CARACTERISTICAS CITOQUIMICAS MORFOLOGICAS Y ULTRAESTRUCTURALES DE EOSINOFILOS DE Caiman crocodilus yacare (Daudin, 1802) (Reptilia, Crocodilia)

MORPHOLOGICAL AND ELETRONIC CYTOCHEMISTRY OBSERVATIONS IN EOSINOPHIL IN Caiman crocodilus yacare
(Daudin, 1802) (Reptilia, Crocodilia)

 

*	Luiz Waldemar Oliveira
**	Weber Leal de Moura
***	Eliana Reiko Matushima
*	Mizue Imoto Egami

OLIVEIRA, L.W.; MOURA, W.L.; MATUSHIMA, E.R. & EGAMI, M.I. Características citoquímicas morfológicas y ultrestructurales de eosinófilos de Caiman crocodilus yacare (Daudin, 1802) (Reptilia, Crocodilia). Rev. Chil. Anat., 16(2):245-254, 1998.

RESUMEN: Muestras de sangre periférica de reptiles, jóvenes y sanos, fueron recolectadas del seno venoso cervical, en tubos que contenían EDTA 10%. Inmediatamente los frotis fueron sometidos a los siguientes procedimientos:

a) Tinción con solución de Rosenfeld para el análisis morfológico. b)Detección de la fosfatasa alcalina con naftol AS-MX fosfato y mieloperoxidasa (pH 7,0 y pH10,0) con o-toluidina H₂0₂. Una parte de la sangre con EDTA fue centrifugada por 15' a 2.000rpm y el coágulo conteniendo los leucocitos, fue dividido en dos fragmentos y tratados con: a) glutaraldehído a 2% (1h a 4ºC) para la reacción de la fosfatasa alcalina; b)glutaraldehído a 1,25% + paraformaldehído al 1% (1h 4ºC), para la reacción de la mieloperoxidasa.

Los eosinófilos revelaron núcleo excéntrico redondeado, oval o lobulado con nucléolo prominente. El citoplasma de los eosinófilos es ocupado por gránulos eosinofílicos evidentes (grandes, aproximadamente esféricos, compactos, uniformes en tamaño). No fue observada actividad de la fosfatasa alcalina en eosinófilos. Una reacción positiva débil en pH 7,0 y fuerte en pH 10,0, para mieloperoxidasa fue visualizada como un precipitado marrón, en los eosinófilos. El microscopio electrónico reveló actividad de la mieloperoxidasa solamente en algunos gránulos en pH 7,0 y en la mayoría de los gránulos en pH 10,0. Proteínas básicas produjeron reacción visible, principalmente en la periferia de todos los gránulos citoplasmáticos de los eosinófilos.

PALABRAS CLAVE: 1. Caimán; 2. Eosinófilo; 3. Citoquímica. 4. Citoquímica ultraestructural.

INTRODUCCION

Los animales de la especie Caiman crocodilus son encontrados desde América Central hacia América del Sur, más especificamente en el sudoeste de México hacia el noroeste de Argentina (GRZIMEK, 1975).

Hasta un poco tiempo atrás no había mucho interés científico sobre la morfología de las células de la sangre de los cocodrilos y "alligators". Por este motivo son escasos los artículos en la literatura específica. Actualmente, el creciente valor económico de las especies de la Familia Crocodilidae, así como estudios filogenéticos, despertaron interés en investigaciones en estos animales.

Trabajos sobre hematología, realizados en reptiles pertenencientes a otras órdenes, fueron encontrados en la literatura. PIENAAR (1962), con reptiles de Africa del Sur, incluyendo el Crocodilus niloticus, publicó estudios sobre la citología de la sangre; HELMY, YAEGER & HACK (1969) con Kinosternon subrubrum, Pseudemys scripta elegans, Amyda ferox hartwegi, Gopherus berlandieri, Terrapene carolina carolina y Chelydra serpentina, realizaron estudios citoquímicos; KELÉNY & NÉMETH (1969) con Lacerta agilis y Emys orbicularis, EFRATI, NIR & YAARI (1970) con Agama stellio, realizaron estudios morfológicos y citoquímicos; SAINT-GIRONS (1970) con varios reptiles, estudió la morfología; DUGAY (1970) de varios reptiles, estudió los parámetros hematológicos; CAXTON-MARTINS (1977) con reptiles africanos y CAXTON-MARTINS & NGANWUCHU (1978) con Agama agama, realizaron estudios morfológicos y citoquímicos; DESSER (1978 y 1979) y DESSER & WELLER (1979) con Sphenodon punctatus, realizaron estudios citoquímicos, morfológicos y ultraestructurales; ZAPATA, LECETA & VILLENA (1981) con Lacerta hispanica, estudiaron la morfología; EGAMI & SASSO (1988) con Bothrops jararaca, realizaron observaciones morfológicas y citoquímicas; AZEVEDO & LUNARDI y LUNARDI & AZEVEDO (1995) con Chrisemys dorbigni, detectaron la actividad de la mieloperoxidasa y de la fosfatasa alcalina en eosinófilos.

Algunos trabajos realizados con especies de la orden Crocodilia fueron encontrados en la literatura. Uno de los más antiguos trabajos fue el realizado por REESE en 1917, con sangre periférica de Alligator mississipiensis, que se refiere a la descripción morfológica de células de la sangre. PIENAAR (1962) en Crocodilus niloticus, estudió la morfología de todas las células de la sangre. MATEO, ROBERTS & ENRIGHT en 1984, trabajando con sangre periférica del mismo Alligator mississipiensis, realizaron un análisis morfológico de todas las células sanguíneas. Los autores detectaron, a través de la microscopía de luz, la presencia de la fosfatasa alcalina y de la mieloperoxidasa en los eosinófilos, que presentaron pronunciada actividad.

Trabajos relativos al estudio de la sangre, en lo que se refiere a los diferentes tipos celulares circulantes de Caiman crocodilus yacare, son raros en la literatura. Pero, recientemente, han sido realizados estudios de los aspectos morfológicos de las células sanguíneas de este animal por MOURA et al. (1998), a través de extensiones de la sangre periférica. En este trabajo los autores demostraron la presencia en eosinófilos de glucógeno, lípidos, proteínas en general y mieloperoxidasa . Los aspectos ultraestructurales de eosinófilos de este mismo animal fueron estudiados por MOURA et al. (1998).

La distinción morfológica de las células sanguíneas, principalmente en lo que respeta al diagnóstico diferencial de eosinófilos, es importante en estudios realizados sobre la determinación de valores hematológicos, entre los cuales se incluye el conteo diferencial de leucocitos, cuando las características morfológicas constituyen datos fundamen-tales para la obtención de resultados más precisos (PIENAAR, 1962; DUGAY, 1970; DESSER, 1979; GARCIA et al., 1993 y TROIANO & ALTAHUS, 1994).

En cuanto al diagnóstico morfológico diferencial entre los tipos de leucocitos granulocitos, la literatura es muy controvertida. CANNON (1992) trabajando con Lepidochelys kempi, encontró solamente un tipo de leucocito granulocito, lo denominó eosinófilo, sin relatar la presencia de heterófilos en la sangre periférica de estos animales. SAINT GIRONS (1970) describió la presencia de granulocitos no basófilos, siendo un eosinófilo con gránulos esféricos y otro con gránulos cilíndricos. ZAPATA et al. (1981) describieron la presencia de dos tipos de gránulos en el citoplasma de los leucocitos granulocitos de Lacerta hispanica, mientras que EFRATI et al. (1970), dividió los leucocitos granulocitos de Agama stellio en basófilos, granulocitos con gránulos citoplasmáticos desiguales y granulocitos con gránulos citoplasmáticos esféricos, no atribuyendo denominación específica a los dos últimos. KELÉNY & NÉMETH (1969) con reptiles (Lacerta agilis y Emys orbicularis), DESSER (1978) con Sphenodon punctatus, MATEO et al. (1984) con Alligator mississipiensis, EGAMI & SASSO (1988), con Bothrops jararaca, ALLEMAN et al. (1992), con Gopherus agassizii, AZEVEDO & LUNARDI y LUNARDI & AZEVEDO con Chrysemis dorbignih y MOURA et al. (1997 y 1998) con Caiman crocodilus yacare relataron la existencia en la sangre de los animales estudiados, de eosinófilos, como células esféricas, presentando núcleo esférico u oval, en posición excéntrica, con muchos gránulos citoplasmáticos esféricos u ovales, coloreados en rosado.

Así, AZEVEDO & LUNARDI con Chrysemis dorbignih, observaron reación fuerte en eosinófilos en pH alcalino y reación fuerte en heterófilos en pH neutro. La mieloperoxidasa fue detectada en pH neutro, en gránulos citoplasmáticos de eosinófilos de Sphenodon punctatus (DESSER, 1978), de Alligator mississipiensis (MATEO et al., 1984), de Agama stellio (EFRATI et al., 1970), Lepidochelys kempi (CANNON, 1992), Gopherus agassizii (ALLEMAN et al., 1992) y Caiman crocodilus yacare (MOURA et al., 1998). Por otro lado, CAXTON­MARTINS & NGANWUCHU en Agama agama detectaron la actividad de la mieloperoxidasa en los gránulos citoplasmáticos de leucocitos granulocitos, sin definir exactamente en que tipo de ellos.

LUNARDI & AZEVEDO observaron actividad de fosfatasa alcalina en gránulos específicos en eosinófilos de sangre periférica de Chrisemys dorbignih. Por otra parte, HELMY et al. (1969) con seis especies de tortuga, CAXTON-MARTINS (1977 y 1978) con reptiles africanos y CAXTON-MARTINS & NGANWUCHU con Agama agama, no especificaron en cuál tipo de leucocito granulocito fue encontrada la actividad de fosfatasa alcalina, mientras que CANNON (1992), trabajando con sangre periférica de Lepidochelys kempi, detectó actividad de fosfatasa alcalina en los gránulos citoplasmáticos de grandes eosinófilos. En el único trabajo hecho con cocodrilos, MATEO et al., detectaron fosfatasa alcalina en el citoplasma de eosinófilos de Alligator mississipiensis.

De un modo general, fueron detectadas proteínas en leucocitos granulocitos de Agama stellio (EFRATI et al., 1970) y en eosinófilos de Bothrops jararaca (EGAMI & SASSO, 1988) y Caiman crocodilus yacare (MOURA et al. 1998).

Ante lo expuesto y considerando que en el estudio hematológico, específicamente de la especie Caiman crocodilus yacare, los datos no son completos, decidimos complementar lo referente a los aspectos morfológicos, utilizando nuevos métodos de coloración diferentes de los de nuestros trabajos anteriores (MOURA et al., 1997 y 1998) y aplicando otras reacciones citoquímicas en extensiones y en bloque para caracterizar eosinófilos de sangre circulante de este cocodrilo.

Creemos que, con el desarrollo de este trabajo, podemos contribuir con nuevos datos para la mejor comprensión de la hematología comparada y de las relaciones filogenéticas entre reptiles y otras órdenes de vertebrados.

MATERIAL Y METODO

Utilizamos seis ejemplares jóvenes, sin definición de sexo, del cocodrilo de la especie Caiman crocodilus yacare (Reptilia, Crocodilia), conocido popularmente como jacaré del pantanal, oriundos del Municipio de Cáceres, en el Estado de Mato Grosso do Sul, Brasil, mantenidos en cautiverio. Fueron extraídos 5ml de sangre de cada animal. Los frotis sanguíneos fueron teñidos con el método de ROSENFELD (1947 a y b).

Fueron detectadas fosfatasa alcalina, por el método del Naftol AS-MX-fosfato, según ACKERMAN modificado, 1962 y mieloperoxidasa por el método de la Orto-toluidina- peróxido de hidrógeno modificado según JACOBS, 1958. La detección de fosfatasa alcalina fue hecha con el método modificado de ROBINSON y KARNOVSKY, 1983. Para la detección ultraestructural de la mieloperoxidasa, se aplicó el método de OHMORI et al., 1996 y para proteínas básicas el método de GORDON y BENSCH, 1968. En todos los métodos enzimáticos utilizados, se hace control de especificidad omitiéndose el sustrato.

RESULTADOS

El núcleo de los eosinófilos en su mayoría, presen-taba forma redondeada, mientras que algunos eran ovales. El citoplasma era abundante, conteniendo una gran cantidad de gránulos citoplasmáticos, distribuidos homogéneamente. Los gránulos citoplasmáticos se presentaron, en general, esféricos, de tamaños variados, pudiendo encontrarse gránulos ovales y raramente en forma de huso. Generalmente, los gránulos citoplasmáticos esféricos más pequeños presentaron coloración rosada y los más grandes una coloración más intensa (Fig. 1). El núcleo era de color violeta, mayoritariamente oval, pudiendo algunas veces presentarse lobulado, con cromatina laxa y nucléolos, ocupando entre un tercio y un quinto del volumen celular, estando por lo general situado en posición excéntrica (Fig. 2).

Fig. 1. Fotomicrografía de frotis de sangre periférica mostrando, al centro, un leucocito del tipo eosinófilo, con gránulos citoplasmáticos redondeados. Además se observan algunos eritrocitos. Método de Rosenfeld. Aumento de 1.650x.

Fig. 2 - Fotomicrografía de frotis de sangre periférica mostrando algunos leucocitos. En el centro se observa un eosinófilo (flecha vacía), con núcleo periférico y reacción negativa para la fosfatasa alcalina. Método del Naftol AS-MX fosfato, coloración nuclear con rojo neutro. Aumento de 1650x.

Los eosinófilos sometidos a reacción a través de la Orto-toluidina-peróxido de hidrógeno para la detección de la mieloperoxidasa, incubados en medio de pH 7,0, presentaron solamente en pocos gránulos citoplasmáticos una reacción positiva y débil, bajo la forma de un precipitado de color castaño claro, y negativa en la mayoría de los gránulos (Fig. 3). En medio de pH 10,0 presentaron, en algunos gránulos citoplasmáticos, una reación positiva más acentuada, bajo la forma de un precipitado de color castaño, y parte de sus gránulos no demostró reactividad (Fig. 4).

Fig. 5. Micrografía electrónica de leucocito granulocito del tipo eosinófilo de sangre periférica, después de la reacción citoquímica para la detección de la mieloperoxidasa, en pH 7,0. Se diferencian gránulos citoplasmáticos con reacción positiva (P) de los que presentan reación negativa (flechas). N - núcleo. Aumento de 10.400x.

Fig. 6. Micrografía electrónica de leucocito granulocito del tipo eosinófilo de sangre periférica, después de la reacción citoquímica para la detección de la mieloperoxidasa en pH 10,0. Es posible observar gránulos citoplasmáticos con reacción positiva (P) y gránulos citoplasmá-ticos con reacción negativa (flechas). N - núcleo. Aumento de 7.200x.

Ultraestructuralmente, la reacción positiva para proteínas básicas, se mostró en la mayoría de los gránulos citoplasmáticos. Los gránulos citoplasmáticos de los eosinófilos presentaron reacción positiva restringida a una estrecha faja electrondensa en la periferia y otros gránulos citoplasmáticos con un grosor más variable. Fue posible observar también, que algunos gránulos presentaron poca electrodensidad, pero más homogénea (Fig. 7).

Fig. 7. Micrografía eletrónica de leucocito granulocito del tipo eosinófilo, después de la reacción citoquímica para la detección de proteínas básicas. Se observan gránulos citoplasmáticos con reacción positiva predominante en la periferia (P), y gránulos citoplasmáticos esféricos de electrodensidad homogénea y débil (flecha). N - núcleo. Aumento de 15.700x.

DISCUSION

La preferencia por la sangre periférica de la especie Caiman crocodilus yacare para este trabajo, fue motivada por la escasez de datos referentes a los aspectos citoquímico y citoquímico-ultraestructural en la literatura específica, a pesar de los resultados obtenidos por nosotros en trabajos ya realizados (MOURA et al., 1997 y 1998). La elección de los leucocitos granulocitos eosi-nófilos, se dio en razón de la dificuldad encontrada por algunos autores en diferenciar morfológicamente estas células en determinados vertebrados inferiores (KELÉNY & NÉMETH, 1969; LUNARDI & AZEVEDO y AZEVEDO & LUNARDI).

En relación a la identificación de los leucocitos granulocitos, en la morfología y en las propiedades de tinción, pudimos observar que en la literatura existe una cierta dificuldad para la caracteriza-ción de eosinófilos.

CANNON, trabajando con Lepidochelys kempi, encontró solamente un tipo de leucocito granulocito que fue denominado eosinófilo, sin ser relatada la presencia de heterófilos en la sangre periférica. SAINT GIRONS describió la presencia de granulocitos designados como no basófilos, representados por eosinófilos con gránulos esféricos y con gránulos cilíndricos. ZAPATA et al. describieron la presencia de dos tipos de gránulos en el citoplasma de los leucocitos granulocitos de Lacerta hispanica, mientras que EFRATI et al., clasificaron los leucocitos granulocitos de Agama stellio en basófilos, granulocitos con gránulos citoplasmáticos irregulares y granulocitos con gránulos citoplasmáticos esféricos, sin dar una denominación específica para los mismos. Tal descripción es semejante a las características encontradas por nosotros en los leucocitos granulocitos del Caiman crocodilus yacare, los cuales fueron denominados heteró-filos y eosinófilos. Los dos tipos presentaron formas que variaron de redondeadas hasta ovales, con una gran cantidad de gránulos citoplasmáticos, mientras que en los eosinófilos la mayoría de los gránulos presentó forma esférica, con coloración rosada a rosada oscura. El núcleo, coloreado violeta, frecuentemente con presencia de nucléolos, algunas veces se presentó lobulado. Resultados semejantes a los obtenidos por nosotros, fueron observados por KELÉNY & NÉMETH en Lacerta agilis y Emys orbicularis, DESSER (1978) en Sphenodon punctatus, EGAMI & SASSO, en Bothrops jararaca, ALLEMAN et al. en Gopherus agassizii y AZEVEDO & LUNARDI y LUNARDI & AZEVEDO, en Chrysemis dorbignih.

La coloración presentada por los gránulos citoplasmáticos después de la utilización del May-Grunwald-Giemsa se diferenció levemente de aquellas obtenida con otras mezclas tipo Romanovsky. A pesar de esta pequeña diferencia, las denominaciones de heterófilo y eosinófilo son realmente las que más se encuadran para designarlas, principalmente cuando los datos obtenidos fueron comparados a los de MATEO et al. en Alligator mississipiensis y a los de MOURA et al. (1998) en Caiman crocodilus yacare, en los cuales los autores, después del uso de mezclas tipo Romanovsky, describieron que eosinófilos tendrían forma oval o redondeada, núcleo lenticular u oval, excéntrico, y gránulos citoplasmáticos, predominantemente esféricos coloreados en rosado.

En relación a la localización de la fosfatasa alcalina, LUNARDI & AZEVEDO la detectaron en eosinófilos de sangre periférica de Chrisemys dorbignih. HELMY et al. con seis especies de tortuga, CAXTON-MARTINS (1977 y 1978) con anfíbios y reptiles africanos y CAXTON-MARTINS & NGANWUCHU con Agama agama no especificaron en cuál tipo de leucocito granulocito fue encontrada su actividad. Por otro lado, DESSER, con Sphenodon punctatus, no detectó actividad de la enzima en ningun leucocito granulocito, mientras que MATEO et al. (1984), detectaron la fosfatasa alcalina en el citoplasma de eosinófilos y heterófilos de Alligator mississipiensis, y CANNON trabajando con sangre periférica de Lepidochelys kempi, detectó en los gránulos citoplasmáticos de grandes eosinófilos.

La presencia de la mieloperoxidasa en pH aproxima-damente neutro fue detectada en los gránulos citoplasmáticos en eosinófilos de Caiman crocodilus yacare (MOURA et al., 1998), presentándose como un precipitado de color castaño. Fue confirmada su presencia en este trabajo en varios gránulos citoplasmáticos, los cuales se presentaron con acentuada electrodensidad en la microscopía electrónica en pH 7,0 y pH 10,0. Pudimos observar que los gránulos de los eosinófilos presentaron una positividad más acentuada en pH 10,0, tal como fue observado por AZEVEDO & LUNARDI en leucocitos de Chrysemis dorbignih. La mieloperoxidasa además fue encontrada en gránulos citoplasmáticos de eosinófilos de Agama stellio (EFRATI et al.), Lepidochelys kempi (CANNON) y Gopherus agassizii (ALLEMAN et al.). Por otro lado, CAXTON-MARTINS (1978) en reptiles africanos y CAXTON­MARTINS & NGANWUCHU en Agama agama, detectaron la actividad de la mieloperoxidasa en los gránulos citoplasmáticos de leucocitos granulocitos, sin definir exactamente en cuál tipo de ellos.

En lo que se refiere a la identificación de proteínas, fueron detectadas en leucocitos granulocitos de Agama stellio (EFRATI et al.), en eosinófilos de Bothrops jararaca (EGAMI & SASSO), y de Caiman crocodilus yacare (MOURA et al., 1998). Estos resultados fueron confirmados en este trabajo, cuando identificamos proteínas catiónicas en los gránulos de eosinófilos.

Considerando nuestros resultados, los cuales de alguna manera resultaron útiles para una mejor caracterización de los granulocitos eosinófilos de la sangre circulante de Caiman crocodilus yacare, entendemos que estudios más específicos, como la aplicación de métodos inmunocito-químicos y bioquímicos, y la aplicación de métodos para determinar la función de estas substancias, ayudarían a elucidar dudas y a entender la filogénesis de la especie en estudio.

OLIVEIRA, L.W.; MOURA, W.L.; MATUSHIMA, E.R. & EGAMI, M.I. Morphological and electronic cytochemistry observations in eosinophil in Caiman crocodilus yacare (Daudin, 1802) (Reptilia, Crocodilia). Rev. Chil. Anat., 16(2):245-254, 1998.

SUMMARY: Samples of peripheral blood from healthy young reptiles were collected from the cervical venous sinus in tubes containing EDTA 10%. Freshly prepared smears were used for the following purpuses:

a) Staining in Rosenfeld solution for the morphological analyses.

b) Detection of alkaline phosphatase with naphthol ASMX-phosphate and myeloperoxidase (pH 7,0 and pH10,0) with o-toluidine H₂0₂.

The same blood samples with EDTA were centrifuged for 15' at 2,000rpm and the buffy coat containing leukocytes was devided in two fragments and one of them treated with glutaraldehyde (1h at 4C) and used for alkaline phosphatase reaction and the other 1,25% glutaraldehyde + 1% paraformaldehyde (1h 4C) and used for myeloperoxidase reaction.

The eosinophils revealed round, oval or lobed eccentric nuclei with prominent nucleoli. The cytoplasm of eosinophils is dominated by striking eosinophilic granules (large, nearly spherical, closely packed, uniform in size). No alkaline phosphatase activity was observed in the eosinophils. A positive reaction for myeloperoxidase (faint at ph 7,0 an strong at pH 10,0) was visualized as a brown precipitate in the eosinophils. EM observation revealed myeloperoxidase activity only in a few granules (at pH 7,0) and in a majority of the granules (at pH 10,0). Basic protein reaction product is visible essentially at the periphery of all the citoplasmic granules in the eosinophils.

KEY WORDS: 1. Caiman crocodilus yacare; 2. Eosinophil; 3. Cytochemistry; 4. Citochemical ultrastructure.

* Disciplina de Histología, Depto. de Morfología, UNIFESP/EPM, São Paulo, Brasil.
** Disciplina de Hematología, Depto. de Medicina, UNIFESP/EPM, São Paulo, Brasil.
*** Disciplina de Patología, Depto. de Patología,USP/FMVZ, São Paulo, Brasil.

Dirección para correspondencia:
Prof. Dr. Luiz Waldemar Oliveira
A/C Mizue Imoto Egami
Av. 11 de junho, 1291 - Apto. 193 - Vila Clementino
04041-054 - São Paulo - SP - BRASIL

e-mail: webermoura.dmed@epm.br

Telefax: 55-(011)576-4271 - Trabajo
55-(011)576-4268 - Trabajo
55-(011)570-1771 - Residencia

Recibido : 18-11-1998
Aceptado : 03-12-1998

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