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Revista chilena de historia natural

versión impresa ISSN 0716-078X

Rev. chil. hist. nat. v.74 n.4 Santiago dic. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-078X2001000400001 

Variación estacional y potencial enzimático de microhongos asociados
con la descomposición de hojarasca de Nothofagus pumilio

Seasonal variation and enzymatic potential of microfungi associated
with the decomposition of Nothofagus pumilio leaf litter

EDUARDO VALENZUELA1, SERGIO LEIVA1 & ROBERTO GODOY2

Instituto de Microbiología1, Instituto de Botánica2, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile, Casilla 567, Valdivia, Chile; e-mail: evalenzu@uach.cl

RESUMEN

Se estudió la variación estacional y el potencial enzimático de microhongos aislados desde el follaje y hojarasca de Nothofagus pumilio sometida a degradación natural durante 1 año. La investigación se realizó en un bosque de N. pumilio ubicado en una microcuenca del Valle de Antillanca, Parque Nacional Puyehue (40° 47' S, 72° 12' O, 1.120 m de altitud). Hojas senescentes colectadas desde árboles de N. pumilio se depositaron en bolsas de malla de nylon ("litter bags") y se sometieron a degradación natural en el piso del bosque durante 1 año (marzo 1997-marzo 1998), realizando muestreos trimestrales. Para el aislamiento de microhongos desde las hojas se utilizó el método de las diluciones, con agar extracto de malta al 2 % como medio de cultivo. Para determinar los potenciales degradativos de los aislamientos, se analizaron in vitro las actividades de amilasa, celulasa, pectinasa, proteasa, lacasa, oxidasa extracelular, peroxidasa, citocromo oxidasa, fosfatasa, esterasa y tirosinasa. Las principales especies aisladas en las hojas senescentes fueron Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, Epicoccum nigrum, Phialophora grupo hoffmannii y Rhodotorula aurantiaca. Las especies dominantes en la hojarasca fueron Hormonema prunorum, Mortierella ramanniana var. angulispora, Penicillium para-herquei y Trichoderma polysporum. El mayor potencial enzimático lo exhibieron Moniliales y micelios estériles, mientras el menor Sphaeropsidales y levaduras. Las especies más activas fueron Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, Hormonema prunorum y Phialophora malorum. Las actividades de celulasa y amilasa fueron las más importantes. De las enzimas ligninolíticas, oxidasa extracelular y peroxidasa presentaron los más elevados potenciales enzimáticos.

Palabras clave: Nothofagus pumilio, descomposición, hojarasca, microhongos, potencial degradativo.

ABSTRACT

The seasonal variation and enzymatic potential of microfungi isolated from senescent leaves and leaf litter of Nothofagus pumilio was studied. The study was performed in a N. pumilio forest located in a microcatchment of the Antillanca Valley, Puyehue National Park (40º 47' S, 72° 12' W, 1,120 m of altitude). Senescent leaves recently collected from N. pumilio trees were enclosed in litter bags and subjected to natural degradation on the forest leaf litter during 1 year (March 1997-March 1998), with seasonal sampling. The isolation of microfungi was performed through the dilution plate technique using malt extract agar (2 %) as the isolation medium. The enzymatic degradation potential of microfungi was determined in vitro by testing amylase, cellulase, pectinase, protease, laccase, extracellular oxidase, peroxidase, cytochrome oxidase, phosphatase, esterase and tyrosinase activities. The mycoflora of the senescent leaves was dominated by Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, Epicoccum nigrum, Phialophora group hoffmanni and Rhodotorula aurantiaca. The most abundant species found in the leaf litter were Hormonema prunorum, Mortierella ramannniana var. angulispora, Penicillium para-herquei and Trichoderma polysporum. The Moniliales and sterile micelia exhibited the highest enzymatic degradation potential, being the lowest Sphaeropsidales and yeasts. Individually, the species with the highest degradative potential were Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, Hormonema prunorum and Phialophora malorum. Cellulase and amylase activities were the most important. Extracellular oxidase and peroxidase were the ligninolitic enzymes with the highest enzymatic potentials.

Key words: Nothofagus pumilio, decomposition, leaf litter, microfungi, degradative potential.

INTRODUCCIÓN

La descomposición de la materia orgánica en el suelo es un proceso clave en el ciclaje de nutrientes en el ecosistema. Como parte de los ciclos biogeoquímicos cabe mencionar la liberación de nutrientes y la modificación y transformación de materiales resistentes por procesos de quelación y humificación. En un bosque, la hojarasca constituye la principal fuente de nutrientes para la vegetación, fauna y microorganismos. Cerca del 80 % de la degradación de la hojarasca es realizada por microorganismos, siendo los hongos uno de los principales agentes (Jensen 1974).

De acuerdo a Frankland (1998), una sucesión de plantas y hongos se puede definir como un "cambio direccional en la composición, abundancia relativa y patrón espacial de las especies que comprenden las comunidades". A medida que la hojarasca se degrada, las comunidades fúngicas sufren cambios secuenciales en su composición y potencial de degradación, debido a cambios en la disponibilidad de nutrientes, humedad, pH, tensión de oxígeno, etc.

Una evaluación de la diversidad microbiológica en suelos no sólo debe estar basada en la cuantificación e identificación de los microorganismos involucrados, sino que es esencial investigar el rol funcional de los microorganismos, a fin de definir el significado de la diversidad microbiana (Kjøller et al. 2000). En este sentido, el estudio de las capacidades enzimáticas de la micobiota es una forma de comprender sus actividades y proporciona una base fisiológica a la sucesión observada.

La celulosa, hémicelulosa y lignina son los componentes más importantes de la hojarasca, constituyendo el 50-80 % de la materia seca (Schinner & Sonnleitner 1996). Estas macromoléculas, previo a la asimilación por los microorganismos, deben ser hidrolizadas a subunidades más simples, mediante enzimas extracelulares. La celulosa es uno de los componentes estructurales orgánicos más importantes en tejidos vegetales y la capacidad para su utilización es considerada una propiedad esencial para los hongos saprófitos que degradan la hojarasca (Schinner & Sonnleitner 1996). La hidrólisis de la celulosa a unidades de glucosa, es realizada por enzimas denominadas celulasas.

Después de la celulosa, la lignina es el segundo componente más importante de la hojarasca. La lignina es un polímero constituido por unidades de fenilpropano con múltiples enlaces y es degradada por un complejo de enzimas, entre otras lacasas, lignino peroxidasa, Mn peroxidasas y tirosinasas, que actúan sinérgicamente (Hammel 1997).

El almidón es otro compuesto común de la hojarasca, constituyendo una fuente de carbono fácilmente degradable en las primeras etapas de la descomposición de la hojarasca y su hidrólisis es llevada a cabo por amilasas.

En los últimos años, la diversidad funcional de los microorganismos en suelo y hojarasca ha sido determinada investigando su capacidad para utilizar diferentes sustratos (Kjøller et al. 2000), siendo un indicador sensible para determinaciones a gran escala. Varios estudios han analizado la sucesión fúngica sobre hojarasca en bosques templados, tanto en latifoliadas como coníferas (Watson et al. 1974, Kuter 1986, Frankland 1998, Kjøller et al. 2000). Sin embargo, los estudios en bosques de Nothofagus son escasos, pudiéndose mencionar los trabajos de Ruscoe (1971) en Nothofagus truncata (Col.) Ckn. en Nueva Zelanda, Godeas et al. (1985) en Nothofagus pumilio (Poepp. et Endl.) Krasser y Gamundi et al. (1987) en Nothofagus dombeyi (Mirb.) Blume en Argentina.

Nothofagus pumilio es la especie arbórea con la mayor área de distribución geográfica en Chile, con 2.200 km de extensión y constituyendo de preferencia el límite altitudinal de la vegetación boscosa (Hildebrand-Vogel et al. 1990, Veblen et al. 1996). Antecedentes de Salazar (1998) en bosque de N. pumilio de la cordillera andina (40° S) indican aportes de hojarasca cercanos a 2.000 kg ha-1 año-1, una velocidad de descomposición (k) de 0,13 y una pérdida de peso seco cercana al 65 % después de 12 meses de incubación in situ.

Se plantea que debido a las condiciones rigurosas del clima de alta montaña en el bosque de N. pumilio, las poblaciones de microhongos que colonizan la hojarasca varían según la estación climática y por tal razón, existirían diferencias cualitativas en sus potenciales enzimáticos. Como parte de una investigación de línea base sobre los ciclos biogeoquímicos a nivel de microcuenca en bosques de N. pumilio de la cordillera andina, el presente estudio tiene como objetivo identificar la variación temporal de las poblaciones de microhongos que colonizan la hojarasca de N. pumilio sometida a degradación natural y analizar in vitro sus potenciales para degradar substratos representativos de los componentes orgánicos foliares (almidón, celulosa, lignina, pectina y proteínas).

MATERIALES Y MÉTODOS

Área de estudio

Se localiza en la Cordillera de los Andes, Valle de Antillanca, X Región de Chile (40° 47' S, 72° 12' O, 1.120 m de altitud), área incluida en el Parque Nacional Puyehue. El clima es templado húmedo, Cfb según la clasificación de Köppen (Di Castri & Hajek 1976), con una precipitación anual promedio de 5.332 mm y presencia de nieve desde junio hasta noviembre (Godoy et al. 1999). La temperatura promedio anual durante 1997-1998 fue de 2,4 °C, con una temperatura 15,7 °C en febrero y una mínima de _1,8 °C en septiembre de 1998. En el nivel superficial del suelo, la temperatura máxima fue de 17,2 °C durante febrero y la mínima de 0,5 °C en julio (Godoy et al. 1999). El suelo es de origen volcánico, del tipo Andisol, formado principalmente por toba, escoria andesítica y basáltica y en menor proporción ceniza arenosa (Peralta 1975, Hildebrand-Vogel et al. 1990). El perfil del suelo del bosque en estudio posee un horizonte OL de 1,5 cm de hojarasca y un O2 de 3,5 cm de color café oscuro. El horizonte A2 es de 17 cm, de color gris y con elevado contenido en raíces finas y gruesas, el horizonte B2 es de 38 cm, de color marrón oscuro y un horizonte C por debajo de los 60 cm, formado por arena gruesa y grava, con escaso contenido de raíces. Las características químicas indican para el horizonte A: pH 5,8, C-total 4,6 %, N-total 0,22 %, C/N 21, P disponible 3 mg kg-1, Na+ 20 mg kg-1, K+ 71 mg kg-1, Ca+2 158 mg kg-1, Mg+2 34 mg kg-1 (Godoy et al. 1999). En el área de estudio se identificó una microcuenca de 6 ha, donde se estableció una parcela experimental cuyo estrato arbóreo es dominado por Nothofagus pumilio, de una edad aproximada a 120 años. El sotobosque se caracteriza por la dominancia de Drymis andina (Reiche) R.A. Rodr. et Quez. y Maytenus disticha (Hook) Urban.

Ensayo de incubación in situ

En marzo de 1997, se recolectaron al azar hojas senescentes previa a la absición desde los árboles de N. pumilio. El material foliar de biomasa conocida y estándar se depositó en mallas de nylon ("litter bags") (300 cm2, 1 mm2 tamaño de trama) y se depositaron sobre la superficie de la capa de hojarasca. Se trasladaron tres mallas recién preparadas al laboratorio, con el fin de determinar los microhongos que colonizan las hojas en el árbol y que corresponden a los estados iniciales de la sucesión. Las restantes mallas se incubaron in situ para que la hojarasca continuara su proceso de descomposición natural, y se colectaron en triplicado cada tres meses (junio, septiembre, diciembre de 1997 y marzo de 1998). En cada oportunidad las muestras se procesaron inmediatamente en el laboratorio.

Aislamiento e identificación de microhongos

Para el aislamiento de los microhongos desde la hojarasca se utilizó el método de dilución en placa de Steubing et al. (en prensa). Diez gramos de hojarasca de cada malla se trataron individualmente para mezclar con 90 mL de agua destilada estéril para luego triturar en un omnimixer a 16.000 rpm por 20 min. A continuación se extrajo 1 mL de la suspensión y se depositó en un tubo que contenía 9 mL de agua destilada estéril. A partir de este tubo se hicieron diluciones seriadas hasta 10-7. Luego, 1 mL de cada dilución se sembró individualmente y por triplicado en agar extracto de malta Merck (AEM al 2 %), pH 5.5, con adición de sulfato de estreptomicina (25 µg mL-1) y sulfato de penicilina (50 µg mL-1). Los cultivos se incubaron a 23 ± 2 °C por 15 días y las colonias que se desarrollaron se repicaron en AEM y se cultivaron bajo las mismas condiciones. Estas condiciones de cultivo fueron estándares para todos los ensayos. Para la identificación de las cepas fúngicas se confrontaron las características macro-microscópicas y culturales con los esquemas propuestos en distintas monografías. La taxonomía siguió a Domsch et al. (1980) para Moniliales, Ramírez (1982) para Penicillium sp., Raper & Fennell (1965) para Aspergillus sp., Rifai (1969) para Trichoderma sp., Ellis (1971, 1976) para hongos dematiáceos, Zycha et al. (1969) para Mucorales y a Barnett et al. (1990) para levaduras. Aquellos cultivos que no esporularon después de 1 mes de incubación se consideraron como micelios estériles.

Determinación enzimática cualitativa en microhongos aislados

Para la determinación cualitativa de las enzimas se seleccionaron 173 cepas, teniendo como criterio que el número elegido para cada taxón fuera proporcionalmente representativo al número total de cepas aisladas. A cada cepa se le determinaron por triplicado 11 enzimas involucradas en los procesos degradativos de los principales constituyentes de la hojarasca (almidón, celulosa, lignina, pectina y proteínas). Con la excepción de la determinación de proteasa y pectinasa, cada unas de las cepas se cultivaron a 23 °C por 14 días.

La detección de citocromo oxidasa, esterasa, fosfatasa, lacasa, peroxidasa y tirosinasa siguió los procedimientos de Taylor (1974) y Stalpers (1978). En el margen de colonias en AEM se agregaron 0.05 mL de soluciones indicadoras específicas y se observaron los cambios de color. De esta forma, la detección de citocromo oxidasa se realizó con una solución de tetrametil-p-fenilendiamina dihidrocloruro, para esterasa una solución de aceatato a-naftol, para fosfatasa solución de a-naftol fosfato acuoso, para lacasa solución de a-naftol 0,1 M, para peroxidasa solución de H2O2 al 0,4 % y pirogalol al 1 % en partes iguales y para tirosinasa una solución de tirosina 0,1 M.

La detección de oxidasa extracelular se determinó por el test de Bavendamm, en el cual las cepas se cultivaron en AEM al 2 % suplementado con ácido tánico al 0,5 %. La presencia de esta enzima es indicada por la aparición de un color café bajo o alrededor de la colonia.

Para la detección de amilasa, celulasa, proteasa y pectinasa se usaron las técnicas modificadas de Pochon & Tardieux (1965). Los medios de cultivos se prepararon utilizando reactivos Merck. Para amilasa las cepas se cultivaron en agar almidón al 2 %. Después de la incubación se agregó solución de ioduro al 1 %. Una zona clara alrededor de la colonia indica la presencia de enzimas amilolíticas. Para la detección de enzimas celulolíticas las cepas se cultivaron en agar celulosa al 2 %, donde el crecimiento de las cepas en este medio indica la posesión de enzimas celulolíticas. La producción de enzimas proteolíticas se determinó cultivando las cepas en tubos con medio gelatina al 12 %, incubando a temperatura ambiente por 14 días, donde la licuefacción del medio indica la presencia de proteasas. La actividad de pectinasa se determinó cultivando las cepas en tubos con medio pectina de manzana e incubando a temperatura ambiente por 14 días, período en el cual la fluidización de la pectina se considera indicador de enzimas pectinolíticas.

Para estimar los potenciales enzimáticos de cada grupo taxonómico, se calculó un porcentaje ponderado, considerando el número de cepas con actividad de una determinada enzima con respecto al total de cepas positivas para dicha enzima. Un procedimiento similar se desarrolló para estimar la variación estacional de cada potencial enzimático.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Variación estacional de la micobiota

En la Tabla 1 se presenta el listado y abundancia de los taxa identificados de las hojas senescentes y en descomposición de N. pumilio. Se aislaron un total de 338 cepas, correspondientes a 74 taxa fúngicas. La micobiota de las hojas senescentes antes de su caída presentó el mayor número de taxa (33), sin observarse claras dominancias individuales. Los hongos incluyen a Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, Epicoccum nigrum, Mortierella ramanniana var. angulispora, Penicillium sp., Phialophora grupo hoffmannii (A, B y C). Estas especies corresponderían a saprófitos primarios, categoría que incluye aquellos hongos que se encuentran en el follaje y que son los colonizadores iniciales después de la abscisión (Stone et al. 1996, Frankland 1998). Una proporción de estos hongos aislados en N. pumilio ya se han reportado como saprófitos primarios desde el follaje de otras especies e.g., C. cladosporioides en Nothofagus dombeyi (Gamundi et al. 1987), A. alternata desde Nothofagus truncata (Ruscoe 1971) y E. nigrum en el follaje de Acer saccharum Marsh. (Kuter 1986). Estos microhongos poseen adaptaciones que les permiten enfrentar las condiciones desfavorables existentes en las superficies foliares, como la formación de esporas pigmentadas y multicelulares de A. alternata y E. nigrum y los microesclerocios de C. cladosporioides (Stone et al. 1996).

TABLA 1

Las especies de Phialophora fueron un importante componente de la micobiota presente en las hojas senescentes de N. pumilio, donde Ph. grupo hoffmannii (A, B y C) fue el principal taxon. Esta alta proporción de Phialophora sp. en los estados pioneros, parece ser una particularidad de la sucesión en N. pumilio. Una situación similar sólo ha sido reportada por Frankland (1966), quién aisló a Phialophora sp. en el 30 % de los estipes de Pteridium aquilinum (L.) Kuhn.

La micocenosis de la hojarasca de 3 meses de edad (junio) fue dominada por Aspergillus cervinus, Hormonema prunorum y Mortierella vinacea, especies ausentes en las hojas senescentes. En la hojarasca de 6 meses (septiembre) la especie representativa fue Trichoderma polysporum y en menor grado Trichoderma viride, ambas ausentes en los estados pioneros de la sucesión. Sin embargo, A. alternata, C. cladosporioides, E. nigrum, Ph. grupo hoffmannii y Trichoderma hamatum son ejemplos de hongos que colonizan las hojas en el árbol y persisten después que éstas han tomado contacto con el piso del bosque (Frankland 1998).

La mayoría de los microhongos que con frecuencia se aislan del suelo alcanzaron sus mayores abundancias en la hojarasca incubada 12 meses, e.g., Penicillium y Trichoderma. De acuerdo a Hudson (1968), estos hongos se encuentran ampliamente distribuidos en suelos, particularmente en los substratos vegetales reducidos y/o parcialmente descompuestos. Aunque algunas especies de Trichoderma están presentes al inicio de la sucesión, la mayor contribución de este taxón se registró a los 6 meses de incubación in situ. Trichoderma polysporum presentó en septiembre su mayor abundancia relativa, mientras que Trichoderma hamatum y Trichoderma longibrachiatum lo hicieron a los 6 y 12 meses de incubación, respectivamente. Estos resultados son comparables a los obtenidos por Boois (1976) en la hojarasca de Quercus petraea, donde la mayoría de los hongos del suelo se aislaron 6 meses después de incubadas las hojas en el suelo del bosque, alcanzando la mayor frecuencia Trichoderma sp. en la hojarasca de 1 año de edad.

El dominio de Mortierella ramanniana var. angulispora a los 9 meses de incubación concuerda con lo reportado en otras sucesiones fúngicas (Boois 1976), donde los Mucorales son uno de los principales componentes de la micobiota que habita la hojarasca con un alto grado de descomposición, siendo infrecuente su aislamiento en tejidos vivos y hojarasca joven. En bosques de Nothofagus dombeyi, Gamundi et al. (1987) reportan a Mucor circinelloides entre los hongos más frecuentes en la hojarasca de 2 años de edad. Probablemente, los Mucorales utilizaron compuestos carbonados simples, derivados de la acción sobre la hojarasca de hongos celulolíticos (e.g., Arthrinium, Cladosporium, Trichoderma) y ligninolíticos (e.g. Hormonema prunorum y Phialophora). En substratos vegetales, géneros como Absidia, Mortierella y Mucor se definen como "hongos sacarolíticos" y usualmente se asocian a taxa descomponedoras de compuestos recalcitrantes, asimilando los subproductos de su degradación (Visser & Parkinson 1975).

El género Penicillium fue un colonizador permanente de la hojarasca, presentando sus mayores abundancias a los 12 meses de incubación y cuyas poblaciones en los dos últimos trimestres fueron dominadas por Penicillium sp. serie restrictum y P. para-herquei. Al comparar otras sucesiones también se observa a Penicillium sp. en la hojarasca en avanzado estado de descomposición, a menudo junto a Mucorales y Trichoderma sp. (Frankland 1998). El rol de los Mucorales y Penicillium sp. en la hojarasca de N. pumilio sería el de saprófitos secundarios, cuya existencia se basa en su rápido crecimiento y capacidad para utilizar compuestos carbonados simples. Igualmente, pueden utilizar los productos derivados de la degradación de celulosa y lignina (Kuter 1986).

Los micelios estériles fueron importantes colonizadores de las hojas de N. pumilio, especialmente en las hojas senescentes y en la hojarasca de 6 meses de incubación. Ruscoe (1971) encontró altas frecuencias de hongos hialinos y dematiáceos estériles en el interior de hojas vivas, senescentes y hojarasca de N. truncata, sugeriendo que estos hongos pueden ser patógenos.

Potenciales enzimáticos

El estudio de las capacidades enzimáticas de los hongos que habitan la hojarasca, permite determinar sus potenciales degradativos y proporciona una base fisiológica a la sucesión observada. En este sentido, la detección de enzimas en medios sólidos permite probar en forma rápida los potenciales degradativos de una gran cantidad de hongos y así comparar sus capacidades enzimáticas (Kjoller et al. 2000). En la Tabla 2 se comparan los potenciales enzimáticos de los grupos taxonómicos asociados a las hojas senescentes y hojarasca de N. pumilio. Los Moniliales exhibieron la mayor capacidad enzimática, mientras que la menor la presentaron Sphaeropsidales y levaduras. Estos resultados se corresponden con los informados por Gochenaur (1984) en su estudio enzimático de la micobiota en bosques de Betula y Quercus, donde Moniliales y Penicillium fueron los taxa más destacados. En el presente estudio los Moniliales presentaron los mayores potenciales para todas las enzimas ensayadas y se destaca como el único taxon que presentó actividad para esterasa. El potencial ligninolítico fue variable entre las taxa. Así, los micelios estériles presentaron altos potenciales para lacasa, oxidasa extracelular y peroxidasa. Por el contrario, dichas actividades fueron bajas o no se detectaron en Penicillium sp. y Mucorales.


En la Tabla 3 se muestran los potenciales de degradación enzimáticos de los 74 taxa. En los Moniliales las especies enzimáticamente más versátiles fueron Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, Hormonema prunorum, Phialophora grupo hoffmannii C y Phialophora malorum. Con respecto a C. cladosporioides la producción de proteasa, amilasa, pectinasa y oxidasa ha sido documentada por Domsch et al. (1980) y Kjøller & Struwe (1980). Sin embargo, el alto potencial celulolítico contrasta con lo señalado por Kjøller & Struwe (1980) al estudiar los potenciales enzimáticos de la micobiota asociada a hojas de Alnus glutinosa (L.) Gaertn., donde no detectaron esta actividad en C. cladosporioides, mientras que en Cladosporium herbarum se restringió a cepas aisladas inmediatamente después de la caída de las hojas. Por su parte, Domsch et al. (1980) señalan que C. cladosporioides presenta una baja capacidad celulolítica. Referente a las cepas de A. alternata todas mostraron actividad para celulasa, lo cual concuerda con los resultados de Hogg & Hudson (1966), quienes observaron una alta actividad celulolítica en cepas de Alternaria tenuis (= A. alternata) aisladas desde hojas de Fagus sylvatica. Asimismo, se ha demostrado en especies de Alternaria la producción de amilasa, proteasa, pectinasa y oxidasa (Kjøller & Struwe 1980, Rosenbrock et al. 1995). Hongos como A. alternata, C. cladosporioides y Hormonema prunorum se pueden definir como generalistas (Gochenaur 1984) y con potencial para degradar los principales constituyentes de las hojas de N. pumilio, propiedad esencial para su persistencia a lo largo del estudio. Al respecto, Dilly & Irmler (1998) encontraron que hongos con una pobre capacidad enzimática (ausencia de amilasa y proteasa) estaban presentes sólo en los primeros estadios sucesionales de la hojarasca de Alnus glutinosa.



Como se observa en la Tabla 3, en la mayoría de las especies de Trichoderma se determinaron potenciales enzimáticos para amilasa y celulasa, y en menor grado para las enzimas del complejo lignina, siendo T. hamatum la especie más versátil. El género Trichoderma es conocido por su capacidad para degradar la celulosa (Domsch et al. 1980, Singh & Steinke 1992), aunque también se ha demostrado la producción de amilasa, proteasa y pectinasa (Domsch et al. 1980).

Para Penicillium sp., los potenciales de amilasa, celulasa, pectinasa y proteasa fueron los más importantes, similar a lo obtenido por Gochenaur (1984). El potencial ligninolítico fue limitado, detectándose sólo una o dos enzimas en Penicillium chrysogenum, P. commune, P. janthinellum, P. serie restrictum y P. thomii y ausencia de esterasa, fosfatasa, lacasa y tirosinasa. Por su parte, los Mucorales utilizaron compuestos simples, principalmente almidón (todas las especies) y en menor grado pectina (Mortierella vinacea y Mucor hiemalis). En contraste, el potencial para las enzimas del complejo lignina fue bajo, limitándose a las actividades de peroxidasa y oxidasa extracelular en algunas cepas de M. ramanniana var. angulispora y M. hiemalis, respectivamente. Esta baja capacidad ligninolítica de los Mucorales también se describe en los trabajos de Rosenbrock et al. (1995) y Kjøller & Struwe (1980). Rosenbrock et al. (1995) no detectaron actividad para lacasa en Mucor spp y Rhizopus stolonifer. A su vez, Kjøller & Struwe (1980) sólo detectaron oxidasas en cepas de Mortierella aisladas 7 meses después de la caída de las hojas. Por último, en el grupo de los micelios estériles, los más activos fueron el micelio dematiáceo B y los micelio blancos L y N. Todos ellos demostraron potencial ligninolítico, detectándose las actividades de lacasa, oxidasa extracelular y peroxidasa.

En la Fig. 1 se presenta la variación anual de los potenciales enzimáticos, donde la mayoría mostró un comportamiento similar durante el estudio. Todos los potenciales enzimáticos mostraron los más altos valores en las cepas aisladas de las hojas senescentes y una disminución los mismos en las cepas de junio. Esto concuerda con la fuerte disminución en el contenido de substancias solubles y celulosa durante los primeros meses de descomposición de la hojarasca (Kjøller & Struwe 1980).



Fig. 1: Porcentaje de cepas microfúngicas con potenciales de degradación enzimáticos durante la descomposición de la hojarasca de Nothofagus pumilio, Antillanca, Parque Nacional Puyehue. El porcentaje se calculó en relación al total de cepas ensayadas (173).

Percentage of microfungal isolates with enzymatic degradation potentials during the decomposition of Nothofagus pumilio leaf litter, Antillanca, Puyehue National Park. The percentage was calculated in relation to the total number of tested isolates (173).

El almidón se encuentra contenido en la fracción soluble de las hojas y es rápidamente asimilado por las poblaciones microbianas. Asimismo, la utilización de celulosa va siempre acompañada por la capacidad de utilizar al menos pectina o almidón (Kjøller & Struwe 1980). El potencial de amilasa presentó la segunda más alta actividad, con valores entre 20,2 % en las cepas aisladas de las hojas senescentes y 9,3 % en las cepas aisladas en diciembre. Rosenbrock et al. (1995) también observaron una elevada actividad amilolítica durante la descomposición de la hojarasca de Alnus glutinosa (L.) Gaertn., lo que para estos autores demuestra que esta enzima es común en los hongos que colonizan la hojarasca.

La mayor actividad enzimática detectada en las cepas fúngicas correspondió a celulasa, la que fluctuó entre 20,8 % en las cepas aisladas de las hojas senescentes y 11,6 % en las cepas aisladas en diciembre, comportamiento que concuerda con los resultados de Kjøller & Struwe (1980).

La producción de enzimas microbianas es afectada no sólo por la naturaleza química de la hojarasca y los requerimientos nutricionales de los microorganismos, sino también por condiciones ambientales (Kshattriya et al. 1992). Se ha demostrado que la actividad celulolítica está correlacionada positivamente con el contenido de humedad de la hojarasca (Kshattriya et al. 1992, Joshi et al. 1993). En esta línea, la menor actividad celulolítica observada en las cepas aisladas en diciembre (11,6 %) se corresponde con los resultados de Rosenbrock et al. (1995) quienes observan una disminución de la actividad de celulasa en verano, atribuido a la menor humedad ambiental.

La variación experimentada por el potencial de pectinasa es similar a la reportada por Kjøller & Struwe (1980) y Rosenbrock et al. (1995) en Alnus glutinosa. En efecto, la disminución del potencial desde el máximo en las cepas aisladas en las hojas senescentes (13,9 %) a junio (8,7 %), indica la degradación inicial de la fracción péctica. Por su parte, el aumento del potencial en las cepas aisladas en septiembre y marzo sugiere la degradación tardía de fracciones pécticas resistentes a la descomposición.

La variación en el potencial de proteasa es similar a la registrada por Kjøller & Struwe (1980) y Rosenbrock et al. (1995) e indicaría la existencia de dos fracciones proteicas en la hojarasca. La disminución de la actividad proteolítica en las cepas aisladas en junio apunta a la reducción de una fracción soluble. Por su parte, el incremento de la actividad en las cepas aisladas en septiembre indicaría la descomposición tardía de proteínas insolubles (Rosenbrock et al. 1995).

La lignina es el compuesto aromático más abundante en la naturaleza y es probablemente el más recalcitrante. Su resistencia a la degradación es consistente con sus funciones de dar rigidez a las plantas vasculares y proteger sus polisacáridos estructurales (celulosa y hemicelulosa) de las enzimas degradativas. Ya que es un polímero muy ramificado, los mecanismos ligninolíticos deben ser extracelulares. Igualmente, la presencia de enlaces estables éster y carbono-carbono, indica que estos mecanismos deben ser oxidativos más que hidrolíticos. Además, la lignina es insoluble en agua, lo cual limita su biodisponibilidad a los agentes ligninolíticos y determina que la ligninólisis sea un proceso lento (Hammel 1997). En el presente estudio las enzimas ligninolíticas detectadas más importantes fueron oxidasa extracelular y peroxidasa, las cuales mostraron los mayores índices en las cepas aisladas de las hojas senescentes y en septiembre. Al respecto, Kjøller & Struwe (1980) en Alnus glutinosa, también reportan una importante población de hongos productores de oxidasa extracelular en los estados pioneros de la sucesión.

El potencial de lacasa fue menor, con un máximo en las cepas aisladas de las hojas vivas (6,9 %). Estudios cuali-cuantitativos han determinado una baja actividad de lacasas en la micobiota aislada de la hojarasca. Rosenbrock et al. (1995) observaron un bajo porcentaje de cepas con potencial de lacasa, con un máximo cercano al 14 % en la hojarasca de 4 meses de edad. Por su parte, Criquet et al. (1999), mediante una metodología que consideró la extracción y cuantificación de la actividad de lacasas en la hojarasca de Quercus ilex L., determinaron que estas enzimas se encontraban en muy bajas concentraciones.

El potencial de citocromo oxidasa fue bajo en todos los muestreos, fluctuando entre 4,1 y 2,3 % en las cepas aisladas en las hojas senescentes y aquellas aisladas en diciembre, respectivamente. La actividad de fosfatasa fue mayor en los hongos aislados al inicio de la sucesión (4,1 %), manteniéndose el resto del año con valores bajo el 3 %. El potencial de esterasa presentó sólo un 0,6 % en las cepas aisladas en hojas senescentes y marzo, mientras que el potencial de tirosinasa presentó igual porcentaje en las cepas aisladas en las hojas senescentes y aquellas aisladas en la hojarasca incubada por 3 y 12 meses, respectivamente. La débil actividad de tirosinasa está de acuerdo con los resultados de Criquet et al. (1999), quienes no detectaron esta enzima en la hojarasca de Quercus ilex.

Durante el curso de la degradación de la hojarasca diferentes grupos de microorganismos interactúan de forma compleja (Kjøller et al. 2000). Al analizar la diversidad de la micobiota en conjunto con sus actividades enzimáticas es una forma de conocer no sólo como varía la estructura de la comunidad microfúngica durante el proceso de descomposición, sino también la función de las poblaciones microbianas del suelo. Los resultados de este estudio muestran que a lo largo de la degradación de la hojarasca de N. pumilio se producen cambios en la composición de la comunidad microfúngica, lo cual se refleja en las variaciones de las actividades enzimáticas. No obstante, sólo al estudiar los potenciales enzimáticos en concomitancia con los cambios de los componentes químicos de la hojarasca (e.g. substancias solubles, celulosa y lignina) permitirá explicar en mejor forma la sucesión en la comunidad fúngica.

AGRADECIMIENTOS

Este estudio fue financiado por los proyectos FONDECYT 1970707 y DID-UACH 200013. Deseamos agradecer al Club Andino Antillanca y a la Corporación Nacional Forestal (X Región) por el apoyo logístico y autorización otorgadas y al Sr. Nicolás Pacheco, guardaparques de CONAF, por su valiosa asistencia en terreno. Se agradece los comentarios críticos de dos revisores anónimos que permitieron mejorar substancialmente la presentación del manuscrito.

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Editor Asociado: L. Corcuera
Recibido el 18 de abril de 2000; aceptado el 21 de junio de 2001