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Parasitología al día

versión impresa ISSN 0716-0720

Parasitol. día v.24 n.1-2 Santiago ene. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-07202000000100004 

Monitoreo inmunológico del éxito terapeútico en
fasciolosis ovina empleando un antígeno semipurificado
de < 30 kda

 

IMMUNOLOGICAL MONITORING OF CHEMOTHERAPEUTIC SUCCESS
IN OVINE FASCIOLOSIS USING A SEMIPURIFIED ANTIGEN OF
< 30KDA.

 

TEXIA GORMAN*, CLAUDIA LOPEZ*, FERNANDO FREDES* y HECTOR ALCAINO *

The chemotherapeutic success of a semipurified Fasciola hepatica antigenic fraction of < 30kDa was evaluated in naturally infected sheep using ELISA and a Western blot (WB) assay. Sheep without fasciolosis were sent and kept in pastures where the infection is highly endemic. Serum samples from 15 sheep were monthly evaluated from day 0 to 12 months of infection by sedimentation coprological exams, ELISA and WB. Six months post infection (p.i.), six animals were treated with triclabendazole. Serum samples from sheep free of fasciolosis, sera from infected sheep and from sheep with other parasitic diseases were included as controls. Results obtained, indicated that the treatment effect became obvious by a reduction of antibody levels and a seroconversion to negative of 5 sheep after six months post treatment, however differences in the proportions of positive ELISA results among treated and control animals, became significant earlier, at 4 months post treatment (p < 0.05). The WB assays indicated that at 2 months after treatment, half of the treated sheep did not recognized bands < 30 kDa and a 14 kDa band (both being considered through previous studies as highly sensitive and specific in the diagnosis of fasciolosis). Differences in the proportion of positives in treated and control groups were already statistically significant at 2 months after treatment (p < 0.05). At 5 months after treatment, there was no recognition of both bands in any of the treated group. It was demonstrated through coprological exams and the post mortem examination of the animals, the absolute absence of infection in treated sheep and the presence of F. hepatica infection in control groups. It is therefore concluded that the semipurified fraction < 30 kDa contains polypeptides which might be veryuseful not only from a diagnostic point of view, but also as indicators in predicting chemotherapeutic success in animals treated against fasciolosis.
Key words: Fasciola hepatica immunodiagnosis, fasciolosis chemothera-peutic success, Western blot, ELISA, sheep fasciolosis.

INTRODUCCION

La fasciolosis es una enfermedad parasitaria de gran relevancia en el país causada por Fasciola hepatica, tremátodo que puede afectar a diferentes especies de mamíferos domésticos y silvestres, incluyendo al hombre, por lo que constituye una importante zoonosis. A nivel ganadero, esta parasitosis causa graves pérdidas por disminución en la productividad animal, muertes, costos de tratamiento e importante número de toneladas de hígados decomisados a nivel de mataderos.

Se trata de un parasitismo ampliamente distribuido a lo largo del país, concentrándose en la zona central, desde la IV a la IX Región, con áreas altamente endémicas como la VII Región. Hace excepción la XII Región, la cual es libre de la infección, debido a las condiciones climáticas imperantes en esa zona.1 La prevalencia de esta enfermedad no ha mostrado disminución a lo largo de los años debido a que su control no es fácil por la presencia de reservorios domésticos y silvestres y porque las drogas y esquemas terapeúticos que se disponen, no logran erradicar totalmente la infección.

El principal procedimiento de diagnóstico se basa en la búsqueda de huevos del parásito, método que es sencillo y de bajo costo, pero no es totalmente eficiente porque no detecta infecciones tempranas (cuando las fasciolas son juveniles y no producen huevos), ni infecciones con carga parasitaria baja. La detección precoz de la infección es vital para poder controlar y evitar la diseminación de los huevos del parásito en el ambiente, permitiendo además instaurar tratamientos antes de la patencia de la enfermedad.

Nuevas alternativas diagnósticas han surgido como es el caso de los métodos inmunológicos que detectan anticuerpos los que además de ser sensibles y específicos contra F. hepatica, permiten procesar un gran número de muestras en poco tiempo. Por otra parte, en el rendimiento de las pruebas que detectan anticuerpos, es de gran importancia la calidad del antígeno a ser usado. Es así que, los antígenos crudos o extractos totales de F. hepatica han dado resultados variables, por el importante número de reacciones cruzadas con otros agentes parasitarios, debido a que éstos constituyen verdaderos "mosaicos antigénicos".2

Frente a esta situación, diferentes estudios se han llevado a cabo para identificar y seleccionar fracciones antigénicas de F. hepatica, algunas de ellas demostrando ser relevantes en el diagnóstico de la fasciolosis en animales de nuestro país.3, 4 Mediante técnicas cromatográ-ficas se han semipurificado algunas fracciones de extractos totales de excreción-secreción de F. hepatica, ofreciendo esta fracción antigénica de < 30 kDa interesantes resultados de sensibilidad y especificidad, cuando ésta fue evaluada frente a sueros de diferentes especies animales con fasciolosis.4

El objetivo de este estudio es evaluar la utilidad de la fracción < 30 kDa como indicador de éxito terapéutico en ovinos con fasciolosis sometidos a un tratamiento fasciolicida, contribuyendo de esta forma a la implementación de un método diagnóstico sensible y específico de la fasciolosis animal.

MATERIAL Y METODOS

Animales: Quince corderos sanos procedentes de la Estación Experimental Hidango (INIA), fueron infectados trasladándolos a un predio de la VII Región (Teno), donde la infección es altamente endémica.1 Permanecieron en pastoreo alrededor de un mes y posteriormente se trasladaron a instalaciones de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias de la Universidad de Chile. Se obtuvo sangre (suero) y excrementos de cada animal, antes de la infección ("día cero") y luego quincenalmente por un período de 12 meses, para ser analizados mensualmente mediante ELISA y WB. Empleando exámenes coprológicos de sedimentación, se definió posteriormente, el inicio de la patencia y el curso de la infección. A los 6 meses de infección, 6 de los corderos fueron tratados con 12 mg/kg de triclabendazole (Soforen®, Hoechst-Ciba-Geigy), permaneciendo los 9 restantes como controles. Se obtuvo además muestras de sueros de ovinos procedentes de la XII Región (libres de fasciolosis, controles negativos), de ovinos infectados con hidatidosis, sin F. hepatica y de ovinos con Thysanosoma actinioides sin fasciolosis.

Monitoreo inmunológico: Los sueros de los ovinos tratados y controles se analizaron mensualmente antes y después del tratamiento que se efectuó a los 6 meses de infección, mediante las técnicas de ELISA y WB, empleando la fracción antigénica < 30 kDa, la cual fue obtenida de acuerdo a procedimientos previamente descritos.5

Técnica de ELISA: Esta prueba se realizó en microplacas de fondo plano de 96 pocillos (12 x 8). Las placas fueron incubadas con 100 µl del antígeno semipurificado por pocillo, diluyéndolo en buffer carbonato, pH 9,6 a una concentración de 4 µg/ ml. La incubación se hizo por 3 hrs a 37°C y por toda la noche a 4°C, en agitación constante.

Se bloquearon los sitios activos por 1 hora a 4°C, con PBS-T20 al 0,05% más leche descremada al 3% (PBS-T20-L) en cámara húmeda.

La dilución óptima de los sueros fue de 1/64 en solución PBS-T20-L y el segundo anticuerpo o inmunoglobulina anti-IgG ovina unida a peroxidasa (SIGMA, MO, U.S.A.) se diluyó a 1/4000 en PBS-T20. Como sustrato revelador se utilizó ortofenilendiamina, buffer citrato y H2O al 30% v/v. La reacción se detuvo al adicionar 25 µl de ácido sulfúrico 2,5 M. Las lecturas de DO, se realizaron en un lector automático de ELISA (BDSL Immunoskan Plus) a 492 nm.

Los sueros se analizaron en duplicado y se usó el promedio de sus DO, considerando como positivos a aquéllos sueros cuyas DO fueran mayores al doble de las DO promedio de los 3 controles negativos ("cut off") que se incluyeron en cada placa.6 Para comparar los valores de DO de los sueros de cada ovino, antes y después del tratamiento fasciolicida, se ponderó el valor observado en base a la fórmula recomendada por P fister y col:7

DO (suero día X) x DO promedio (suero control positivoa)
DO promedio (suero control positivo día Xb)

Técnica de Western blot: La electroforesis se llevó a cabo en cámara vertical (Mini Protean II, BioRad Laboratories, CA, U.S.A.), usando geles de poliacrilamida al 12% v/v, empleando el sistema de "buffer" discontinuo, bajo condiciones de reducción. La concentración de la fracción < 30 kDa fue de 05 µg/ul y se empleó un volumen de 300 µl/gel. En el extremo del gel se cargó una solución de proteínas estándares (SDS-7, SIGMA, MO, U.S.A.).

Luego de la separación electroforética, los péptidos se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (NC) aplicando una diferencia de potencial de 100 V (0,25 mA) por 1,5 hrs.8 La NC fue lavada y bloqueada con una solución "buffer" fosfato salino más detergente Tween 20 (PBS-T20) y leche descremada al 5% (PBS-T20-L) por una hora, colocándola luego en un "Multiscreen Aparatus" (BioRad Laboratories, CA, U.S.A.). Los sueros diluidos 1/20 en PBS-T20-L se dispusieron en cada canaleta durante toda la noche a temperatura ambiente y en agitación suave. Luego de sucesivos lavados, la NC se incubó con una solución de inmunoglobulina anti-IgG ovina unida a peroxidasa (SIGMA, MO, U.S.A.), diluida 1/1000 en PBS-T20 (previa titulación con sueros positivos y negativos), por 2 hrs y en agitación. La reacción se reveló con una solución sustrato de diaminobenzidina, H2O2 y PBS-T, hasta la aparición de bandas. La reacción se detuvo sumergiendo la NC en agua destilada.8

Análisis de los resultados: Se analizaron los porcentajes de sueros ovinos reaccionantes al antígeno semipurificado, en relación al total por grupo de animales a lo largo del ensayo (12 meses) observados en ELISA e WB. Los porcentajes se transformaron según el método de Bliss9 para realizar el análisis de varianza correspondiente a un diseño factorial con bloques al azar10 y así estudiar las diferencias existentes entre técnicas, grupos de animales (controles versus tratados) y tiempo de infección. Como prueba de comparaciones múltiples, se utilizó la prueba de Tukey.10 A su vez, las proporciones de positividad de los sueros ovinos (tratados versus no tratados), fueron analizadas estadísticamente empleando la prueba de Fisher.11

RESULTADOS Y DISCUSION

Como se ha señalado en múltiples estudios,3, 12-14 las técnicas inmunológicas ofrecen ventajas en el diagnóstico de la fasciolosis. Lo más destacable, es la detección de la infección en etapas muy tempranas (etapa prepatente), antes de la liberación de huevos al ambiente, lo que permite aplicar tratamientos y otras medidas de control, evitando así la muerte o enfermedad de animales y la contaminación del medio con huevos del parásito.

Empleando ambos métodos con la fracción < 30 kDa fue posible detectar la infección del 100% de los infectados desde el 1,5 mes p.i. El examen coprológico por su parte, permitió demostrar la infección sólo a los 2,5 meses p.i. en 9 de los 15 corderos ya los 3 meses p.i. en todos ellos, situación que se mantuvo en el caso de los corderos controles durante todo el período del ensayo.

Otros autores también han señalado la presentación de anticuerpos específicos en ovinos aún más tempranamente (2 semanas p.i.),15-17 lo que podría explicarse debido a que las infecciones producidas en tales animales fueron experimentales, administrando oralmente en un instante de tiempo, un número significativo de metacercarias por animal (200-400 e incluso hasta más de 1000). Ello implicaría un estímulo antigénico con un reconocimiento inmune más potente, respecto a lo que ocurriría en forma natural, como lo fue el actual ensayo, donde las infecciones se producen gradualmente en el tiempo en que permanecen los ovinos en el potrero. Además en infecciones experimentales, se puede precisar el momento exacto del inicio de la infección, situación que no ocurre en los corderos infectados en el potrero, como fue el caso del presente estudio.

El efecto del tratamiento en los resultados de ELISA se comenzó a observar a los 2 meses p.t. observándose que 2 de los 6 sueros se negativizaron al mes p.t. y al final del ensayo 5 de los 6 sueros, se hicieron negativos (Figura 2). Sin embargo, sólo desde los 4 meses p.t. en adelante estas diferencias de proporciones entre el grupo control infectado y el grupo tratado fueron significativas (p < 0,05) (Figuras 1, 2). A su vez, los niveles de anticuerpos de los ovinos no tratados (controles), fueron fluctuando en el tiempo y permanecieron altos hasta el final del período analizado. El momento en que se alcanzaron los niveles máximos de anticuerpos fue variable, ocurriendo en general, entre los 4 a 11 meses p.i. (Figura 2). Todos los sueros del día 0, los sueros controles negativos a fasciolosis incluidos en cada placa y en los WB así como los "pools" de sueros ovinos con otras parasitosis, demostraron en todos los casos DO negativas y ausencia de reconocimiento antigénico en los WB realizados.

Figura 1. Porcentajes de suero al antígeno semipurificado de F. hepatica (< 30 kDa) observados en el grupo control infectado y en el grupo tratado durante la infección, según ELISA. La flecha indica el momento del tratamiento.


Figura 2. Niveles de anticuerpos (D.O.) registrados en el grupo control y en el grupo
tratado, mediante prueba de ELISA, durante la infección por F. hepatica ("cut off": 0,364).
La flecha indica el momento del tratamiento.

En relación a los resultados obtenidos mediante WB, la banda < 30 kDa comenzó a observarse al 1,5 mes p.i., en 14 de los 15 sueros y en los 15 sueros a los dos meses (Figuras 4, 5). Por otro lado, el polipéptido de 14 kDa fue reconocido notoriamente por todos los sueros a partir de los 2 meses de infección. Ambas fracciones fueron persistentemente reconocidas durante los 12 meses de estudio por todos los sueros del grupo control (Figuras 4, 5). Con respecto al efecto del tratamiento, se pudo observar que ya a los 2 meses p.t., las diferencias entre los porcentajes de sueros reaccionantes positivos entre los ovinos controles y tratados, se hicieron evidentes (Figuras 3, 4) (p < 0,05) puesto que 3 de los 6 sueros de los ovinos tratados, dejaron de reconocer la fracción polipeptídica < 30 kDa y ninguno de ellos reconoció la fracción de 14 kDa (Figura 4). Finalmente, desde los 5 meses p.t. en adelante, ambas bandas dejaron de ser detectadas por los animales tratados (Figura 3, 4, 5). Las diferencias entre las proporciones de positivos entre ovinos controles y tratados fue ron significativas desde los 2 meses p.t. hasta el final del ensayo (p < 0,05). Empleando un extracto total de excreción-secreción de F. hepatica, también se describió el cese del reconocimiento de una banda muy cercana a la empleada en este estudio de 26-28 kDa en sueros ovinos, a partir de 1,5 mes p.t.3 Otros polipéptidos como los de 87 y 69 kDa también han sido señalados como indicadores de éxito terapéutico en infecciones por F. gigantica, ya que ellos dejaron de ser reconocidos por ovinos tratados con oxiclozanida luego de 2 y 6 semanas p.t., respectivamente.18 Así también en humanos, el polipéptido específico de 17 kDa de F. hepatica, desapareció y el de 63 kDa mostró una atenuación evidente de su reconocimiento al año p.t.19

Figura 3. Porcentajes de sueros ovinos reaccionantes al antígeno semipurificado de < 30 kDa de F. hepatica, observados en el grupo control infectado y en el grupo tratado, según Western Blot. La flecha indica el momento del tratamiento.


Figura 4. Sueros ovinos individuales enfrentados al antígeno semipurificado de F. hepatica < 30 kDa dos meses después del tratamiento, según Western Blot.
Carril 1: control negativo, 2: control positivo; carriles 3 al 11: ovinos infectados controles; carriles 12 al 17: ovinos tratados; carril 18: "pool" ovinos con T. actinioides, 19: "pool" ovinos con hidatidosis.
Figura 5. Sueros ovinos enfrentados individualmente al antígeno semipurificado de F. hepatica < 30 kDa seis meses después del tratamiento, según Western Blot.
C: control negativo; A: controles positivos; Oi: ovinos infectados controles; Ot: ovinos tratados; Os: ovinos sanos.

Los sueros controles negativos a fasciolosis y los "pools" de sueros ovinos con hidatidosis o con T. actinioides y sin fasciolosis que se incorporaron en el presente estudio, no reconocieron las fracciones de < 30 y 14 kDa, reiterando con ello la alta especificidad de dichas fracciones. Hubo algunas reacciones débiles hacia los polipéptidos de aproximadamente 40, 50-54 y 55-60 kDa, que fueron consideradas como inespecíficas. (Figuras 4, 5). Por otra parte, el examen post mortem realizado a cada ovino una vez terminado el ensayo, corroboró la presencia de la infección por F. hepatica en los 9 individuos del grupo control, fluctuando su carga parasitaria entre 6 a 190 fasciolas por animal. A su vez, se constató la ausencia de infección en los hígados de los 6 ovinos tratados.

Los resultados obtenidos permiten concluir que este antígeno semipurificado < 30 kDa de F. hepatica, empleado en una prueba de ELISA y de WB, fue capaz de predecir el éxito terapeútico en los ovinos tratados con triclabendazole. Además, al igual que en estudios previos,3-5, 20 se corroboró una vez más la alta sensibilidad y especificidad ofrecida por las fracciones antigénicas de < 30 y 14 kDa. En el futuro sería interesante implementar este antígeno semipurificado en pruebas de fácil realización a nivel de campo, como también conocer la naturaleza y función biológica de estas fracciones inmunorrelevantes. Conjuntamente surge la interesante potencialidad de realizar estudios de evaluación de la efectividad de drogas fasciolicidas en el tratamiento en animales y la verificación del éxito terapeútico especialmente en la especie humana.

RESUMEN

Se evaluó el valor predictivo de éxito terapéutico de una fracción semipurificada de < 30 kDa de Fasciola hepatica, empleando ELISA y western blot (WB) en el reconocimiento antigénico por parte de ovinos infectados. Quince ovinos fueron infectados naturalmente después de permanecer un mes en un predio de una zona endémica. Los ovinos fueron evaluados individualmente cada mes, durante 12 meses, mediante examen coprológico, ELISA y WB. A los seis meses, seis de los quince corderos fueron tratados con un fasciolicida. Se emplearon sueros controles negativos y positivos a F. hepatica y "pools" de sueros ovinos con otras parasitosis y sin fasciolosis.

Los resultados indicaron que el día 0, todos los ovinos y sus sueros fueron negativos a fasciolosis, según el examen coprológico, WB y ELISA respectivamente. El efecto del tratamiento fasciolicida en los 6 corderos tratados, se tradujo en la disminución gradual de los niveles de anticuerpos siendo significativas las diferencias entre tratados y controles a los 4 meses post tratamiento (p.t.) (p > 0,05) y siendo 5 de los 6 sueros de corderos tratados, negativos a ELISA después de 6 meses p.t. Mediante WB, se determinó que a los 2 meses p.t., la mitad de los ovinos tratados no lograron reconocer las bandas de 29 y 14 kDa (consideradas como altamente sensibles y específicas en el diagnóstico de fasciolosis). Hubo diferencias significativas en la proporción de positivos entre los ovinos tratados y controles a los 2 meses p.t. (p < 0,05). A los 5 meses p.t., hubo total ausencia de reconocimiento de las bandas de < 30 kDa y 14 kDa en los ovinos tratados. Los exámenes coprológicos señalaron la ausencia de infección en los corderos tratados, lo que fue corroborado posteriormente por la necropsia, la que a su vez, demostró la infección en los ovinos no tratados. Se concluye que la fracción semipurificada de < 30 kDa ensayada, contiene polipéptidos que ofrecen un gran potencial, no sólo desde el punto de vista diagnóstico sino que también como una herramienta a emplear para predecir el éxito terapéutico después de un tratamiento fasciolicida.

Agradecimientos: Los autores agradecen el apoyo estadístico de la Dra. María Angélica Morales de la Facultad de Ciencias Veterinarias de la Universidad de Chile.


* Depto. Medicina Preventiva Animal, Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias. Universidad de Chile. Casilla 2 Correo 15. Santiago, Chile. tgorman@abello.dic.uchile.cl
Financiado por Pr. FONDECYT 194-0245.

a Promedio de todos los sueros controles positivos procesados en días diferentes del ensayo.
b Promedio de todos los sueros controles positivos procesados en un día x de ensayo.

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