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Parasitología al día

versión impresa ISSN 0716-0720

Parasitol. día v.22 n.1-2 Santiago ene. 1998

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-07201998000100004 

TRABAJO DE INVESTIGACION


ESTUDIO HISTOPATOLOGICO EN RATONES INFECTADOS
EXPERIMENTALMENTE CON Trypanosoma cruzi

CLAUDIO ZUÑIGA, M. ADRIANA PARRA, HAMILTON VELA*, MARIA TERESITA COURCELLES,
RAMON VARGAS y ULISES VERGARA

HISTOPATHOLOGICAL STUDY IN MICE EXPERIMENTALLY INFECTED WITH
Trypanosoma cruzi

Males and females from A.Sn, HTG, HTI and A.Sw strains of mouse were intraperitoneally infected with 2000 trypomastigotes from Tulahuen strain of Trypanosoma cruzi. All mice from A.Sn and HTG strains were equally susceptible (100% mortality) to the parasite infection, while males and females from A.Sw and HTI mouse strains were resistent (100% survival). However males from A.Sw, HTG and HTI strains showed significantly higher level of parasitemia than the corresponding females. The possible effect of parasitemia on tissue pathology and mice mortality was evaluated by comparing the histopathology of miocardial and skeleton muscle in the susceptible and resistant strains of mice. In the first ten days post infection no significant differences in tissue damage were observed between susceptible and resistent strain of mice. However in the third week of infection while A.Sw and HTI mice showed recovery of tissue lessions, the susceptible A.Sn and HTG showed increased tissue damage although no blood forms and no intracellular parasites were detected.

Key words: Trypanosoma cruzi; Experimental trypanosomosis; Histopathological study.

Agradecimientos: Este trabajo fue financiado por SAREC/SIDA, Proyecto 1960949 FONDECYT/Chile.

Unidad de Inmunobiología, I.C.B.M., Campus Occidente, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.
* Laboratorio de Anatomía Patológica, Hospital San Juan de Dios.

INTRODUCCION

El protozoo Trypanosoma cruzi es el agente etiológico de la tripanosomosis americana o Enfermedad de Chagas, que constituye uno de los grandes problemas de salud pública en muchos países de Latinoamerica.1, 2 Desde un punto de vista clínico, en la infección con T. cruzi se distinguen dos fases. En la fase aguda se pueden detectar parásitos circulantes y a veces inflamaciones locales en el sitio de la infección. En la fase crónica no se observan parásitos sanguíneos pero existe un progresivo daño tisular que habitualmente compromete diversos tejidos, especialmente cardiopatías que pueden producir la muerte del individuo afectado.3, 4 Durante esta fase crónica, la sintomatología demora años en aparecer y al no encontrar parásitos en los tejidos afectados se han propuesto mecanismos indirectos, principalmente de tipo autoinmune para explicar el daño tisular.5, 6, 7 Varios autores han descrito, entre otros hechos, una activación policlonal de linfocitos T y B, con un aumento en la producción de autoanticuerpos y una severa inmunosupresión tanto de la respuesta humoral como celular.8, 9 Aunque algunos estudios plantean que epitopos compartidos por el parásito y los tejidos del hospedero podrían ser la causa de la autoreactividad otros resultados parecen indicar que esta intensa activación policlonal no es específica para antígenos del parásito.10
En el presente trabajo se estudia el curso de la infección en cuatro cepas de ratones, asociando susceptibilidad o resistencia con el análisis histopatológico de tejidos de los animales infectados.

MATERIAL Y METODOS

Ratones: Se usaron machos y hembras, de dos meses y medio de edad, de las cepas A/Sn (H-2a), A.Sw (H-2s), HTI (H-2i) y HTG (H-2g) 11.
Parásitos: Se usaron tripomastigotes sanguíneos de la cepa Tulahuen de T. cruzi, que se mantienen en nuestro laboratorio por traspasos sucesivos en ratones C3H.
Evaluación de parasitemia: Grupos de 16 machos y 16 hembras de cada cepa de ratones se infectaron con 2.000 tripomastigotes sanguíneos de T. cruzi. El nivel de parasitemia se determinó cada 3 días a partir del día 4 post infección (p.i.), hasta que las parasitemias fueron negativas. El estudio de parasitemia se realizó según el método de Arias y Ferro,12 tomando en tubos de hematocrito heparinizado una muestra de alrededor de 60 ul de sangre de cada ratón. Luego de centrifugar los tubos a 5000 rpm por 5 minutos se analizó la región leucoplaquetaria para detectar la presencia y cuantificar tripomastigotes sanguíneos. Se estudiaron 50 campos por placa con aumento 40X. Los niveles de parasitemia se expresaron como número de parásitos/ml. El análisis estadístico fue evaluado con la prueba de Student.
Estudio Histopatológico: Un macho y una hembra, de cada una de las cuatro cepas de ratones infectados, se sacrificaron a los 7, 10, 17, 21, 28 y 35 días post infección, para realizar un estudio histopatológico de cortes de corazón y músculo esqueletico. Los tejidos se fijaron en Bouin y luego en formalina, para finalmente incluirlos en parafina. Cortes de 8 um de espesor fueron teñidos con hematoxilina-eosina. La severidad de la inflamación o la presencia de seudoquistes fue descrito según la siguiente escala: + indicaría menos del 25% del área afectada; ++ 25-50% del área afectada y +++ más del 50%.

RESULTADOS

La Tabla 1 muestra los resultados de prepatencia, nivel máximo de parasitemia y mortalidad en ratones, machos y hembras infectados con 2000 tripomastigotes sanguíneos de la cepa Tulahuen de T. cruzi.
Tanto los ratones machos como hembras de la cepa A/Sn y HTG, se comportaron como susceptibles, aunque las hembras sobreviven un tiempo más prolongado que los machos, el 100% de los animales muere finalmente alrededor de las 6 semanas post infección (p.i.). Los ratones de las cepas A.Sw y HTI, se comportaron en cambio como resistentes, sobreviviendo el 100% de los HTI, sin distinción de sexo y el 75% de los machos y 90% de las hembras A.Sw, considerando el tiempo de sobrevida hasta los 8 meses p.i. Al comparar los niveles de parasitemias se observó que los ratones de las cepas HTI y A.Sw presentan los más altos niveles (p < 0,05) (Figura 1). En las hembras no se detectaron diferencias significativas entre las cuatro cepas de ratones. Al comparar machos y hembras, en las cepas HTG, HTI y A.Sw los machos registran valores significativamente más altos que las hembras (p < 0,05 en todos los casos) (Figura 1). Sólo en los ratones A/Sn no hubo diferencias significativas en los niveles de parasitemia de machos y hembras. (Figura 1).
En la Tabla 2 se muestran los resultados del estudio histopatológico de corazón y músculo esquelético de los ratones infectados. Al día 10 p.i., los animales HTI y A/Sn presentan una mayor severidad en las lesiones inflamatorias. Sólo se observó presencia de pseudoquistes en los machos A/Sn y hembras HTI. En los animales HTG a pesar de no detectarse parásitos en los tejidos, se puede ver un aumento progresivo de la inflamación hasta el momento de la muerte, tanto en machos como en hembras. Diferente fue la situación mostrada por la cepa resistente HTI donde se observó una paulatina recuperación de las lesiones en el curso de la infección.

 

DISCUSION

El conocimiento sobre la fisiopatología de la infección de T. cruzi en animales de experimentación ha constituído un avance importante en el estudio de la Enfermedad de Chagas, ya que los modelos experimentales controlados permiten analizar diferentes parámetros dependientes tanto del hospedador como del parásito, lo que por razones prácticas y éticas no pueden realizarse en humanos.

Se ha descrito que no existe una clara relación entre los niveles de parasitemia y la sobrevida de los animales infectados.13, 14 Estudios previos con la cepa Brazil de T. cruzi 15 mostró que cepas de ratones con altos niveles de parasitemia mueren en un lapso corto de tiempo mientras que aquellos con bajos niveles sobreviven a la infección. Sugiriendo que el grado o magnitud de la parasitemia es responsable de la muerte. Sin embargo, este mismo estudio mostró que ratones resistentes de la cepa B10.S infectados con la cepa Perú de T. cruzi presentaba niveles de parasitemia igual o superiores a las de las cepas susceptibles. Nuestros resultados concuerdan con ésta última situación puesto que los machos de las cepas resistentes, HTI y A.Sw, presentaron los niveles más altos de parasitemia. Resulta claro entonces que el nivel de parasitemia es solo uno de los muchos factores involucrados en determinar la susceptibilidad o resistencia a la infección.
Entre los factores genéticos asociados a la resistencia o susceptibilidad a la infección con T. cruzi se encuentra el Sistema Mayor de Histocompatibilidad (SMH) del hospedero.14, 15 Este sistema es un complejo génico cuyos genes codifican la expresión de proteinas involucradas en la respuesta inmune frente a diversos antígenos. Los ratones A.Sw y A/Sn pertenecen a cepas congénicas que difieren solo en el cromosoma 17,16 donde se encuentra ubicado el SMH. Los ratones A.Sw se comportan como resistentes y los ratones A/Sn como susceptibles a la infección con T. cruzi, indicando que el fenómeno estaría relacionado con el SMH o genes ligados. Una situación semejante ocurre con los ratones resistentes HTI y suscerptibles HTG que comparten diferentes regiones del haplotipo H-2b de la cepa B10,11 considerada resistente a la mayoría de las cepas de T. cruzi.
Los resultados de nuestro estudio histopatológico muestran que las lesiones inflamatorias ocurren inicialmente tanto en los animales susceptibles como en los resistentes. En los animales resistentes las lesiones tisulares parecen producidas por la infiltración parasitaria en los tejidos, pero al pasar el tiempo se inducen fenómenos de reparación a medida que la carga parasitaria es controlada por diversos mecanismos inmunológicos. De todas manera, no se puede saber si el animal es capaz de controlar y reparar las lesiones porque sobrevive más tiempo o sobrevive porque se inducen los fenómenos de reparación. Por el contrario, en los animales susceptibles el daño pareciera aumentar progresivamente a pesar de no observarse parásitos circulantes ni en los tejidos, siendo esta situación más evidente en los animales HTG que sobreviven más tiempo. Lo anterior parece indicar que el parásito induce mecanismos indirectos que serían los responsables del daño progresivo y finalmente la muerte. La inducción de fenómenos autoinmunes, ya sea por homología antigénica entre el parásito y tejidos del hospedador o por la presencia de clones autoreactivos que aparecen durante la activación policlonal en la fase aguda, podrían explicar esta situación.17, 18, 19 Pero hasta el momento se conocen los mecanismos que se desencadenan pero no se conocen en detalle las causas que los inducen.
Como en estudios anteriores,20 aparte de las diferencias en los niveles de parasitemia no se evidencian diferencias entre machos y hembras de una misma cepa de raton, ni a nivel de mortalidad ni en cuanto a las lesiones tisulares en la infección con T. cruzi en el modelo murino.

RESUMEN

Se infectaron cuatro cepas de ratones, machos y hembras, con 2000 trypomastigotes sanguíneos de la cepa Tulahuen de Trypanosoma cruzi.
Los animales de las cepas A.Sw y HTI se comportaron como resistentes y los de las cepas A/Sn y HTG como susceptibles, independiente del sexo de los animales infectados. En los casos de las cepas A.Sw, HTG y HTI se observó niveles significativamente más altos de parasitemia en los machos. A nivel histopatológico el daño tisular no presenta inicialmente diferencias significativas entre cepas resistentes y susceptibles, sin embargo, con el tiempo se puede ver que en los animales resistentes se inducen fenómenos de reparación del daño, en cambio en los ratones susceptibles las lesiones parecen aumentar a pesar de no observarse parásitos intracelulares o circulantes.

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