TRABAJO DE INVESTIGACION

IMPLANTE HISTOLOGICO DE
Trichinella spiralis EXPERIMENTAL

R G REVELES,R VILLALOBOS, S SALDIVAR, M^a ALEJANDRA MORENO

HISTOLOGIC EXPERIMENTAL IMPLANT OF Trichinella spiralis

The present work had the purpose of detecting the presence of Trichinella spiralis in several tissues and serum in a murine experimental model, during their life cycle. We worked with a lot of 200 female rats Long Evans of 2 and a 1/2 months of age which were infected with 500 infective larvae (IL) approximately. The rats were sacrificed beginning at 24 hours post infection until the day 40, using 5 replicats. Samples of intestinal tissues, heart, diaphragms, masseter tongue and thigh of inferior members were taken every week, the digestion of muscular tissues along with the sampling of serum was carried out each date. The IL obtained at the digestion was processed in paraffin sliced and stained with hematoxiline-eosine. The IL obtained after the digestion, were processed in order to obtain soluble antigen of T. spiralis (AST), sera were analyzed by double immunodiffusion (IDD) and Western blot (WB). lnvasion of skeletal muscle initiates a complex series of changes in both larvae and infected muscle cell, the changes in larvae can be summarized as a growth and maturation of IL. The present sludy contributes of the knowledge of the biology of the parasite during its life cycle.

Key words: Trichinella spiralls; Biology; Life cycle.

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* Centro de Biología Experimental. Universidad Autónoma de Zacatecas. Apartado Postal 12. Guadalupe. Zac. 98600. México.

 

INTRODUCCION

El parásito Trichinella spiralis es el agente que provoca la trichinellosis en los mamíferos, este parásito es intracelular, presenta un ciclo de dos fases; una fase entérica donde el parásito pasa por 4 mudas y se transforma en adulto; una fase parenteral que incluye la larva recién nacida y una fase muscular de enquistamiento. Es un parásito con sus estadios y desarrollo en un solo hospedero.^1-2

Se han realizado estudios para conocer mejor al parásito, algunos de éstos están basados en la morfología, describiendo diferentes aspectos como: a) las dimensiones del macho 1,5 mm de largo por 0,05 mm de ancho, la hembra de 3,5 mm de largo por 0,06 mm de ancho^;3 b) las células musculares infectadas con Ll pierden el aspecto estriado del músculo esquelético^;4 c) tres días después de entrar el parásito en las fibras musculares un crecimiento exponencial comienza. El volumen de la larva se incrementa de 4x10³ µm³ en el día 3 y en el día 20, 10⁶ µm^3,1 d) el alargamiento del núcleo ocupa una porción significativa del citoplasma;⁵ e) dicho alargamiento es gradual del día 0 al 7; entre el día 7 y 8 se da un incremento rápido del núcleo alcanzando su máximo tamaño y volumen, hasta el día l0 hay un incremento muy pequeño comparado con los días 7 y 8 y después del día 10, el alargamiento del núcleo permanece así por el resto de la infección;⁶ f) cada célula nodriza contiene un común de 40 núcleos alargados.⁷

En el aspecto ultrastructural existen diferentes aportaciones: a) un incremento en el número de organelos y las células infectadas tienen una regeneración fenotípica⁸; b) los organelos presentes son retículo endoplásmico liso y rugoso, mitocondrias que aparecen vacuolas, núcleos largos (15 µm) con un nucléolo bien definido¹ y lisosomas;⁹ c) se conoce que hay producción de colágeno para encapsular al complejo parásito/células del hospedero;^{1, 10, 11} d) las células musculares infectadas con Ll pueden ser llamadas células nodrizas basado en que estas proveen de nutrientes a la larva en su etapa de crecimiento, desarrollo y homeostasis durante la fase muscular del ciclo vital^.4

Bioquímicamente a) el adulto y la larva (L1) son aerobios facultativos; b) los niveles de mioglobulina, creatinina y fosfocreatinina fueron de 30 a 40% de reducción en las células infectadas;² c) el aumento en la síntesis de DNA y RNA;^{5, 12, 13} d) actividad enzimática como lisosomales, tiamina pirofosfatasa (proliferación de Golgi);⁹ e) Decrecimiento de la proteína miofibrilla en las células nodriza comparada con el músculo, proteínas con alfa-actina, alfa y beta tropomiosina y la cadena pesada de miosina, no son detectadas en las células nodrizas, la ausencia da estas proteínas viene a confirmar lo que otros autores habían mencionado con respecto a la regeneración fenotípica de las células nodrizas;¹⁴ Boczon ha sugerido que este ciclo puede ser irrelevante y que en realidad T. spiralis pertenece al grupo de parásitos helmíticos con un metabolismo complejo.¹⁵

 

MATERIAL Y METODOS

En el estudio se utilizó un lote de 200 ratas Long Evans con una edad promedio de dos meses y medio, las cuales fueron infectadas con 500 Ll de T. spiralis por vía oral. Sacrificando por grupos de 5 ratas desde las primeras 24 hrs. después de ser infectadas hasta el día 40. Del día 1º al 15º se efectuaron cortes de tejido del corazón e intestino delgado (porción duodenal); del lº al 40º los cortes fueron de diafragma, masetero, lengua y del muslo del miembro inferior; así como la digestión con jugo gástrico artificial (Pepsina 10,000 U, 0,3% HCL 0,2N) incubando a 37ºC por 24 hrs.¹⁶ Las larvas infectantes obtenidas de dicha digestión se lavaron con PBS (Sol'n de fosfatos), desengrasadas con acetona por 24 hrs; el paquete de larvas fue resuspendido en PBS y los antígenos del parásito fueron extraídos por sonicación usando 50% de eficiencia por 2 min. por pulso, el homogeneizado se centrifugó a 10.000 r.p.m. a 4ºC por una hora. Obteniendo el antígeno soluble total (AST) del cual se realizó PAGE y electrotransferencia en papel de nitrocelulosa por el método de Towbin et al.¹⁷

De los sueros que se recolectaron en el estudio se efectuó inmunodifusión doble (IDD) y Westernblot para determinar el reconocimiento de los sueros prototipo positivos y negativos que interactúan con el antígeno a través del ciclo vital.

 

RESULTADOS

La interpretación de los datos obtenidos a través de la observación en las diferentes etapas de desarrollo de la T. spiralis es la siguiente:

En la fase entérica:

Del día 1 al día 6; en el intestino, se observa solamente infiltrado de poblaciones células (neutrófilos, eosinófilos, linfocitos, etc.)

El día 7 a nivel de las vellosidades intestinales, hay presencia de adultos hembras que están liberando larvas recién nacidas (LRN).

Del día 8 al día 15 las LRN se desplazan de la vellosidad del intestino hacia la submucosa para salir del intestino pasando por las venas submucosas para entrar a la vena porta y salir a la circulación (Figura 1).

En la fase parenteral:

Se observa que la LRN se transporta a través de todo el torrente circulatorio y tiene un paso transitorio en el corazón. Al llegar al músculo estriado (diafragma) se observa un proceso mecánico de penetración a la célula muscular a partir del día 10 post-infección de Ll (Figura 2).

Aproximadamente del día 15 al 22 hay infiltración celular (polimofonucleares, neutrófilos, etc.); ante la penetración de la LRN.

La célula nodriza con núcleos de forma no bien definida, alargamiento en el citoplasma, así como en un extremo de la célula se observa como usos de atracción para unirse a otra célula; alargamiento del núcleo. Aproximadamente a partir del día 25 se observa una coordinación entre el parásito y la célula huésped (Figuras 3a, b, c).

Del día 26 se observan Ll completas. En el día 10 al 40 se observa el microcosmo de interacción huésped-parásito y los diferentes estadios de maduración (LRN, Ll) debido a la presencia de adultos en el intestino.

Detección de anticuerpos por IDD a partir de la cuarta semana post-infección; por WB se detecta desde la segunda semana la presencia de un triplete de 45, 48 y 50 kDa (Figura 4).

De la digestión se obtienen Ll a partir del día 26.

DISCUSION

El seguimiento del ciclo vital del parásito de T. spiralis desde el primer día post-infección hasta el día 40 en diferentes tejidos nos da la oportunidad de tener un conocimiento más detallado de sus etapas de evolución en sus fases especificas.

En la fase entérica se comprobó las diferentes observaciones hechas por otros autores. ^{1, 2, 10}

En el intestino la migración a través de las vellosidades hacia las células apocrinas para salir al torrente sanguíneo.

En la fase parenteral el corte del corazón se observan ríos de LRN que van recorriendo el torrente circulatorio, observando el daño causado al penetrar al diafragma a partir del día 10 ya que hay LRN que empiezan a introducirse en el músculo para su desarrollo.

La larva preinfectiva penetra a la célula muscular por un proceso mecánico¹⁸ o por procesos enzimáticos; entra a un microcosmos de filamentos de actina y miosina así como de cargas intramusculares por lo que modifica el contenido celular; secretando sustancias que permiten el desarrollo de una coordinación entre el parásito y la célula hospedera; de tal manera que cada uno depende del otro.¹⁴

En esta etapa presenciamos una serie de cambios que transforman la célula nodriza de ser una célula aislada como se relaciona con otras, en este caso observamos la interacción de 3 a 5 células para formar una unidad individual que origina una larva madura.

Esto se confirma con lo que mencionan algunos autores.

La célula nodriza en su primera etapa de desarrollo presenta un cambio fenotípico;⁷ cuando la célula nodriza no ha degenerado al músculo hospedero se da una regeneración del músculo fenotípicamente;⁸ se han investigado las proteínas del músculo del hospedero donde decrecen las proteínas miofibrilas en la célula nodriza comparada con el músculo, y se propone que también podría contribuir al cambio fenotípico de las células nodrizas⁹.

Al detectar la presencia de anticuerpos por IDD fue a partir de la cuarta semana en la cual se observan bandas de identidad y por WB a partir de la segunda semana se detecta un antígeno de 45 kDa y en la cuarta un triplete de 45, 48 y 50 kDa, los cuales corresponden a los detectados por varios autores.

 

RESUMEN

El presente estudio nos permitió conocer los 3 estadios del parásito y detección de anticuerpos desde la segunda semana con un peso molecular de 45 kDa.

Perspectivas, los cortes histológicos serán estudiados por técnicas inmunohistoquímicas con anticuerpos específicos para determinar en que stadio están presentes y su probable papel a la respuesta inmune en esta parasitosis.

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