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Boletín de la Sociedad Chilena de Química

versão impressa ISSN 0366-1644

Bol. Soc. Chil. Quím. v.47 n.4 Concepción dez. 2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0366-16442002000400023 

ESTEROLES, ÁCIDOS GRASOS E HIDROCARBUROS DE LOS
CUERPOS FRUCTÍFEROS DE GANODERMA AUSTRALE

IVONNE J. NIETO*, MEISER A. VALENCIA

*Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia,
Apartado Aéreo 14490, Bogotá, Colombia.

(Recibido: Octubre 29, 2001 - Aceptado: Agosto 13, 2002)

RESUMEN

El extracto etanólico del hongo Ganoderma australe, se fraccionó en hexano y se obtuvo la fracción esteroidal, de la que se aislaron por medio de CC y CLAE preparativa y cuantificaron por CG-EM los únicos cuatro esteroles que la conforman: ergosta-5,7,22-trien-3ß-ol, ergosta-7,22-dien-3ß-ol, ergosta-7-en-3ß-ol y ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3b -ol. Las estructuras se establecieron por métodos físicos y espectroscópicos. También se identificaron mediante CG-EM: ésteres, ácidos grasos e hidrocarburos de alto peso molecular.

PALABRAS CLAVES: Hongos, Ganodermataceae, esteroides, ácidos grasos, G. australe

SUMMARY

Four known sterols: ergosta-5,7,22-trien-3ß-ol, ergosta-7,22-dien-3ß-ol, ergosta-7-en-3ß-ol and ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3b -ol were isolated by CC and HPLC preparative from the fruiting bodies of Ganoderma australe. It was established that no other sterols were present in the extrac. Their structures were elucidated by physical and spectroscopic methods. The sterol content was quantified using GC-MS. Besides, esters, fatty acids and hydrocarbons were identified by GC-MS.

KEYWORDS: Fungi, Ganodermataceae, steroids, fatty acids, G. australe

INTRODUCCIÓN

La familia Ganodermataceae perteneciente al orden Aphiloforal y a la clase de los Basidiomicetos, está constituida por una gran variedad de hongos de reconocida importancia de los que se han aislado muchas sustancias de comprobada acción farmacológica (1-3). G. australe es un hongo saprófito, leñoso, perenne, no lacado, distribuido en diferentes latitudes. Ha sido muy poco estudiado a pesar de que ocasiona grandes pérdidas a la industria de oleaginosas cuando parasita palmas. Solamente se conocen dos publicaciones sobre G. australe. Jain y col.(4) aislaron: ergosterol IIIa, ergosta-7,22-dien-3ß-ol IIIb, ergosta-7,22-dien-3-ona, ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-ona, palmitato de ergosterilo y lanosta-7,9(11),24-trien-3b ,21-diol. González y col (5) además de los compuestos antes mencionados (excepto los dos últimos), encontraron 5a ,8a -epidioxi-ergosta-6,22-dien-3ß-ol, 5a ,8a -epidioxi-ergosta-6,9(11).22-trien-3ß-ol y ácidos grasos de C22-C26. En nuestro estudio de la fracción esteroidal de G. australe, comprobamos que está constituida solamente por esteroles y a diferencia de los autores antes citados, no hallamos cetonas esteroidales, peróxidos de esteroles ni lanostanoides. Al igual que ellos, aislamos ergosta-5,7,22-trien-3ß-ol (ergosterol) y ergosta-7,22-dien-3ß-ol, mayoritarios (55% y 35% respectivamente) en este hongo como se demostró cuantificando por CG-EM.

Los otros dos, minoritarios, que se identificaron como ergosta-7-en-3ß-ol lIIc y ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3ß-ol IIId se aislaron por primera vez de G. australe.

PARTE EXPERIMENTAL

La recolección de G. australe se realizó en la estación biológica El Amargal, (5° 34’ N, 77° 31’ O) Municipio de Nuquí, Departamento del Chocó (Colombia) en diciembre de 1998. El hongo fue identificado por el botánico Luis Guillermo Henao y un ejemplar reposa en el herbario del Instituto Nacional de Ciencias Naturales de la Universidad Nacional de Colombia, bajo el número LH-1185.

El carpóforo del hongo se lavó con agua, se partió en pequeños trozos y se secó en un horno a 50°C - 60°C por 5 horas. Una vez seco, se redujo a polvo fino en un molino mecánico. El material molido (1kg) se sometió a extracción con etanol del 96% en soxhlet hasta agotamiento. El extracto se concentró a presión reducida y el residuo se fraccionó con hexano. Los componentes del extracto en hexano se separaron por C.C usando como fase estacionaria sílica gel y como eluyente mezclas de éter de petróleo (40-60°C) y acetato de etilo hasta una relación 6:4. La columna se monitoreó por CCF, se reunieron aquellas fracciones que presentaron un comportamiento cromatográfico similar tras revelar con vapores de yodo y luz U.V. Así se obtuvieron cuatro nuevas fracciones enriquecidas, que se analizaron por CG-EM (Hewlett Packard 6890), usando una columna HP5-MS (30 m de largo y 0,33 mm de diámetro interno) y Helio como gas de arrastre (1mL/min), desde 270 °C a 310 °C (5°C/ min) acoplado a un detector selectivo de masas (Hewlett Packard 5973) a 70 eV. La fracción 1, se purificó por C.C. usando alúmina ácida como fase estacionaria y eluyendo con el sistema antes descrito. Así se obtuvieron las subfracciones 1.1 y 1.2. Por CG-EM se estableció que 1.1 está constituída por hidrocarburos (Ia-Ii; ver tabla 1) y la segunda por ésteres y ácidos grasos (IIa-IIf). La fracción 2 (75 mg) se sometió a separación usando CLAE preparativa (Merck Hitachi L-4250) detector a UV-Vis a 200 nm, columna RP 18, loop 1000 μL, fase mσvil metanol a 4.5 mL/min con un tiempo de análisis de 140 minutos, obteniéndose así 3 compuestos (IIIa-IIIc) y por CG-EM se identificó un cuarto producto (IIId) presente en la fracción. Las estructuras de IIIa-IIIc se establecieron por EM y por RMN1H y de 13C empleando un aparato Brucker AC-500, operado a 500 MHz para protón y a 125 MHz para 13C. Las muestras se disolvieron en cloroformo deuterado y se empleó TMS como referencia interna.

Cuantificación de los esteroles. Una muestra del hongo seco (2,060g) se sometió a maceración con cloroformo (6 x 10mL). Se reunieron los diferentes extractos y se concentró a presión reducida obteniéndose de esta manera el extracto clorofórmico (EC) (20,0 mg.). Acto seguido, el EC se mezcló con 0,5120 mg de estigmasterol, elegido como estándar interno y la mezcla así formada se separó por C.C usando como fase estacionaria sílica gel y como fase móvil un gradiente de éter de petróleo (EP) : acetato de etilo desde EP=100 hasta EP= 70. Se recogieron 20 fracciones que fueron analizadas por CG-EM empleando el siguiente método: Temperatura inicial 90 ° C (1 min.) rampa 18° C /min. hasta 300 ° C (10 min.): tiempo total de análisis 22,67 minutos. Patrón: estigmasterol con tiempo de retención promedio de 17,3 min. La forma de cuantificación se realizó por comparación y usando el método de áreas normalizadas de acuerdo a la respuesta del patrón.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Fracción 1.1 Esta fracción se estudió por CG-EM y está constituida por una mezcla de hidrocarburos lineales no ramificados, que van en serie desde el C26 hasta el C34. Se encuentran prácticamente en los mismos porcentajes relativos, exceptuando los tres de mayor masa molecular. Dichos hidrocarburos se identificaron por sus espectros de masas, teniendo en cuenta los iones característicos a m/z 43(propilo), 57(butilo), 71(pentilo), 85 (hexilo) y 99 (heptilo) así como las pérdida sucesiva de metilenos (M+ - nCH2) y verificando contra los consignados en la librería de espectros del espectrómetro de masas (6), encontrando coincidencias espectrales del 97-99% en todos los casos. Ver tabla 1.

Tabla 1. Hidrocarburos presentes en la fracción 1.1


Compuesto

M+

abundancia %

tr min


Hexacosano

366

13.00

3.56

Heptacosano

380

15.58

4.25

Octacosano

394

16.18

5.14

Nonacosano

408

16.43

6.18

Triacontano

422

14.32

7.30

Untriacontano

436

11.54

8.46

Dotriacontano

450

6.86

9.64

Tritriacontano

464

4.55

10.82

Tetratriacontano

478

1.44

11.98


Fracción 1.2. Resultó ser una mezcla compleja constituída por ácidos grasos y ésteres de ácidos grasos, entre los que se identificaron: oleato de etilo (IIa), ácido linoléico (IIb), linoleato de etilo (IIc), estearato de etilo (IId), heptadecanoato de etilo (IIe) y palmitato de etilo (IIf). El ácido linoléico es un ácido muy común en hongos del orden Agarical, pero no en el Aphyllophoral del que hace parte el G. australe. Los diferentes ácidos y ésteres se identificaron con base en la concordancia de los tiempos de retención con los de algunos patrones y por el análisis detallado de los EM, en los cuales, estaban presentes los principales iones de diagnóstico tales como: M+ - metilo, M+ - etilo, M+ - etoxido, M+ - (CH)2, M+ - etoxicarbonil; el ión a m/z 88 debido al rearreglo de McLafferty. Los ácidos exhibieron el pico correspondiente a la relación m/z = M+ - 60 (pérdida de ácido acético) y el ion a m/z 88. La identidad de los referidos compuestos se constató igualmente por comparación con la librería de espectros (6).

Fracción 2 En esta fracción se encontraron únicamente cuatro esteroles (IIIa-IIId), pertenecientes a una serie cuya única diferencia radica en el número de insaturaciones.

Compuesto IIIa. El análisis por CG-EM permitió determinar que esta sustancia presenta el ión molecular a m/z 396 congruente con la fórmula molecular C28H44O. El punto de fusión, los espectros de IR, RMN protónica y de carbono 13 y el espectro de masas, resultaron iguales al del ergosterol (ergosta-5,7,22-trien-3ß-ol). Los experimentos HMQC y HMBC permitieron ratificar las asignaciones, descritas en la literatura (7).

Compuesto IIIb. Presentó el ión molecular a m/z 398 que concuerda con la fórmula molecular C28H46O. Exhibe iones característicos para esteroles tales como aquellos a m/z 383 (M+ - CH3), 380 (M+- H2O), 273 (M+- C9H17), 255 (M+- C9H17 - H2O) y 213 ( fisión del anillo D - H2O). Está también presente el ion a m/z 246 típico de esteroles D7 (8). La ausencia de los iones de 313 y 287 (M+- 85 y M+-111) uma indica que el compuesto posee núcleo esteroidal con un grupo OH y metilos angulares en C-10 y C-13. La elucidación estructural con los datos obtenidos del espectro de RMN 13C (tabla 2) es totalmente concordante con ergosta-7,22-dien-3-ol, un esterol ampliamente distribuido en el género Ganoderma.

Tabla 2. Datos espectrales de 13C para los compuestos IIIa,IIIb y IIIc (en ppm) (CDCl3)


Carbono

IIIa

IIIb

IIlc


1

38,36

37,11

37,10

2

31,95

29,61

29,62

3

70,43

71,03

71,05

4

40,75

37,93

37,95

5

139,78

40,24

40,21

6

119,58

31,42

31,45

7

116,57

117,44

117,40 [ 3,60 m ]

8

141,36

139,54

139,5

9

46,21

49,40

49,40

10

37,00

34,19

34,2

11

21,08

21,52

21,53

12

39,06

39,42

39,51 [ 2,0 d; 12,4]

13

42,81

43,19

42,5

14

54,54

55,08

55,00

15

22,99

22,92

22,93

16

28,31

28,11

27,90

17

55,68

55,92

55,95

18

12,04

12,07

11,83 [ 0,53 s]

19

16,27

13,06

13,04 [ 0,80 s]

20

40,47

40,54

36,60

21

21,10

21,10

19,00 [ 0,93;d 6,7Hz ]

22

135,57

135,66

33,62

23

131,94

131,84

30,65

24

42,81

42,81

39,02

25

33,06

33,06

31,41

26

19,65

17,61

20,52 [ 0,86;d 6,6Hz]

27

19,97

19,65

17,54 [ 0,79;d ]

28

17,61

19,96

15,40 [ 0,79;d ]


Nota: En paréntesis los valores de RMN1H

Compuesto IIIc. El EM indicó que tiene un peso molecular de 400 uma para el cual se calculó la fórmula C28H48O. La presencia en el espectro de masas de este compuesto, al igual que en el anterior de los iones provenientes de las escisiones M+- CH3 a m/z 385; M+- H2O a m/z 382; M+- C9H19 ( Cadena lateral C.L) a m/z 275; M+- C9H19 (C.L) - H2O a m/z 257 y la fisión del anillo D ¾ H2O a m/z 215, así como el ión de 255 uma ( pico base) junto con el ion 146 que es típico de los esteroles D7 (8), así como la ausencia de los iones a m/z 315 y 289 (M+- 85 y M+-111) permitieron identificarlo como ergosta-7-en-3ß-ol. Este compuesto fue aislado previamente en hongos de la familia Tricholomataceae (L. edodes) (9), pero no de hongos de la familia Ganodermataceae, a la que pertenece G. australe. Los datos espectroscópicos de carbono 13 para los compuestos IIIa, IIIb y IIIc se presentan en la tabla 2.

Esquema 1. Diagrama de fragmentación del EM del ergosta-7-en-3-ol.

Compuesto IIId: Se calculó la fórmula molecular C28H42O congruente con el peso del ión molecular de 394 uma. Su EM presenta los iones característicos de esteroles provenientes de las pérdidas de metilo, agua, cadena lateral, fisión del anillo D, fisión del anillo D y agua. También está presente el ión a m/z 125 que comprueba que la cadena lateral posee un doble enlace. Con base en lo anterior y con la similitud del existente en la biblioteca de espectros (6) se identificó como ergosta-5,7,9(11),22-tetraen-3-ol.

CUANTIFICACIÓN DE LOS ESTEROLES.

Las fracciones que contenían los esteroles eran la 7 y la 8 las cuales fueron mezcladas y analizadas por el método de áreas de acuerdo a la respuestas del estandar interno estigmasterol, que fue escogido por ser de naturaleza similar a los esteroles, de forma que sufriera la misma clase de variaciones que los esteroles presentes en el EC, y por presentar una resolución de 2,51 con el esterol mas cercano. De acuerdo con esto, el contenido de esteroles en G. australe se relaciona en la tabla 3.

Tabla 3 Cuantificación de los esteroles de G. australe


Esterol

Tiempo de retención min.

(g/100 g de extracto)


Ergosta-5,7,9(11)-tetraen-3β-ol

15,48

2,51× 10-1

Ergosterol

15,79

1,96

Ergosta-,7,22-tetraen-3β-ol

15,93

5,75

Ergosta-7-en-3β-ol

16,46

2,25 × 10-1


AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen a COLCIENCIAS por el apoyo económico recibido a través del proyecto "Fuentes alternativas de vitamina D2: estudio de algunos macromicetos Colombianos", a la Universidad Nacional de Colombia y a la Fundación Inguedé.

BIBLIOGRAFÍA

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