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Parasitología al día

versión impresa ISSN 0716-0720

Parasitol. día v.25 n.3-4 Santiago jul. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-07202001000300004 

Evaluación epidemiológica de las técnicas de ELISA y
electroinmunotransferencia en el diagnóstico de la
hidatidosis ovina en la XI Región de Chile

DANILO VARGAS*, RAFAEL BONET*, SERGIO CAMPANO**,
TOMAS CHACON** y MACARENA VIDAL*

* Laboratorio de Diagnóstico Molecular (DIAMOLAB), Facultad de Ciencias Silvoagropecuarias, Universidad Mayor.
** Servicio Agrícola y Ganadero, Ministerio de Agricultura, Chile.

EPIDEMIOLOGICAL EVALUATION OF THE ELISA AND WESTERN BLOT TECH-
NIQUES IN THE DIAGNOSIS OF SHEEP HYDATID DISEASE IN THE
XI REGION OF CHILE

With the purpose of optimising the diagnosis of sheep hydatidosis in the XI Region of Chile and contributing to the sero-epidemiological study of this disease, ELISA and Electroimmuno Transfer (E.I.T.) were standarizated and evaluated technical and epidemiologicaly as a screening and reference tests, respectively. A raw extract of proteins taken from hydatid fluid of hepatic ovine cysts was used as antigen for ELISA and a fraction of enriched antigen B was used for E.I.T. The standarization of both tecniques was performed with positive and negative sera from sheeps confirmed by macroscopical inspection in slaugtherhouses and histopatology examination. The evaluation was done in 95 sera samples: 54 with confirmed hydatidosis, 11 sheeps with other ethiologies and 30 sera from apparently healthy animals. ELISA and E.I.T. presented a 83.3% and 97.6% of sensitivity, 75.6% and 100% of specificity, respectively. The Predectives Values, Positive (VPP) and Negative (VPN) are applicable to the Regional prevalence.

Key words: Hydatidosis, ELISA, Western Blot, Antigen B, Diagnosis, Serology.

INTRODUCCIÓN

La hidatidosis es una ciclozoonosis producida por el estado larval de los cestodos de los perros del género Echinococcus en las vísceras de los animales y del hombre y que en Chile corresponde sólo al Echinococcus granulosus1 .

La enfermedad es bien conocida en Africa, Asia, Europa, Australia, América Central y América Sur. Dentro de América del Sur, Uruguay se considera el país en donde se presenta con mayor frecuencia2,3 describiéndose 17,7 casos nuevos por cada 100.000 habitantes4. En similar situación se consideran Argentina, Brasil (Río Grande do Sul) y Perú. En Chile, en 1978 se registraron 879 casos humanos, con una prevalencia de 8,1 por 100.000 habitantes sin embargo, esta cifra es 5 a 10 veces superior en las Regiones australes como son las XI y XII Regiones5,6. Lo mismo sucede con respecto a las infecciones de los animales de importancia pecuaria.

Los datos expuestos significan pérdidas económicas de importancia para nuestro país, tanto en la producción ganadera como en salud humana. En esta última, se traduce en prolongadas hospitalizaciones, que en 1992 promediaron los 22 días, con un costo individual de US $ 2.000 sin considerar las complicaciones post operatorias y los prolongados tratamientos. La importancia en los animales de abasto radica en las enormes cantidades de decomisos de hígados y riñones.

Estas pérdidas han motivado a la División de Protección Pecuaria del Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) del Ministerio de Agricultura, a implementar un Proyecto de Control en la XII Región de Magallanes a partir del año 1979, el cual se extendió a la XI Región de Aysén en 1982 y a la X Región de los Lagos en 19925. El trabajo de laboratorio ha sido indispensable para la evaluación regional inicial como para el seguimiento de su evolución epidemiológica.

El diagnóstico de la hidatidosis humana se ha basado en los antecedentes clínicos, epidemiológicos, imagenología y pruebas de laboratorio. Dentro de estas últimas, se han implementado pruebas inmunoenzimáticas, como DD5, RHAI, ELISA y dot-ELISA con excelentes resultados8,9.

Tradicionalmente, el diagnóstico en animales se realiza mediante la inspección macroscópica de las canales en matadero. En los ovinos menores de 20 meses por presentar quistes hidatídicos muy pequeños se deben hacer exámenes histopatológicos10, sin embargo, por su costo y dificultad de implementación no se realizan. Con el propósito de optimizar el diagnóstico de la hidatidosis en animales vivos, se han implementado diferentes pruebas inmunoenzimáticas, como ELISA y la electroinmunotransferencia (E.I.T). La primera se usa sólo como un tamiz epidemiológico ya que a pesar de su buena sensibilidad, presenta algunas reacciones cruzadas con otros vermes9, debido principalmente a que se usa como antígeno de un extracto crudo de proteínas, proveniente de líquido hidatídico. La E.I.T., gracias a que usa como antígeno un extracto semipurificado, identifica un epítope peptídico especifico por lo que presenta una muy buena especificidad11-13 lo que le otorga el carácter de prueba de referencia para la hidatidosis animal.

El presente trabajo tendrá como propósito la estandarización y evaluación de la ELISA y la E.I.T como técnicas de diagnóstico de la hidatidosis ovina.

MATERIAL Y MÉTODOS

1.- Obtención material biológico: se recolectó líquido hidatídico en forma estéril proveniente de quistes de hígados ovinos, decomisados por personal del S.A.G. en mataderos de la XI Región de Chile, siendo enviados vía aérea a la Facultad de Ciencias Silvoagropecuarias de la Universidad Mayor.

2.- Preparación antígeno: se centrifugó el líquido hidatídico a 5.000 x g a T° ambiente por 30 minutos para eliminar la arenilla hidatídica. Posteriormente el sobrenadante se dializó en membranas de celulosa con diámetro de poro de 12.000 daltons SIGMAÒ contra 100 volúmenes de agua destilada por 48 h a 4°C con 4 cambios consecutivos. El dializado se liofilizó en volúmenes de 30 mL hasta su uso. Este preparado fue utilizado directamente para estandarizar y evaluar la prueba tamiz de ELISA. Respecto de la prueba de E.I.T. el extracto anteriormente mencionado, se resuspendió en 1 volumen de solución tampón de precipitación (Tris 0,05 M, NaCl 0,1 M, pH 8), para su ebullición por 15 minutos y ser centrifugado, el sobrenadante fue nuevamente liofilizado y resuspendido en la misma solución junto a un inhibidor de proteasas (PMSF). La concentración de proteínas, para ambas pruebas, se determinó por el método de Bradford14.

3.- Sueros: la estandarización de la técnica se realizó con sueros obtenidos de muestras de sangre de ovinos con infección confirmada al examen macroscópico y ovinos con diagnóstico macroscópico e histopatológico negativos.

La evaluación de las técnicas se realizó con 95 muestras de suero procedentes de 3 grupos de animales: 54 muestras de ovinos con quiste hidatídico confirmados y 41 muestras de ovinos sin quistes hidatídicos a la inspección macróscopica de los cuales 11 presentaron otras patologías y/o parasitosis (3 fasciolosis, 2 Thysanosoma actinoides, 1 Cysticercus tenuicollis y 5 linfoadenitis caseosa) y 30 ovinos aparentemente estaban sanos.

4.- Prueba de ELISA: el ensayo se ejecutó según la metodología por Coltorti15 y modificada por Vargas y colaboradores9.

Las lecturas se efectuaron en un densitómetro automático de ELISA (DYNEX II) con filtro a 490 nm. Cada muestra fue estudiada por duplicado y los resultados se expresaron como el promedio de absorbancia. El "cut - off", se determinó por la suma entre el valor promedio de los sueros controles nega-tivos más tres veces su desviación estándar. En cada microplaca se incluyeron 3 sueros negativos y uno positivo.

5.- Electroinmunotransferencia: el SDS-PAGE se resolvió según protocolo descrito por Laemmli16 con algunas modificaciones. Se utilizó una concentración de monómeros del 10% para el gel separador y 5% para el gel concentrador, usando 40 mA y 20 mA, respectivamente. La electroforesis se efectuó con una solución tampón de corrida (Glicina 190 mM, Tris 25 mM, SDS 0,1% (p/v), pH 8,3). En la identificación de los péptidos, se utilizó un indicador de peso molecular preteñido BIO-RADÒ de amplio rango (203 a 21,3 KDa). La muestra de antígeno se diluyó con 2 volumenes de solución amortiguadora de muestra (Tris 0,12 M. Glicerol 20%. SDS 4% b-Mercaptoetanol 10%. Azul Bromofenol 0,1%. H2O c.s.p. 100 ml pH 6,75), y hervidas por 5 minutos antes de ser resueltas.

Los patrones peptídicos, obtenidos por electroforesis SDS-PAGE del preparado antigénico, fueron observados después de la utilización de soluciones de: fijación (metanol 40% v/v, ácido acético 7% v/v y H2O 53% v/v), tinción (Azul brillante de Coomasie R-250 2,5 mg/mL, metanol 40% v/v, ácido acético 7% v/v y H2O 53% v/v) y destinción (metanol 20% v/v, ácido acético 7% v/v y H2O 73% v/v).

El antígeno adsorbido en los geles fue transferido a filtros de nitrocelulosa (0,45 mm) en una cámara de trasferencia BIO-RADÒ semi-seca por 20 minutos a 15 V utilizando una solución tampón de transferencia [48 mM Tris, 39 mM Glicina (20% Metanol), 1,3 mM SDS, pH 9,2]. La nitrocelulosa se bloqueó en solución tampón tris-salina [10 mM Tris, 0,9% NaCl (p/v), pH 7,5] con leche descremada al 5%. Posteriormente la nitrocelulosa fue almacenada a -20° C hasta su uso.

Los sueros control y problemas se incubaron junto a los filtros de nitrocelulosa en una solución de TBS/leche descremada 1%, a una dilución previamente estandarizada, 1/100 por 90 minutos a temperatura ambiente, seguido de 3 lavados con TBS 1%. Las nitrocelulosas con los anticuerpos adsorvidos se incubaron con el conjugado anti-IgG ovino policlonal marcado con peroxidasa (Sigma) a una dilución 1/1.000 según estandarización, los lavados y tiempo de incubación fueron los mencionados para los sueros.

El revelado se efectuó con el sustrato 4-Cloro 1-Naftol en solución tampón TBS y H2O2 por 20 minutos en cámara oscura, la reacción se detuvo adicionando abundante agua.

6.- Validación epidemiológica de ELISA y E.I.T: para validar la ELISA como prueba tamiz, se ensayo sobre 1.783 muestras serológicas de una población ovina aparen-temente sana. Para validar la E.I.T como prueba de referencia se aplicó a las muestras que resultaran positivas en la validación de ELISA.

RESULTADOS

La Figura 1, muestra la diferencia entre los preparados antigénicos utilizados para ELISA (carril 1) y E.I.T. (carril 2). El proceso de enriquecimiento de la fracción antigénica B, permite disminuir considerablemente los epítopes de 63 Kda, correspondientes a subunidades menores del antígeno 5 de Caprón y concentrar los péptidos de 19 y 21 KDa, caracterizados como subunidades del antígeno B.


Figura 1. Carril M: Resultados de E.I.T. peso molecular preteñido amplio rango BIO-RADâ. Carril 1, 2: Sueros ovinos positivos. Carril 3: Sueros ovinos negativos. SDS-PAGE de los preparados de quiste hidatídico ovino, procesados según material y método.

La Figura 2, muestra el resultado del revelado de las tiras de nitrocelulosa con antígeno B adsorbido e incubadas con sueros ovinos aparentemente sanos y conjugado anti IgG ovino, se dispone la presencia del antígeno B en la forma de patrones peptídicos de aproximadamente 19 y 21 KDa, correspon-dientes a sueros ovinos positivos a hidatidosis.


Figura 2. Carril M: Indicador peso molecular preteñido amplio rango BIO-RADâ. carril 1: Antígeno hidatídico ovino crudo (50 mg). Carril 2: Antígeno hidatídico ovino semi purificado (50 mg). Resultados de E.I.T. para sueros ovinos positivos y negativos contra los epítopes del antígeno B, caracterizados en aproximadamente 21 y 19 Kda.

La Tabla 1, resume los resultados obtenidos con la prueba de ELISA para hidatidosis en muestras de sangre ovina con esta parasitosis y otras patologías. Como puede deducirse, de los 41 ovinos sin hidatidosis 10 muestras (24,5%) reaccionaron positivas. La concordancia de los resultados en los 95 sueros ovinos utilizados como control, se alcanzó en 76 muestras (80%) con una discordancia de 19 muestras (20%). La Tabla 2, describe los resultados de acuerdo al tipo de patología.

Tabla 1. ELISA para hidatidosis en 54 ovinos con confirmación de infección
hidatídica y 41 ovinos sin presencia macroscópica de la infección


Infección ELISA
Positiva
ELISA
Negativa
Total
Animales

Hidatidosis 45 09 54
Sin hidatidosis 10 31 41
       
Sensibilidad 83,3%    
Especificidad 75,6%    
VPP 81,8%    
VPN 77,5%    

Tabla 2. ELISA para hidatidosis en 54 ovinos con quistes hidatídicos confirmados, 11
ovinos con otras patologías y en 30 ovinos aparentemente sanos


ELISA
Infección
Positivos
Negativos
Total
  % % %

Hidatidosis 450 83,3 9 16,2 54 100
Otras Parasitosis 2 18,2 9 81,8 11 100
Fasciolosis 0 000 0   03 100
Thysanosoma actinoides 1 050 1 050 02 100
Cysticercus tenuicollis 0 000 0   01 100
Linfoadenitis caseosa 1 020 4 080 05 100
Ovinos aparente sanos 8 26,3 220 73,3 30 100

La Tabla 3, resume los resultados obtenidos con la prueba de E.I.T.; de los 41 ovinos sin hidatidosis 1 (2,4%) reaccionó positivo, alcanzando una concordancia en 94 muestras (99%) con una discordancia en 1 muestra (1,1%). La Tabla 4, describe los resultados según el tipo de patología.

Tabla 3. Electroinmunotransferencia para hidatidosis
en 54 ovinos con confirmación de infección hidatídica
y 41 ovinos sin presencia macroscópica de la infección


Infección

E.I.T.
Positiva
E.I.T.
Negativa
Total
Animales

Hidatidosis 54 00 54
Sin hidatidosis 1 40 41
       
Sensibilidad 97,6%    
Especificidad 100%    
VPP 98,2%    
VPN 100%    

Tabla 4. Electroinmunotransferencia para hidatidosis en 54 ovinos con quistes hidatídicos confirmados, 11
ovinos con otras patologías y en 30 ovinos aparentemente sanos


Electroinmuno transferencia
 
Positivos
Negativos
Total
  % % %

Hidatidosis 540 10000 0 000 540 100
Otras Parasitosis 0 0 110 100 110 100
Fasciolosis 0 0 3 100 3 100
Thysanosoma actinoides 0 0 2 100 2 100
Cysticercus tenuicollis 0 0 1 100 1 100
Linfoadenitis caseosa 0 0 5 100 5 100
Ovinos aparente sanos 1 3,3300 290 96,660 300 100

La Tabla 5 muestra los resultados de validación epidemiológica de ELISA como prueba tamiz y la Tabla 6 describe la validación epidemiológica de E.I.T. como prueba de referencia a las 422 muestras seropositivas obtenidas por ELISA.

Tabla 5. Validación epidemiológica de la prueba de
ELISA sobre 1.783 muestras serológicas de ovinos
aparentemente sanos de la XI Región de Chile


ELISA

Animales
Aparentemente Sanos

%


Positivo

0422 23,7
Negativo 1.361 76,3
Total (N°) 1.783 0100

Tabla 6. Validación epidemiológica de la prueba de
E.I.T. sobre 422 muestras ovinas seropositivas a la
prueba tamiz de ELISA


E.I.T.

Animales
Aparentemente Enfermos

%


Positivo

365 86,5
Negativo 057 13,5
Total (N°) 422 0100

DISCUSIÓN

La selección de una prueba inmuno-diagnóstica, se basa principalmente en la calidad del preparado antigénico, así como, en las propiedades intrínsecas de la misma, como sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivos y negativos. Disponer de un preparado antigénico que se caracterice por presentar péptidos que no formen parte de comunidades antigénicas con otros helmíntos, permite que la técnica utilizada disminuya los resultados falsos positivos. En este contexto el antígeno B descrito por Oriol17, ha mostrado bastante género específico13. Nuestros resultados,

respecto de la caracterización por SDS-PAGE de extractos proteicos semipurificados del antígeno B, evidencian péptidos entre aproximadamente los19 y 21 KDa (Figura 1), los cuales, por sus pesos moleculares, pueden ser considerados dentro de los rangos citados por otros investigadores11,18,19 para el complejo peptídico B. Disponer de un extracto antigénico con estas características, que involucra el tratamiento con fuerzas iónicas y temperatura, permite disminuir los resultados inespecíficos por reacciones cruzadas principalmente, debido a la presencia en el extracto de componentes del antígeno 5 de Caprón20, que se caracteriza por sus epítopes de fosforilcolina21,22, que también se presentan en otras infecciones parasitarias en el ganado ovino, como fasciolosis, cisticercosis, entre otras y que en nuestro preparado antigénico disminuyen notablemente.

Sin embargo, poseer un extracto antigénico crudo para el diagnóstico de la hidatidosis ovina por técnicas de tamizaje, como por ejemplo ELISA, presenta la ventaja de disponer de un diagnóstico oportuno en el animal vivo, rápido, de bajo costo y sensible. Lo que a su vez se traduce en resultados confiables desde el punto de vista de los resultados negativos. Sin embargo, las muestras positivas requieren ser sometidas a una prueba de referencia posterior.

Durante la implementación de las pruebas de ELISA y E.I.T., se muestra que ambos antígenos; el preparado proteico crudo como la fracción enriquecida del antígeno B, fueron altamente inmunogénicos con sueros ovinos controles positivos, utilizados en la estanda-rización de las técnicas y en su aplicación en el estudio de hidatidosis ovina en una población aparentemente sana procedente de la XI Región de Chile (Tablas 1- 4). La estandarización para ELISA muestra una saturación por pocillo de 0,1 mg/pocillo, a diluciones óptimas de suero y conjugado de 1/800 y 1/2.500, respectivamente y que concuerdan con los rangos citados en estudios efectuados para esta parasitosis en la especie humana por otros investigadores23-25.

Respecto de la técnica E.I.T. la estandarización mostró valores de saturación óptima de antígeno entre 80-100 mg/cm2 del volumen del pocillo, a diluciones óptimas de suero y conjugado 1/100 y 1/1.000, respectivamente, con tiempos de transferencia, temperatura y voltaje constante de 15 minutos, 20-25°C y 20 Volts, respec-tivamente.

La prueba de ELISA alcanzó una sensibi-lidad y especificidad del 83,3% y 75,6%, respectivamente y los resultados obtenidos en nuestro estudio para VPP y VPN técnicos (independientes de la prevalencia regional), alcanzan a 81,8% y 77,5%, respectivamente. Estos antecedentes aplicados a la prevalencia regional de la parasitosis en ovinos adultos, entregan un VPP de un 51,14%, un VPN de un 93,67%. Dado estos valores predictivos se puede observar que la prueba de ELISA presenta una elevada probabilidad que un animal sea realmente negativo, disminuyendo así los falsos negativos. La prevalencia técnica de ELISA alcanza al 23,66% y los informes de mataderos procedentes de la XI Región de Aysén, muestran un 23,45%26, existiendo una correlación entre ambos indicadores (indirecto, directo) de un 99%. Sin embargo, los estudios de concordancia de la técnica de ELISA a través del índice de Kappa frente al panel de sueros controles mostró un valor de 0,61 que es considerado en la categoría Bueno por la OPS27 y confirma su aplicabilidad de ELISA como prueba tamiz de la hidatidosis ovina.

La sensibilidad obtenida por E.I.T. (97,6%) fue superior a ELISA, probablemente a la elevada concentración de epítope B utilizado en los ensayos (1 mg/mm2 del volumen del pocillo), con lo cual se logra identificar cantidades mínimas de complejos inmunes (antígeno-anticuerpos). La especificidad lograda (100%) se relaciona directamente, con el preparado antigénico, anteriormente discutido, además de las condiciones básico analíticas previamente estandarizadas, tales como tiempo de transferencia y voltaje, entre otras.

Lo anteriormente expuesto confirma la necesidad de realizar una prueba de referencia, que permita identificar los animales falsos positivos por ELISA. La técnica de referencia a utilizar debe presentar parámetros seroepide-miológicos muy elevados, donde el preparado antigénico a utilizar es preponderante en los resultados a obtener. En nuestro estudio, la técnica de E.I.T. mostró un índice Kappa, que está referido a la concordancia de un mismo panel de sueros controles frente a diferentes métodos de diagnóstico, de un 0,98 considerado muy bueno por la OPS27; confirmando la necesidad de realizar una prueba de referencia a un tamizaje previo. Además los valores predictivos técnicos para E.I.T. fueron de un 100% para los sueros controles positivos (VPP) y de un 98,18% para los sueros controles negativos (VPN). Estos valores predictivos al ser aplicados a la prevalencia regional de la parasitosis en ovinos adultos, alcanzan un VPP de un 100% y un VPN de 99,27%. De esta forma se ve incrementado enormemente la probabilidad que un animal positivo lo sea realmente, además la prevalencia técnica de E.I.T. es del 20,5%, cuya correlación con la prevalencia regional alcanza al 87,4%, levemente inferior a la observada por la prueba de ELISA (23,66%). Lo anterior podría ser atribuido a la falta de péptidos inmunogénicos, dado el proceso de concentración, el cual descartó a péptidos de 8 Kda presentes en un extracto proteico crudo.

Si se analizan ambas pruebas, existe una correlación entre ellas de un 86,5%, lo que indica la probabilidad que un animal positivo a ELISA también lo sea a E.I.T.

A pesar de la especificidad demostrada por E.I.T. para el complejo antigénico B, se recomienda la utilización de esta técnica sólo como referencia a un tamizaje preliminar (autores), sensible como lo es la prueba de ELISA, ya que requiere tiempo su implementación; adquirir equipos y capacitar el profesional que la ejecuta.

Estos antecedentes fortalecen la aplicación de ambas pruebas a estudios seroepidemiológicos, como herramientas técnicas para el diagnóstico en el animal vivo y de esta forma complementar las actuales políticas implementadas por el SAG en las regiones sujetas a Programas de Control permitiendo verificar toda la masa ovina en el área sin depender de los resultados entregados por la inspección macroscópica en matadero. Además de realizar vigilancia epidemiológica oportuna para evitar diseminación de estados larvales para completar el ciclo por el hospedero definitivo y por ello efectuar controles oportunos. Lo anterior permitirá alcanzar niveles de consolidación de un programa antes que aquellos que no efectúan este tipo de actividades.

Cabe destacar que estas técnicas se pueden hacer extensibles al diagnóstico de hidatidosis en otras especies, previa estandarización técnico-epidemilógica de las mismas.

RESUMEN

Con el propósito de optimizar el diagnóstico de la hidatidosis ovina en la XI Región de Chile, y contribuir a los estudios seroepide-miológicos de esta enfermedad, se estanda-rizaron y evaluaron técnica y epidemioló-gicamente ELISA y E.I.T. como pruebas de tamiz y referencia, respectivamente. Un extracto crudo de proteínas obtenidas de líquido hidatídico proveniente de quistes ovinos hepáticos fue usado como antígeno para ELISA y una fracción de antígeno B enriquecido se utilizó para E.I.T. La estandarización de ambas técnicas fue realizada con sueros ovinos positivos y negativos confirmados por inspección macroscópica en mataderos y examen histopatológico. La evaluación fue realizada en 95 muestras de sueros: 54 con hidatidosis confirmada, 11 ovinos con otras etiologías y 30 sueros de animales aparentemente sanos. ELISA y E.I.T. presentaron un 83,3% y 97,6% de sensibilidad y un 75,6% y 100% de especificidad, respectivamente. Obteniéndose Valores Predictivos, tanto Positivo (VPP) como Negativo (VPN) aplicables a la prevalencia Regional.

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