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Parasitología al día

versión impresa ISSN 0716-0720

Parasitol. día v.22 n.1-2 Santiago ene. 1998

http://dx.doi.org/10.4067/S0716-07201998000100003 

TRABAJO DE INVESTIGACION

INMUNODIAGNOSTICO DE FASCIOLOSIS BOVINA
MEDIANTE ELISA Y WESTERN BLOT*

Texia Gorman, Roxana Sanchez, Fernando Fredes y Hector Alcaino

IMMUNODIAGNOSIS OF BOVINE FASCIOLOSIS BY ELISA AND WESTERN BLOT

Immunodiagnosis of bovine fasciolosis was evaluated in terms of its sensitivity and specificity by ELISA and Western blot using a crude excretory-secretory preparation (C E-S) and an E-S partially purified chromatographic fraction of Fasciola hepatica (<30 kDa) as antigens. Serum samples from 52 bovines with natural fasciolosis, 18 without the infection and 48 bovines with hydatid cysts, all checked by post mortem examination, were tested as well. The sensitivity and specificity obtained by ELISA using the C E-S antigens were 53% and 100%, respectively. Likewise, when using the partially purified fraction, the sensitivity of ELISA test increased to 90% with a 100% specificity. The C E-S antigens reacted specifically with sera from infected bovines exhibiting bands of 14, 22, 27-39 and 37-38 kDa in Western blots. When the partially purified fraction was tested, the 28-30 kDa band was consistently detected by sera from all infected bovines and was absent in sera from uninfected as well as in sera from those with hydatid infection. These results indicate that F. hepatica presents different antigens, among which the 28-30 kDa fraction represents polypeptides with diagnostic potential that can be further purified and applied in the immunodiagnosis of bovine fasciolosis corroborating previous results recorded in other animal species.
Key words: fasciolosis, bovine fasciolosis, immunodiagnosis, Fasciola hepatica, antigens.

* Financiado por el Departamento de Investigación y Desarrollo de la Universidad de Chile (DID). Proyecto de enlace E 005/97.
Depto. Medicina Preventiva Animal. Facultad de Ciencias Veterinarias. Universidad de Chile. Casilla 2 Correo 15 Santiago, Chile. Fax: (56 2) 541 6840 Correo electrónico: tgorman@abello.dic.uchile.cl

INTRODUCCION

Dentro de las enfermedades que afectan a los animales domésticos de importancia económica, la fasciolosis es una de las más relevantes y frecuentes provocando graves pérdidas económicas para la empresa ganadera, tanto por el decomiso de órganos afectados, muerte de los animales o menor rendimiento productivo de las especies.1
Debido a las condiciones climáticas de Chile, Fasciola hepatica, se presenta en casi todo el territorio, exceptuando la XII Región.2 Los bovinos de nuestro país son frecuentemente afectados, siendo la zoonosis de mayor prevalencia en los vacunos beneficiados en los mataderos, presentándose en un 30,1% de ellos, durante los años 1989 a 1995.3 Además, es la principal causa de decomisos en todas las especies de abasto.
El diagnóstico de rutina se realiza mediante la observación de los huevos del parásito a través del examen coprológico de sedimentación, método que a pesar de ser sencillo y de bajo costo, no permite diagnosticar la infección en el período prepatente y no es muy eficiente cuando la carga parasitaria es leve. Se agrega a ello la necesidad de realizar exámenes seriados para mejorar la sensibilidad del examen único así como el tiempo que requiere su ejecución (alrededor de 20 minutos por muestra).4
Las pruebas inmunológicas se han planteado como una alternativa diagnóstica. ELISA ("enzyme-linked immunosorbent assay") ha sido ensayada por diversos autores permitiendo incluso un diagnóstico precoz de la infección.5 Al emplear esta técnica con extractos antigénicos crudos o totales (somáticos "S" y de excreción-secreción "E-S") de fasciolas adultas, se logró una sensibilidad y especificidad de sólo 61,7% y 71,1%, respectivamente, en el diagnóstico de fasciolosis crónica en diversas especies.4 Estos resultados se atribuyeron a la riqueza antigénica de los extractos crudos los que dan origen a reacciones inespecíficas o cruzadas con antígenos de otros parásitos concomitantes en estas especies animales.4 De allí que surja la necesidad de caracterizar los antígenos de F. hepatica empleando técnicas como la electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) e inmunoelectrotransferencia o Western blot. Ellas permiten identificar las fracciones polipeptídicas específicamente reconocidas sólo por los sueros de los huéspedes infectados. Así logramos purificar parcialmente productos de E-S de fasciolas adultas mediante fraccionamiento cromatográfico e identificar y seleccionar en el cuarto "peak" cromatográfico, una fracción polipeptídica inferior a 30 kDa. Ella fue reconocida por todas las especies analizadas (incluso en la etapa prepatente de los ovinos infectados) y al ensayarla a través de ELISA, demostró una sensibilidad y especificidad promedio de 96% y 94%, respectivamente, en animales infectados.6 Empleando western blot, esta fracción se evidenció como una banda de 22-30 kDa de alta especificidad y sensibilidad en equinos y porcinos infectados.7
Como la especie bovina no había sido incluida en las evaluaciones previas y debido a la importancia de la fasciolosis bovina, se consideró de interés proceder a realizar un estudio que permita conocer el comportamiento de este antígeno semipurificado en esta especie.

MATERIAL Y METODOS

Antígenos

Se emplearon antígenos crudos o totales E-S de F. hepatica y una fracción semipurificada, conteniendo polipéptidos <30 kDa. Ambos preparados antigénicos fueron extraídos de fasciolas adultas, provenientes de hígados de bovinos afectados por distomatosis.

Antígenos totales E-S:

Luego de su recolección, las fasciolas vivas fueron lavadas 8 veces con una solución salina isotónica para remover los restos de sangre y bilis. Posteriormente fueron incubadas en solución Hedong-Fleig durante 18 horas a 37°C.8 El sobrenadante fue ultracentrifugado a 15.000 x g por 20 minutos, luego dializado en agitación contra agua destilada (con 3 cambios), durante 24 horas a 4°C y finalmente liofilizado, para resuspender a un volumen de 1 ml. El material obtenido (antígeno E-S) se almacenó en alícuotas a -70°C, hasta su utilización.6 La concentración proteica del preparado antigénico fue de 3 µg/l.9

Fracción antigénica semipurificada (<30 kDa)

El extracto crudo de E-S fue semipurificado, mediante cromatografía de exclusión por tamaño molecular.6 Un total de 5 ml del preparado E-S, con un contenido proteico de 3 µg/l9 fueron filtrados a través de una membrana de nitrocelulosa y posteriormente cargados en una columna Sephacryl S-300 (Sigma, MO, U.S.A.) Los eluidos correspondientes a los "peaks" del cromatograma se analizaron mediante SDS-PAGE y posterior tinción de los geles con Azul de Coomassie, con el objeto de identificar aquéllos que poseían la fracción de interés. La concentración proteica de este preparado antigénico fue de 0,5 µg/l.9

Sueros

Se emplearon sueros de 52 bovinos infectados naturalmente con F. hepatica, recolectados previa comprobación de la infección mediante examen post mortem, en plantas faenadoras de la X Región (Osorno). Como controles negativos se contó con 18 sueros de bovinos provenientes de una zona libre de la infección (XII Región) y 48 sueros de bovinos infectados con hidatidosis, según examen post mortem.

Técnica de ELISA

Los antígenos totales E-S y la fracción cromatográfica (<30 kDa) fueron evaluadas mediante ELISA en microplaca, con los sueros mencionados. La prueba se realizó en placas de poliestireno (Nunc, Lab. Intermed, Demark) de fondo plano, con 96 pocillos (12 x 8). Ellas se sensibilizaron con los antígenos (E-S y fracción), diluídos en "buffer" carbonato (pH 9,6), a una concentración de 4 µg/ml8 Como solución bloqueadora se utilizó PBS-T20 y leche descremada al 3% p/v (PBS-T20-L). La dilución óptima de los sueros fue de 1/128 en PBS-T20-L. Como segundo anticuerpo se usó un conjugado anti-inmunoglobulina G bovina unida a peroxidasa (Sigma, MO, USA) en dilución de 1/4000 en PBS-T20. Como sustrato revelador se utilizó ortofenilendiamina, "buffer" citrato y H2O2 al 30% v/v. La reacción se detuvo con ácido sulfúrico (H2SO4) 2,5 M. El resultado de la reacción fue leído en un lector de ELISA (BDSL Immunoskan Plus) con filtro de 492 nm. Cada muestra de suero fue probada en duplicado y expresada con un valor promedio de absorbancia. La interpretación de los resultados de las lecturas ópticas se realizó de acuerdo a la Organización Internacional de Energía Atómica.10
La comparación de los resultados obtenidos a través de ELISA y en el examen post mortem permitió establecer la sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo y negativo de la prueba con ambos preparados antigénicos, resultados que fueron analizados estadísticamente mediante la prueba de Mc Nemar para proporciones dependientes.11

Electroforesis y Western blot o inmunoelectrotransferencia

El extracto crudo E-S y la fracción cromatográfica (<30 kDa) fueron sometidos a SDS-PAGE bajo condiciones de reducción usando minigeles (Mini-Protean II, Biorad Laboratories, CA, U.S.A.) con una concentración de 12% p/v de acrilamida, adicionando en un carril extremo una mezcla comercial de proteínas estándares (SDS-7, Sigma, MO, U.S.A.). Luego de separadas electroforéticamente, las proteínas fueron transfe ridas a una membrana de nitrocelulosa aplicando una diferencia de potencial de 100 V (0,25 mA) durante 90 minutos, a 4°C. La membrana fue lavada y luego bloqueada durante 2 horas con una solución de leche descremada al 5% p/v con PBS-T20 al 0,5% v/v. Esta fue colocada en el "Multiscreen Aparatus" (Biorad Laboratories, CA, U.S.A.) y en cada canaleta se incorporaron los sueros en estudio diluidos 1/10 en PBS-T-L, manteniéndolos durante toda la noche a temperatura ambiente. Después de lavada, se incubó la membrana con una anti-inmunoglobulina G bovina marcada con peroxidasa (Sigma, MO, U.S.A.), diluida 1/1000 en PBS-T, durante 1 hora a temperatura ambiente y agitación. La reacción se reveló sumergiendo la membrana en una solución sustrato formada por diaminobenzidina, agua oxigenada y PBS-T, hasta la visualización de las bandas reconocidas por los sueros.12

RESULTADOS

Extracto antigénico E-S total

Empleando estos antígenos, se observó que de los 52 sueros positivos al examen post mortem, el resultado serológico fue coincidente en 28 (53,8%) de ellos, quedando 24 (46,2%) sueros como falsos negativos. Por otra parte, todos los sueros de vacunos sanos (n = 18), resultaron negativos a la prueba. En tal sentido, los valores de sensibilidad y especificidad obtenidos fueron de 53% y 100%, respectivamente. El detalle de estos resultados se presenta en la Tabla 1. De los 48 sueros de animales infectados con hidatidosis, hubo 18 (37,5%) que presentaron reacción positiva al ensayo.
A su vez, mediante Western blot, se evidenció una variedad de bandas inmunorreactivas, correspondientes a 14, 17-18, 22, 27-29, 37-39, 44 y 53-56 kDa siendo las de 37-39 y 27-29 kDa reconocidas por el 90% y el 100% de los sueros de bovinos infectados, respectivamente. La banda de 14 kDa se presentó con frecuencia de 44% (Tabla 3).

Fracción antigénica semipurificada (<30 kDa)

Al emplear dicha fracción, sólo 5 fueron negativos a ELISA del total de sueros infectados (52), dando una concordancia de 90,4% y una sensibilidad de 90%. Todos los sueros de bovinos sanos, fueron negativos a la prueba, obteniendo así una especificidad de 100% (Tabla 2). Ocho de los 48 bovinos con hidatidosis confirmada, resultaron positivos a la prueba (16,7%).
Al emplear Western blot, la fracción cromatográfica (<30 kDa), evidenció un grupo de bandas de 28-30 kDa que destacó por la especificidad y la nitidez con que fueron reconocidas por todos los animales con fasciolosis. Al igual que con el extracto total se visualizaron otros polipéptidos específicos, aunque menos frecuentes (37-39 kDa y 14 kDa) (Tabla 3, Figura 1). Los sueros provenientes de animales con hidatidosis no reconocieron estos polipéptidos (Figura 1).

DISCUSION

Pese al avance en los conocimientos epidemiológicos sobre fasciolosis y a la existencia de eficientes drogas para tratar a los animales infectados, la prevalencia de la infección bovina continúa siendo alta. El contar con un método de diagnóstico oportuno y eficiente constituye una herramienta fundamental para su control. En este sentido, la prueba de ELISA cumple con los requisitos básicos de ofrecer rapidez y facilidad de implementación, aún cuando su sensibilidad va a estar relacionada a la calidad de los antígenos empleados.
Al emplear la prueba de ELISA con antígenos E-S totales, se determinó una sensibilidad moderada (53%), siendo por lo tanto ineficiente si se la compara con el examen coproparasitario. Similares resultados fueron detectados4 empleando el mismo antígeno en el diagnóstico de fasciolosis crónica en ovinos, equinos y porcinos. Sin embargo, si se analizan los resultados obtenidos con la fracción semipurificada ( kDa), se puede observar que la situación se revierte pues la sensibilidad fue significativamente superior (90%, Tabla 2) sin verse afectada la especificidad de la prueba. Esto coincide con los resultados obtenidos empleando la fracción <30 kDa en otras especies con fasciolosis6 y reafirma la importancia de reconocer y purificar los determinantes antigénicos, para mejorar el rendimiento de la prueba. El hecho de que 5 de los 52 bovinos infectados se diesen por negativos podría interpretarse por una baja carga parasitaria que determinaría un bajo nivel de anticuerpos, ya que se ha observado que animales con mayor carga parasitaria tienden a presentar altos niveles de absorbancia a la prueba.4 Por otra parte, se ha señalado una disminución de las densidades ópticas en los sueros de animales que se encuentran entre la 8ª y 16ª semanas de infección, siendo esto atribuído a un fenómeno "autocurativo" en bovinos.13 La especificidad con ambos antígenos fue óptima y el valor predictivo para los negativos aumentó de 42 a 78% al emplear la fracción semipurificada (Tabla 1 y 2).
La comparación de los resultados obtenidos en ELISA con la fracción cromatográfica de <30 kDa y el examen post mortem, indica que ambos métodos fueron similares (p<0,05) y ello es concordante con resultados anteriores obtenidos en equinos, porcinos y ovinos.6
Se consideró de interés incluir sueros de bovinos con hidatidosis (sin evidencias de infección por fasciola al examen post mortem) para establecer un diagnóstico diferencial, debido a que hidatidosis es una infección parasitaria frecuente en Chile y ambos parásitos poseen una similitud taxonómica compartiendo la misma ubicación en algún momento de su ciclo (hígado).14 Es así que se presentó un 37,5% de sueros bovinos con hidatidosis que reaccionaron positivamente frente al antígeno total E-S, situación que mejoró frente a la fracción cromatográfica ya que el valor disminuyó a 16,7%. Este resultado se atribuye a reacciones cruzadas o inespecíficas, no siendo posible descartar la posibilidad de que se tratase de casos concomitantes de fasciolosis (en etapa prepatente o infecciones muy leves) que no habrían sido pesquisados a través de la inspección sanitaria de matadero. Cabe incluso una posibilidad dificil de descartar y es que se tratase de animales previamente infectados y que fueron sometidos a tratamiento, ya que se ha determinado que la persistencia de los anticuerpos en ovinos infectados es de alrededor de 3 meses después de un tratamiento.15 Lamentablemente no fue posible incorporar en este estudio sueros de bovinos con hidatidosis provenientes de una zona libre de fasciolosis (como la XII Región).
Al analizar el extracto total E-S mediante Western blot, se logró confirmar la presencia de numerosas bandas polipeptídicas reconocidas por los sueros de bovinos infectados entre el rango de 66-14 kDa de variado grado de especificidad y ya descritas en estudios anteriores en especies animales (Tabla 3).6,7,14
Por otra parte, al emplear el antígeno semipurificado (<30 kDa) se constató que los sueros de bovinos con fasciolosis, detectaron polipéptidos que fueron coincidentes con los descritos para el preparado antigénico total y correspondientes a bandas de 28-30 y 14 kDa (Tabla 3). La banda de 28-30 kDa fue altamente sensible y específica, ya que no hubo reacción por parte de los sueros sanos ni de aquéllos con hidatidosis, observándose esto tanto con el antígeno total como para la fracción. Este resultado coincide con las evaluaciones de la fracción frente a otras especies animales infectadas con F. hepatica.6, 7, 14 En el 90% de los bovinos infectados se observó además una banda de alrededor de 37-39 kDa de gran intensidad tanto con el antígeno total como con la fracción. Su presencia en la fracción cromatográfica de < a 30 kDa se explica por un arrastre de polipéptidos de "peaks" anteriores al del que se obtuvo esta fracción. Dicha banda coincide con una de 30-38 kDa descrita como de interés diagnóstico en bovinos y ovinos.16
Finalmente, se puede concluir que la purificación de los productos antigénicas parasitarios permite obtener fracciones de mayor sensibilidad y especificidad gracias a la depuración que se realiza de algunos polipéptidos que dan origen a reacciones cruzadas o inespecíficas. En tal sentido, la banda de 28-30 kDa, al igual que en otras especies animales, se constituyó en una fracción muy promisoria para ser empleada en el inmunodiagnóstico de fasciolosis bovina.

RESUMEN

Se evaluó y caracterizó la respuesta inmune humoral de bovinos naturalmente infectados con Fasciola hepatica frente a un extracto total de antígenos de excreción-secreción (E-S) y a una fracción antigénica semipurificada cromatográficamente (<30 kDa), seleccionada previamente por su eficiencia diagnóstica en otras especies. Ambos preparados antigénicos fueron analizados mediante ELISA en microplaca y electroforesis en geles de poliacrilamida en condición de denaturación (SDS-PAGE) y posterior inmuno-electrotransferencia enzimática o Western blot. Para ello se emplearon 52 sueros de bovinos con fasciolosis comprobada mediante examen post mortem, 18 sueros de animales sin la infección y 48 sueros de vacunos infectados con hidatidosis, perosin fasciolosis. La sensibilidad y especificidad obtenidas en el ELISA con el extracto crudo E-S fueron de 53% y 100%, respectivamente, en tanto que con la fracción semipurificada a igual especificidad (100%) se presentó una sensibilidad mayor ( 90%).
A través de Western blot, empleando el extracto antigénico total E-S hubo un reconocimiento específico de bandas correspondientes a los 14, 22, 27-29 y 37-38 kDa. Las bandas de 37-38 y 27-29 kDa destacaron por su sensibilidad y frecuencia, identificadas por el 90% y 100% de los infectados, respectivamente. Con el antígeno semipurificado, se evidenció una banda polipeptídica de 28-30 kDa, reconocida por todos los sueros con fasciolosis. Los resultados demuestran, por un lado, la existencia de diversas fracciones polipeptídicas que potencialmente pueden ser promisorias en el inmunodiagnóstico de fasciolosis bovina.

REFERENCIAS

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