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Parasitología al día

versión impresa ISSN 0716-0720

Parasitol. día v.25 n.1-2 Santiago ene. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-07202001000100001 

Anticuerpos IgA secretorios de la leche materna
protectores contra la infección por
Cryptosporidium parvum

ROSA CASTILLO*, ROBERT GILMAN**, ELBA MIRANDA*, MARIANO ECHEVARRIA***,
JORGE LEMBCKE*** y CHARLES STERLING****

SECRETORY IgA ANTIBODIES BREAST MILK PROTECTED AGAINST
INFECTION BY Cryptosporidium parvum

The protective effect of breast milk from 150 women on infection produced by protozoa Cryptosporidium parvum of children under 2 years old living in a shantytown nearby Lima, Perú was studied. Breast milk had specific secretory Inmunoglobulin A (sIgA) antibodies to C. parvum antigen determined by Inmunoelectrotransfer blot (EITB) assay. Each mother secreted milk with different composition of specific secretory IgA antibodies against 15 proteins of C. parvum antigen with molecular weight 15-158 k-Da, remained constant during the 24 month lactation period. The risk of C. parvum infection was reduced in children breast milk with specific secretory IgA against proteins of high molecular weight C. parvum antigen (158, 123 y 97 k-Da), protecting the breast fed baby from infection.

Key words: Cryptosporidium parvum; breast milk; secretory Immunoglobulin A.

* Laboratorio de Parasitología, Dpto. de Microbiología, Universidad Peruana Cayetano Heredia, Perú. 4469@upch.edu.pe
** Department of International Health, Jhons Hopkins University, Baltimore, USA.
*** Departamento de Nutrición, Facultad de Zootecnia, Universidad Nacional Agraria la Molina, Perú.
**** Department of Veterinary Science, The University of Arizona, USA.

INTRODUCCION

Las infecciones gastrointestinales causadas por virus, bacterias y parásitos producen diarreas que causan alta morbilidad y mortalidad de infantes de países en desarrollo. En el Perú, la incidencia es de 9,8 episodios diarreicos por niño en el primer año de vida, 7% de estos episodios son asociados al protozoo Cryptospo-ridium parvum.1 Este protozoario habita los bordes de las microvellosidades del intestino delgado o grueso.2 La cryptosporidiosis en humanos se presenta como una infección clínica limitada por sí misma en pacientes normales o como una diarrea crónica en individuos inmunológicamente comprometidos produciendo infecciones crónicas diarreicas que causan severa deshidratación y muerte.3 Este parásito es causa de muerte en niños como en personas con SIDA.2-4 Por otro lado, se ha observado menor prevalencia de diarrea en niños que recibieron lactancia materna exclusiva que en niños alimentados con leche artificial. La leche materna, además de proporcionar una adecuada nutrición, mejora la inmunidad del lactante.5 Las IgAs son sintetizadas por los linfocitos B de las glándulas mamarias y están conformadas por dos moléculas de IgA monomérica unidas en forma covalente por un péptido (componente secretor) que resiste la degradación enzimática y cambios de pH. Los antígenos atrapados en la mucosa por IgAs específicas forman un complejo vulnerable a la digestión proteolítica.6

El objetivo del presente trabajo fue evaluar el efecto protector de los anticuerpos Inmunoglo-bulinas A secretoria de la leche materna sobre la infección por el protozoo C. parvum.

MATERIAL Y METODOS

El estudio se realizó en un pueblo joven del distrito de San Juan de Miraflores en la cercanía de Lima, Perú. En este estudio se incorporó a 230 mujeres en los últimos meses de gestación y a sus hijos recién nacidos que fueron observados durante 24 meses. Se incluyó a todos los sujetos que cumplieran con los siguientes criterios de selección: Madres que proporcionen por lo menos 4 muestras de leche durante la lactancia (una al inicio, otra al final y 2 muestras intermedias); niños menores de 3 meses de edad al inicio del estudio que permitan realizar seguimiento no menos de 12 meses y que proporcionen muestras de heces cada semana durante 24 meses.

Para la identificación de ooquistes de C. parvum se usaron los métodos de coloración ácido resistente modificado por Kinyoun, sedimentación de Ritchie7 y prueba de Inmunofluo-rescencia indirecta empleando anticuerpos Monoclonales.8

Se colectaron muestras de leche materna cada semana y luego se clarificaron con 2 volúmenes de EDTA al 0,05M, seguido de centrifugación a 6.000 rpm durante 10 minutos. La fase acuosa fue guardada en alícuotas de 500 ul a -20°C. Los anticuerpos IgAs de leche materna fueron evaluados por las pruebas de Inmunoensayo Enzimática (ELISA) y Electro-inmunotransferencia Blot (EITB) usando como antígeno el ooquiste de C. parvum proveniente de heces de terneros infectados; los ooquistes fueron lavados y concentrados por el método de Sheather.9 Se guardaron a 4°C y al día siguiente se lavaron 5 veces por centrifugación con fosfato salino a 3.000 rpm por 15 minutos, se separó el sedimento y se rompieron los ooquistes sonicandolos a 20% de pulsaciones por ciclo de una fuente al 100% durante 3 minutos con intervalos de un minuto de reposo a 4°C. La cantidad de proteínas en el solubilizado fue de 13 mg/ml, determinado por el método de Bradford10 y se guardó a -70°C. Se realizó la prueba de ELISA11 para la identificación de muestras de leche con altos títulos de IgAs. Se determinó IgAs específica en 150 muestras de leche materna contra proteínas del ooquistes de C. parvum por EITB.12 Esta prueba separó el antígeno en sus diferentes componentes proteicos de acuerdo al peso molecular por electroforesis en gel de poliacrilamida al 12%. Luego las proteínas fueron transferidas por electroforesis sobre papel de nitrocelulosa, donde fue enfrentado con muestras de leche materna para detectar IgAs. Se usó la enzima peroxidasa para localizar el antígeno-anticuerpo. Se determinó el peso molecular de fracciones proteicas del antígeno usando estándares preteñidos comerciales de alto peso moleculares de 14.300 a 200.000 Daltons y de bajo peso molecular de 3.000 a 43.000 Daltons.

Los datos obtenidos del diagnóstico parasitológico, peso molecular de las fracciones proteicas del antígeno que reaccionaron con los anticuerpos de la leche materna y la evaluación nutricional, fueron organizados en una base de datos diseñada en el paquete Foxbase plus. Para el análisis estadístico se usó un paquete estadístico (Statistical Package for the Social Sciences-SPSS).

Los datos de análisis de leche materna, de niños infectados y sanos fueron comparados por la prueba de Chi-cuadrado (2x2).

RESULTADOS

De las 230 madres evaluadas, 150 y sus niños cumplieron con los criterios de selección, sus edades fluctuaban entre 15 y 41 años y la edad de los niños entre 1 y 4 meses. Al inicio del estudio la mayoría de los niños (93%) tenían de 0 a 2 meses de edad.

En el presente estudio se determinó por EITB IgAs específicas, contra 15 fracciones proteicas del antígeno de C. parvum, cuyos pesos moleculares van de 15 a 158 kDa (Figura 1 y Tabla 1). Cada una de las 16 muestras de leche materna provenientes de 16 diferentes madres mostraron presencia de IgAs contra las diferentes fracciones proteicas del antígeno de C. parvum. Se ha encontrado que cada madre secreta leche con IgAs con un patrón característico diferente de las otras madres. Al evaluar cada una de las 4 muestras de cada madre, durante 18 meses de seguimiento, no se encontró diferencias significativas intraindividuales (Figura 2). Como se determinó que en el transcurso del seguimiento no había variación en las características de anticuerpos de leche materna, se evalúo tan solo una muestra de leche por cada madre.

Figura 1. Proteínas del antígeno de Cryptosporidium parvum reconocidas por los anticuerpos IgAs presentes en una mezcla de muestras de leche materna.

Figura 2. Proteínas del antígeno de Cryptosporidium parvum reconocidas por los anticuerpos IgAs presentes en cada una de las cuatro muestras de leche de cada madre. Nótese que la cantidad de fracciones proteicas son similares en cada madre.

Tabla 1. Ingestión de leche materna y presencia de IgAS contra
15 fracciones proteicas del antígeno de Cryptosporidium parvum

La mayoría de las 150 muestras mostraron que poseían anticuerpos contra las fracciones proteicas de alto peso molecular, pero no así para las de bajo peso molecular.

A los dos años de edad, 87 niños (58%) se habían infectado con C. parvum y 63 niños permanecieron sanos.

Los niños que se mantuvieron sin infección durante los 24 meses de seguimiento lactaron en un mayor porcentaje leche que contenía IgAs específicas contra 3 proteínas de alto peso molecular del antígeno de C. parvum (158, 123 y 97 kDa), a diferencia de los niños infectados que lactaron en menor porcentaje leche con presencia de estos anticuerpos específicos, mostrando diferencia significativa, p < 0,01 (Tabla 1).

Al evaluar la presencia simultánea de estas IgAs en la leche se encontró que los niños sanos lactaron en mayor porcentaje con mayor presencia de estas inmunoglobulinas en comparación con los niños infectados, mostrando diferencias altamente significativas, p < 0,01 indicando que estas IgAs son importantes para la protección del lactante contra la infección por C. parvum (Tabla 2).

Tabla 2. Presencia simultánea de anticuerpos en la leche materna
que dan protección contra la infección por Cryptosporidium parvum

DISCUSION

Muchos aspectos de la inmunidad humoral y celular ocurren en repuesta a la infección por C. parvum pero aún no están bien definidos.8, 13, 14 Se ha detectado, por western blot, elevados niveles de anticuerpos IgE e IgA en sueros humanos como respuesta a las infecciones por C. parvum contra los antígenos proteicos de 20 a 23 kDa que pertenecen a la superficie del esporozoíto del parásito.13 De igual forma existen evidencias de transferencia pasiva de Ig contra C. parvum a través de la sangre del cordón umbilical de madres peruanas15 y del calostro, siendo importantes para la protección de infantes con infecciones producidas por C. parvum,9 esto evidencia una fuerte transferencia pasiva de anticuerpos de la madre al niño que podrían disminuir la posible severidad en la infección.

En este trabajo, evaluamos la importancia del tipo de IgAs específica que contiene la leche materna para dar protección del lactante. Se conoce que el lactante es sensible a diversos antígenos debido a la baja concentración de IgAs en sus secreciones intestinales, pero obtiene IgAs adicionales de la leche materna, cuya concentración es más alta que en suero sanguíneo de la madre.5, 16

En este estudio se observó que la madre secreta leche con diferente composición de IgAs específica contra las 15 fracciones proteicas del antígeno de C. parvum, con pesos moleculares de 15 a 158 kDa, permaneciendo constantes durante los 24 meses de lactación. La ausencia de IgAs específicas contra algunas fracciones del parásito podría deberse al tiempo en que la madre tuvo la exposición antes de la gestación, donde las células de memoria estarían participando activamente en el momento de la producción de la leche, mostrando que una gran mayoría de las madres tienen anticuerpos contra las fracciones de alto peso molecular del antígeno de C. parvum, a diferencia de lo que ocurre en paciente infectados que se detecta mayor anticuerpos IgG contra las proteínas de bajo peso molecular de 20-23 k-Da.13

Los niños sanos lactaron en su mayoría leche con presencia de IgAs específicas contra las fracciones proteicas de alto peso molecular del antígeno de C. parvum (158, 123 y 97 k-Da), siendo estas IgAs las que dan protección al lactante. La ingestión de calostro o leche con presencia de IgAs contra el parásito cobra importancia por que dan protección pasiva del tipo humoral al recién nacido.

RESUMEN

Se evaluó el efecto protector de la leche materna de 150 madres sobre la infección por Cryptosporidium parvum en niños menores de 2 años. La leche presenta anticuerpos Inmunoglobulinas A Secretoria (IgAs) específicas contra el antígeno de C. parvum por la prueba de Inmunoelectrotransferencia blot (EITB). Cada madre secretó leche con diferente composición de IgAs específicas contra 15 fracciones proteicas del antígeno de C. parvum con pesos moleculares de 15 a 158 k-Da, permaneciendo constantes durante la lactación. Existe menor riesgo a la infección por C. parvum en niños que lactaron leche materna con presencia de IgAs específicas contra las fracciones proteicas de alto peso molecular del antígeno de C. parvum (158, 123 y 97 k-Da).

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