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Revista chilena de historia natural

versión impresa ISSN 0716-078X

Rev. chil. hist. nat. v.74 n.1 Santiago mar. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-078X2001000000009 

Bases fisiológicas para una interacción entre las células cromafines y las
endoteliales de la glándula adrenal

Physiological bases for an interaction between chromaffin and endothelial
cells from the adrenal gland

MARIO LUXORO1 & RAUL VINET 2

1 Departamento de Biología, Facultad de Ciencias, Universidad de Chile, Casilla 653, Santiago, Chile,
e-mail: mluxoro@uchile.cl
2 Escuela de Química y Farmacia, Facultad de Medicina, Universidad de Valparaíso, Valparaíso, Chile,
e-mail: raul.vinet@uv.cl

RESUMEN

En este trabajo tratamos de investigar las posibles interacciones entre las células endoteliales de la glándula adrenal y aquellas sustancias relacionadas con la secreción de las células cromafines. Para lo anterior, estudiamos el efecto de acetilcolina (ACh), o de catecolaminas (CA) tanto en el nivel de Ca2+ citoplasmático ([Ca2+]i), como en el potencial de membrana de las células endoteliales. Nuestros resultados muestran que tanto la ACh como la nicotina, pero no la muscarina, son capaces de inducir un aumento del [Ca2+]i y una despolarización de la membrana plasmática de las células endoteliales. El antagonista nicotínico, hexametonium, bloquea tanto el efecto de la ACh como de la nicotina lo que sugiere la presencia de receptores nicotínicos. Por otra parte, las CA (tanto adrenalina como noradrenalina o agonistas a1-adrenérgicos) también producen un aumento del [Ca2+]i en las células endoteliales aunque no despolarización evidente. En este caso, el aumento es bifásico siendo la primera fase de un pico rápido e independiente del Ca2+ extracelular en tanto que la segunda se presenta con oscilaciones y depende tanto de que los canales de Ca2+ no estén bloqueados como de la presencia de ese ión en el medio externo. Dado que se ha demostrado que el aumento del [Ca2+]i en las células endoteliales desencadena la secreción de sustancias vasodilatadoras (prostaciclina y óxido nítrico), proponemos que éste sería un mecanismo compensatorio del sistema para contrarestar el enorme efecto vasoconstrictor de las CA secretadas por las células cromafines.

Palabras clave: endoteliales, cromafines, receptores, interacciones.

ABSTRACT

In this work we investigated the possible interactions between the endothelial cells from the adrenal gland and the substances related with the secretion from the chromaffin cells. In order to do so, we studied the effect of acetyl-choline (ACh) or of catecholamines (CA) on the level of the membrane potential and the cytoplasmic concentration of free calcium ([Ca2+]i) in the endothelial cells. Our results show that ACh as well as nicotine, but not muscarine, are able to induce an increase in [Ca2+]i and membrane depolarization of the endothelial cells. The nicotinic antagonist, hexamethonium, inhibits both the action of nicotine and of ACh, which suggests the presence of nicotinic receptors. On the other hand, CA (adrenaline as much as noradrenaline or a1-adrenergic agonists) also produce a rise in [Ca2+]i in endothelial cells but not a clear depolarization. In this case, the increase is biphasic, being the first phase a very rapid peak, independent of the external Ca2+ while the second phase shows oscillations and depends on the extracellular Ca2+. This phase is diminished if the calcium channels are blocked. Since it has been demonstrated that an increment of [Ca2+]i in endothelial cells triggers the secretion of vasodilator substances such as prostacyclin and nitric oxide, we propose that this might be a compensatory mechanism in order to compensate the enormous vasoconstrictor effect that the secreted CA should have.

Key words: endothelial, chromaffin, receptors, interactions.

PRÓLOGO

Quien escribe estas líneas (M. L.), agradece muy sinceramente a la Sociedad de Genética por la invitación a escribir este trabajo en homenaje al Profesor Danko Brncic. En efecto, cuando Danko murió, M. L. estaba en el Hospital tratando de sobrevivir a una intervención cardíaca y vino a saber de la muerte de su apreciado maestro, colega y amigo sólo un mes después de su alta. Esta oportunidad de escribir un trabajo en honor del Prof. Brncic, libera, en parte, a M. L. de la tremenda frustración de no haber estado con Danko en sus últimos días.

INTRODUCCIÓN

In vivo, la secreción de catecolaminas (CA) por la glándula adrenal es desencadenada por estimulación de la médula suprarenal mediante los nervios esplácnicos. Éstos, actuan sobre las células cromafines de la médula mediante la liberación del neurotransmisor acetilcolina (ACh) el cual activa al receptor-canal, permitiendo la entrada a la célula de iones Na+ y Ca2+. Con lo anterior, la célula se despolariza y se activan los canales dependientes de voltaje, primero los de Na+ y luego los de Ca2+ aumentando así la concentración intracelular de calcio libre, con lo que se desencadena el proceso de exocitosis (Ungar & Phillips 1983). Las CA así liberadas entran a la microcirculación de las adrenales y son distribuidas por el organismo animal. El proceso descrito, universalmente aceptado, tiene un contrasentido: Si en el proceso fisiológico se secreta una cantidad de CA que una vez distribuida por el organismo alcanzará una concentración desencadenante de vasoconstricción, esa misma cantidad de CA distribuidas en el volumen de la glándula adrenal, significará una concentración que podría llegar a ser tres órdenes de magnitud mayor, suponiendo que la razón volumen de animal / volumen de la glándula es a lo menos de 1000. En esas condiciones, la vasoconstricción en la glándula podría entorpecer muy severamente la distribución del material secretado.

Por otra parte, se ha establecido que las células endoteliales son capaces de producir sustancias vasoactivas, relajadoras de las fibras musculares lisas circundantes.

(Moncada et al. 1976, Furchgott & Zawadski 1980, Palmer et al. 1987, Luckhoff et al. 1988, 1990, Watanabe et al. 1992). La señal intracelular para la liberación de tales substancias vasoactivas es el aumento del calcio libre intracelular, [Ca2+]i (Himmel et al. 1993). En el contexto anterior, deberían considerarse los resultados de Bossu et al. (1989) y de Vinet & Vargas (1999) que señalan que las células endoteliales de glándula adrenal de mamífero, a diferencia de las endoteliales de otros tejidos, poseen canales de Ca2+ dependientes de voltaje. (Se ha descrito otra excepción en capilares de cerebro de rata (Rattus norvegycus, Berkenhout), pero en este caso, las endoteliales fueron obtenidas en condiciones especiales (Delpiano & Altura 1996). Se podría pensar, entonces, que de ser despolarizadas las endoteliales, se activarían esos canales y se aumentaría el [Ca2+]i con lo que se liberarían sustancias vasoactivas.

Este trabajo tiene por objeto explorar la posibilidad de interacciones entre el proceso de secreción y el de distribución de CA por el organismo. Se estudiará la posibilidad que la ACh liberada por los nervios esplácnicos también pueda inducir cambios en las células endoteliales ("interacción en paralelo"), dada la gran vecindad entre las células cromafines y las endoteliales (Coupland & Selby 1976). También se investigará la posibilidad que las CA liberadas tengan una acción en las endoteliales subyacentes. En ambos casos se indagará la posibilidad de que se induzcan despolarizaciones y, por lo tanto, aumentos de [Ca2+]i.

MATERIALES Y MÉTODOS

Cultivo de células

Se trabajó con células endoteliales cultivadas de adrenales de bovino (Bos taurus, Linnaeus) (CECAB), las cuales se elaboraron a partir de glándulas lavadas y perfundidas a través de la vena con solución de Locke a la cual se agregó antibióticos (154 mM NaCl, 5,6 mM KCl, 5,0 mM NaHCO3, 5,6 mM glucosa, 5,0 mM Na-Hepes, 100 U/mL penicilina, 100 mg/mL estreptomicina, 0,5 % albúmina, pH 7,2). Luego se perfundieron con solución Locke con 0,25 % de colagenasa y 0,01 % de inhibidor de tripsina y se incubaron posteriormente a 37 ºC por 40 min. Las células así disociadas fueron suspendidas en Percoll y separadas por centrifugación. Las células obtenidas fueron suspendidas en "Dulbecco's Modified Eagle's Medium" suplementado con 10 % suero fetal de vaca y cultivadas a 37 ºC en una atmósfera de aire con 5% de CO2 y saturada de humedad. Los experimentos se hicieron con células cultivadas durante uno a tres días. Los detalles del método están en otra publicación (Vinet & Vargas 1999).

Identificación de las CECAB

Las células endoteliales fueron identificadas por su morfología y por captación de LDL acetilada (Hoyer et al. 1973, Voyta et al. 1984).

Registro del potencial de membrana

Se utilizó la técnica de control de potencial de parche (patch clamp) (Hamill et al. 1981), en la configuración "célula entera" ("whole cell"). Las micropipetas (3-6 Mý) fueron acercadas a la célula mediante un micromanipulador, hasta tocar levemente la superficie; en ese momento, mediante una leve succión, se logra establecer un contacto entre la superficie seleccionada y el interior de la pipeta. Este contacto debe estar aislado del líquido circundante por al menos una resistencia de 10 GW, lo que se logra por la fuerte adhesión de la membrana celular al vidrio de la pipeta. Aplicando una succión adicional, se consigue romper el parche bajo la boca de la pipeta, de modo que ésta queda en contacto directo con el interior de la célula. El potencial se midió en la modalidad de control de corriente a 0 µA ("current clamp").

Medición de [Ca2+]

Para medir el Ca2+ citosólico utilizamos el colorante fluorescente fluo-3 (Molecular Probes, Eugene, Oregon, USA). Las células fueron cargadas con la forma esterificada del fluo-3 (fluo-3 AM), lo que se consiguió incubándolas por 20 a 30 min. en una solución de Krebs (en mM: 140 NaCl, 5 KCl, 2,6 CaCl2, 1 MgCl2, 2,5 NaHCO3, 10 glucosa, 5 Hepes-Na a pH 7,4) que contenía fluo-3 AM (7 mM) y ácido plurónico (0,094 %). Al ingresar a la célula, el fluo-3 AM es hidrolizado por fosfatasas, consiguiéndose así, que el colorante impermeable logre acumularse en el interior de la célula. Estas, lavadas con Krebs, se montaron en un microscopio donde fueron observadas individualmente. Fueron iluminadas con luz de 490 nm y se detectó la luz emitida a 530 nm, para lo cual el microscopio contaba con los filtros adecuados. La luz emitida fue medida continuamente usando un fotomultiplicador Hamamatsu y digitalizada (3 Hz) empleando un conversor análogo-digital (Data Translation) instalado en un PC. La conversión de la señal fluorescente en [Ca2+]i se realizó según Kao et al (1989), (Luxoro et al. 1997).

RESULTADOS

Despolarización con K+

La Fig. 1 muestra el efecto de la despolarización con K+. Se observa un fuerte y rápido incremento del [Ca2+]i. La misma figura demuestra que este incremento proviene del Ca2+ exterior, ya que al suprimirlo, también se suprime el incremento del intracelular. Aparentemente, al activar por despolarización a los canales de Ca2+, este ión penetra a la célula aumentando su concentración citoplasmática.


Fig. 1. Concentración de Ca2+ citosólico (nM) en función del tiempo (se repite en todos los gráficos que siguen excepto en el último). Inicialmente, la célula endotelial cargada con fluo-3, está inmersa en solución de Krebs y así será si no se indica otra cosa. Se observa el efecto de tres despolarizaciones con KCl (60 mM). La primera y la tercera en un Krebs en el cual 60 mM de NaCl fueron reemplazados por 60 mM de KCl. El Krebs 0 Ca 2+ contiene 3,6 mM de MgCl2 y no contiene CaCl2. La despolarización del centro fue hecha en un Krebs 0 Ca2+ en el cual 60 mM NaCl fueron reemplazados por 60 mM KCl. Las gruesas líneas negras horizontales indican los tiempos de tratamiento con las diversas soluciones (como en todos los gráficos que siguen). (Representativo de 6 experimentos).

Cytosolic Ca2+ concentration (nM) as a function of time (repeated in all the following figures except in the last one). Initially, the endothelial cell loaded with fura-3 is immersed in Krebs's solution. Three depolarizations with KCl (60 mM) are depicted. The first and the third one in Krebs in which 60 mM of NaCl were replaced by 60 mM KCl. Krebs 0 Ca 2+ includes 3,6 mM of MgCl2 and no CaCl2. The depolarization in the middle was effected in Krebs 0 Ca2+ in which 60 mM NaCl was replaced by 60 mM KCl. The thick black horizontal lines indicate the times of application of the different solutions (as in all the following figures). (Representative of 6 experiments).

Receptores de ACh

La Fig. 2 demuestra que las endoteliales provenientes de la médula adrenal son sensibles a la ACh. Por acción de este agonista se genera un aumento marcado y prolongado del [Ca2+]i. Los receptores activados son de carácter nicotínico, dado que la acción de la ACh es imitada por la nicotina y la acción de ésta es inhibida por hexametonio (Fig. 3). Hay que tener presente que al actuar la ACh se activan los canales del receptor (permeables a Na+ y a Ca2+) lo que conduce a despolarización y eventualmente activación de canales de Ca2+ sensibles a voltaje, los cuales, en células endoteliales, son inhibidos por Co2+, Cd2+ y por dihidropiridinas (Vinet & Vargas 1999). El agonista colinérgico muscarina no fue capaz de inducir un aumento del [Ca2+]i (no se muestra).


Fig. 2. Efecto de acetilcolina 10 µM. La droga se disolvió en solution de Krebs como en todas las figuras que siguen. (Representativo de 8 experimentos).

Effect of 10 µM acetyl-choline. The drug was dissolved in Krebs's solution as in all following figures. (Representative of 8 experiments).


Fig. 3. La figura muestra la respuesta de la célula endotelial a nicotina 10 µM en presencia del inhibidor nicotínico hexametonio (100 mM). Sigue un control en el cual sólo se aplicó nicotina. (Representativo de 6 experimentos).

This figure shows the response of the endothelial cell to 10 mM nicotine in the presence of the nicotinic inhibitor hexamethonium (100 µM). A control follows, in which only nicotine was applied. (Representative of 6 experiments).

Receptores adrenérgicos

El efecto de las catecolaminas sobre las endoteliales se muestra en la Fig. 4. La respuesta a 100 µM adrenalina (o noradrenalina, no se muestra) consiste en un aumento del [Ca2+]i caracterizado por una primera fase rápida y una segunda más lenta y más o menos mantenida. Mientras que la primera fase se presenta en un solo pico, la segunda ocurre con oscilaciones relativamente amortiguadas. Experimentos no descritos en este trabajo (Vinet et al. 2000) señalan que la primera fase es independiente del Ca2+ extracelular en cambio la segunda fase lo es. En concordancia con lo anterior, la segunda fase es parcialmente bloqueada si se inhiben los canales de Ca2+, en cambio la primera es severamente disminuida sólo si previamente se vacían los depósitos intracelulares de Ca2+ sensibles a cafeína (Vinet et al. 2000).


Fig. 4. Muestra el efecto de adrenalina 100 µM en la célula endotelial. Aparecen dos fases de incremento del [Ca2+]i . La primera corresponde al primer pico y la segunda está formada por una serie de oscilaciones amortiguadas. Estas fases difieren con respecto a su dependencia del calcio extracelular. (Representativo de 8 experimentos).

The figure shows the effect of 100 µM adrenaline in the endothelial cell. Two phases of the increment of [Ca2+]i are depicted. The first phase corresponds to the first peak and the second to a series of damped oscillations. These phases differ with respect to their dependence on the extracellular calcium. (Representative of 8 experiments).

La Fig. 5 muestra que la fenilefrina, un agonista a1-adrenérgico, produce el mismo efecto que las catecolaminas. Esta figura también muestra que la fenoxibenzamina, conocido bloqueador a-adrenérgico inhibe la acción de la fenilefrina. La respuesta a fenilefrina, en cuanto a la forma y dependencia del Ca2+ extra o intracelular es igual aquella descrita para las CA (Vinet et al. 2000). Isoproterenol 10 mM (agonista b-adrenérgico) no produjo respuesta (no se incluye).


Fig. 5. Efecto del agonista a1-adrenérgico, fenilefrina 10 µM en presencia del bloqueador a-adrenérgico fenoxibenzamina (10 µM). Sigue un control en el cual se aplica sólo fenilefrina. La respuesta a esta última droga es similar a la que provoca la adrenalina. (Representativo de 6 experimentos).

Effect of the agonist a1-adrenergic phenylephrine (10 µM) in the presence of the a-adrenergic blocker phenoxibenzamine (10 µM). A control follows in which only phenylephrine is applied. The response to the last drug is similar to that provoked by adrenaline. (Representative of 6 experiments).

Potencial de membrana

Nicotina 10 µM provocó una rápida despolarización del potencial de membrana que alcanzó un valor de 37,3 ± 0,9 mV (n = 23) sobre el potencial basal (Fig. 3). Lo anterior implica que la aplicación de nicotina 10 µM a la célula endotelial en control de corriente (0 µA), hace que el potencial de membrana cambie de un nivel de reposo de aproximadamente -50 mV a un estado de despolarización cercano a -10 mV. Idéntico resultado se obtuvo con 10 µM de ACh con firmando la naturaleza nicotínica de los receptores implicados (no se muestra). Por otra parte, los datos que tenemos respecto a la acción de CA en el potencial de membrana de las células endoteliales no son concluyentes. Pareciera que induciría una pequeña despolarización que se pierde dentro de las variaciones estadísticas naturales del sistema. Aumentando el número de observaciones podremos, tal vez, en el futuro dilucidar este punto.

Fig. 6. Potencial de membrana (en mV) de la célula endotelial en función del tiempo. Se muestra la despolarización inducida por nicotina (10 µM). (Representativo de 6 experimentos).

Membrane potential (in mV) of the endothelial cell as a function of time. The depolarization induced by 10 µM nicotine is depicted. (Representative of 23 experiments).

DISCUSIÓN

En el presente trabajo se ha establecido que tanto la estimulación colinérgica como la a1-adrenérgica producen un aumento del [Ca2+]i en las células endoteliales de la médula adrenal. Lo anterior nos sugiere dos tareas importantes: a) Una explicación del fenómeno, y b) una discusión respecto de su posible importancia fisiológica.

Si consideramos al efecto de la ACh, podemos proponer un mecanismo razonable y fundamentado: La ACh tiene en las células endoteliales un efecto nicotínico; vale decir, actúa sobre el receptor-ionóforo correspondiente, activando un canal permeable tanto al Na+ como al Ca2+ con lo cual estos iones penetran a la célula produciendo, como en las cromafines, una despolarización suficiente para activar a su vez a canales de Ca2+ dependientes de voltaje, con lo cual se refuerza la entrada de este ión. En estos experimentos hemos mostrado tanto la acción nicotínica de la ACh, como su efecto despolarizante en la membrana de las células endoteliales. Si a lo anterior se añade la descripción de canales de Ca2+ dependientes de voltaje hecha recientemente en endoteliales de médula suprarenal por Vinet & Vargas (1999), se desprende la coherencia de la interpretación sugerida.

Respecto al mecanismo desencadenado por las CA es evidente que hay en juego a lo menos dos. El primer pico de aumento del [Ca2+]i debe ser efecto de un segundo mensajero, dado que depende de depósitos intracelulares y no del Ca2+ externo. La segunda fase de aumento del [Ca2+]i depende parcialmente tanto del Ca2+ externo como de la actividad de canales de Ca2+ dependientes de voltaje. En contradicción con lo anterior, está el hecho que las CA despolarizan muy poco a las endoteliales. Una posible explicación de la contradicción señalada podría ser que los canales de Ca2+ tipo T descritos por Vinet & Vargas (1999) tienen un umbral muy bajo y podrían ser estimulados por muy pequeñas despolarizaciones. Sin embargo, el efecto es sólo parcialmente dependiente del Ca2+ externo, por lo que también podría estar en juego la acción de un segundo mensajero. Obviamente, la dilucidación de este mecanismo deberá ser tarea de otro trabajo.

En relación con la significación fisiológica del aumento del Ca2+ citoplasmático producido tanto por ACh como por CA, creemos que debe ser interpretado a la luz de experimentos que demuestran que este aumento provoca la secreción, por parte de las células endoteliales, de sustancias vasodilatadoras como prostaciclina y óxido nítrico (Moncada et al. 1976, Furchgott et al. 1980, Palmer et al. 1987, Luckhoff et al. 1988, 1990, Watanabe et al. 1992). Nuestra hipótesis, por lo tanto, es que la estimulación de las células cromafines de las adrenales mediante ACh, al mismo tiempo que provoca la secreción de CA, también determina (por acción de la misma ACh y de las CA secretadas) una condición de vasodilatación que se opondría al fuerte efecto (directo sobre la musculatura lisa vascular) vasoconstrictor de las CA. En conexión con lo anterior, se ha informado que otro elemento cosecretado con las CA por las células cromafines, el ATP (adenosín trifosfato) (Rojas et al. 1985), tiene también la propiedad de elevar el [Ca2+]i (Castro et al. 1994) y la formación de prostaciclina en las células endoteliales de la glándula adrenal (Forsberg et al. 1987). Pareciera que toda la secreción de las células cromafines conlleva, en último término, la propiedad de inducir vasodilatación. Es conveniente enfatizar que los datos presentados y discutidos en este trabajo demuestran sólo la existencia de propiedades de la secreción de las células cromafines y de las células endoteliales que podrían permitir su interacción. Creemos que el problema de demostrar que realmente se produce interacciones entre las células puede ser abordado con cocultivo de ambas células. La idea sería despolarizar una cromafina (mediante la técnica de control de potencial, "patch clamp, whole cell") y registro simultáneo del [Ca2+]i de la célula endotelial adyacente. Mediante otras técnicas, Vargas et al. (1998) lograron evidencias de interacciones entre ambas células. Lamentablemente, estos experimentos, aunque muy ingeniosos, estaban basados en la suposición que las endoteliales, en las condiciones experimentales, carecían de canales de Ca2+ dependientes de voltaje, lo que no se constató en las endoteliales usadas.

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue financiado por el proyecto Fondecyt 1960302. Quisiéramos agradecer a la Dra. Maritza Rebolledo por proveernos las glándulas adrenales y al Dr. Alberto Veloso quien tuvo la gentileza de ayudarnos en una sección de la redacción de este trabajo.

LITERATURA CITADA

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Editores Invitados: R. Godoy-Herrera y G. Gajardo
Recibido el 15 de abril de 2000; aceptado el 18 de septiembre de 2000