimentina como para las citoqueratinas.

El perfil de citoqueratinas de un epitelio está relacionado con el estado de su diferenciación y desarrollo (FUCHS & GREEN, OUELLET et al., 1986, NAGLE, 1988). Los filamentos intermedios constituyen excelentes marcadores de la diferenciación de los tejidos (COWIN & BURKE, 1996). Las observaciones realizadas en este estudio durante el desarrollo de bovino y cerdo, indican que los filamentos intermedios de citoqueratinas y vimentina aparecen en embriones prefetales y se establecen más marcadamente en embriones del período fetal, en forma similar a lo descrito en embriones de ratón, por lo cual estas dos especies, constituyen modelos adecuados para estudios del desarrollo embrionario de mamíferos.

SUMMARY: Using immunoperoxidase technique, an established panel of antibodies was used to characterise the cytokeratin and vimentin intermediate filaments profile of tissues from bovine and pig embryos, in different stages of development.

Both species presented similar characteristics in cytokeratin and vimentin expression. In prefetal embryos, a pattern of keratin is established in most of the epithelial cells. These epithelial cells were intensely stained with the antikeratin antibodies AE1/AE3 and AE1. In embryos smaller than 18 mm crown-rump length, there was only a weak immunoreaction with these antibodies in the mesonephros, in the intestinal tract and, in the coelomic epithelium. In these embryos, the immunostain with antivimentin antibody was positive only in vascular endothelium, in the mesonephros and, in some mesenchymal cells.

No histological tissues were positive to the antikeratin 18 antibody in both species, at the stages studied. No positive staining was observed in the negative controls of immunostains for different antibodies employed in this work.

The different pattern of cytokeratins are related to the degree of differentiation of immature epithelial cells. Our results emphasizes the importance of intermediate filaments, mainly cytokeratins, as useful markers of embryonic tissue differentiation, and suggest that in those organs that begin their function early in development, like the mesonephros and vascular system, the cytoskeleton organizes earlier in the embryonic life.

KEY WORDS: 1. Cytokeratins; 2. Vimentin; 3. Intermediate filaments; 4. Pig; 5. Bovine; 6. Embryonic development. ^* Programa de Morfología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.
^** Departamento de Morfología, Facultad de Medicina, Universidad Autónoma de Madrid. España.
 

Dirección para correspondencia:
Prof. Dr. Angel Rodríguez
Independencia 1027, casilla 70079,
Santiago 7, CHILE
Fax 56 - 2 - 678 6264

E-mail: arodrigu @machi.med.uchile.cl

Recibido : 03-07-2000
Aceptado: 02-09-2000

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