SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.46 número4MODIFICACION QUIMICA DE PECTINA DE LIMON CHEMICAL MODIFICATION OF LEMON PECTIN índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Boletín de la Sociedad Chilena de Química

versión impresa ISSN 0366-1644

Bol. Soc. Chil. Quím. v.46 n.4 Concepción dic. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0366-16442001000400013 

DIGESTION PROTEICA CON MICROONDAS Y SU APLICACIÓN EN PREPARACION DE MUESTRAS PARA ANALISIS DE HARINA DE PESCADO

CARLOS HERRERA *, MARIA TELLO, IGNACIO IBAÑEZ,
LUIS VELASQUEZ , MARCELO MANCINI Y SANDRA ALVAREZ

* Facultad de Ciencias, Universidad Católica de la Santísima Concepción,
Casilla 297, Concepción, Chile. Fax: (41) 735251. E-mail: cherrera@moises.ucsc.cl
Facultad de Química, Pontificia Universidad Católica de Chile, Casilla 306, Santiago, CHILE.
(Recibido: Marzo 6, 2001 - Aceptado: Octubre 25, 2001)

RESUMEN

La hidrólisis de albúmina (BSA), utilizada como una proteína modelo, en HCl 6N en el interior de una cápsula de teflón PFA con tapa atornillada, fue analizada a diferentes tiempos de calentamiento en un horno de microondas doméstico. Los tiempos de la reacción de hidrólisis de la proteína fueron seguidos, por cromatografía de filtración molecular, a través de la disminución de la absorbancia, medida en un monitor UV a 254 nm, del peak proteico y aumento de la correspondiente a aminoácidos libres (tirosina), en las muestras eluídas de una columna de Sephadex G-25. La hidrólisis completa de la proteína fue obtenida después de 30 minutos, cuando se utilizó la mitad de la potencia nominal del horno de microondas (aproximadamente 300W). El método fue aplicado satisfactoriamente a la hidrólisis de la proteína presente en harinas de pescado, como preparación previa de la muestra, para determinar posteriormente los aminoácidos básicos y aminas biógenas, por cromatografía de intercambio iónico, seguida de HPLC.

Palabras clave: Tratamiento, microondas, digestión, proteína, harina de pescado

ABSTRACT

Hydrolysis of albumin (BSA), as a model protein, in 6N HCl inside a PFA screw capped sample vial, was analysed at diferent times by heating in a household microwave oven. The protein hydrolisis reaction times were followed through molecular filtration chromatography, by measuring in a UV monitor at 254 nm, the decreasing in protein and increasing in free amino acids (tyrosine) peak´s absorbances, of the samples eluted from a Sephadex G-25 column. The total hydrolysis of the protein was achieved after 30 minutes and at a half of the nominal power of the microwave oven (approx. 300 W). The method was succesfully applied to the hydrolysis of the protein present in fish meal, as previous preparation of the sample, for later determination of basic amino acids and biogenic amines, by ion exchange chromatography, followed by HPLC.

Keywords: Microwave, treatment, protein, digestion, fish meal,

INTRODUCCION

La digestión, junto a la disolución de las sustancias a ser analizadas, que se encuentran presentes en muestras, orgánicas o minerales, son procesos obligados en muchos laboratorios de análisis químico en todo el mundo, los que se realizan, para la posterior determinación de los analitos. Esta etapa previa es generalmente un paso limitante de los procesos de análisis, debido a que los tiempos de hidrólisis pueden ser demasiado largos, lo que incide en una demora en la entrega de los resultados, situación que es más evidente luego de los grandes avances tecnológicos actuales, en lo referente a velocidad de funcionamiento de la nueva instrumentación analítica. Por otra parte la preparación de las muestras, es un proceso que tiene tanta incidencia como la calibración de los instrumentos, sobre la exactitud y precisión de los análisis 1 - 3).

Los tratamientos convencionales, generalmente significan calentamientos en medio ácido por períodos de tiempo bastante largos. En general este proceso se lleva a cabo con ácidos minerales concentrados, los que actúan más rápidamente a temperaturas y presiones elevadas 4).

El empleo de energía de microondas para la digestión ácida de materiales en sistemas cerrados a altas temperaturas y presiones, es una importante alternativa que ha demostrado reducir significativamente los tiempos de preparación previa de las muestras, para posteriormente determinar componentes orgánicos tales como aminoácidos 5) o inorgánicos como por ejemplo el mercurio 6). El calentamiento de un material en horno de microondas involucra absorción directa de energía electromagnética en la forma de radiaciones no ionizantes, que causan movimiento molecular, traducido en rotaciones que traen como consecuencia la producción de roce entre las moléculas, sin generar cambios en su estructura. La energía electromagnética que incide sobre un cuerpo, puede ser reflejada, transmitida o absorbida. Los metales reflejan la energía de microondas y no se calientan. Muchos materiales aislantes son transparentes a la energía de microondas y ésta los atraviesa sin producir calentamiento. Los materiales dieléctricos en cambio, tienen la capacidad de absorber la energía de microondas y por lo tanto son calentados. Por otra parte la disipación de energía (producción de calor), también se produce por conducción iónica, producida por la migración de los iones disueltos en el campo electromagnético aplicado, que depende de la movilidad y la concentración de dichas especies en la solución. La producción de calor se puede explicar en función de la resistencia opuesta al flujo ejercida por los iones involucrados 2).

El desarrollo que se ha observado en lo referente a la cuantificación de aminoácidos por HPLC, ha acortado los tiempos de análisis a menos de una hora 7), por ello el paso determinante en el tiempo, que limita la velocidad del análisis, corresponde a la etapa de preparación del hidrolizado proteico, el cual según el protocolo convencional requiere de 24 horas a 105-110° C, en HCl 6M 8).

La hidrólisis de proteínas en fase vapor y altas temperaturas se ha empleado para acortar los tiempos de esta reacción 9), aunque no ha sido fácil obtener reproducibilidad, debido a descomposición de los aminoácidos lábiles, entre ellos el triptófano.

La preparación de hidrolizados proteicos por calentamiento con energía de microondas, puede reducirse a tiempos de reacción tan cortos como 4 minutos 10), debido a las altas temperaturas y presiones obtenidas. Sin embargo los tiempos demasiado cortos no evitan cierta descomposición de aminoácidos y además se requiere de recipientes de reacción especialmente diseñados, para soportar drásticas condiciones de muy altas temperaturas y presiones. El control de la potencia máxima de microondas, llevándola a valores intermedios y tiempos algo más largos, parecería ser el camino conducente a evitar algunos de estos inconvenientes 11,12).

Entre las muestras orgánicas que con bastante frecuencia se analizan, se encuentran las harinas de pescado, siendo de fundamental importancia para las empresas, que se encuentran en los países explotadores de recursos marinos, debido a que poseen grandes extensiones costeras y producen alimentos de origen pesquero, siendo muy alto el porcentaje destinado a exportación y es precisamente debido a que los países compradores de este producto han exigido un estricto control de calidad, que éstas muestras han de ser sometidas a variados análisis, requiriendo muchos de ellos una preparación previa, que incluye la hidrólisis de la proteína, la que está siendo actualmente considerada como muy consumidora de tiempo, ya que se debe realizar durante varias horas en estufa convencional, significando generalmente una excesiva demora, en la entrega de los resultados del análisis total.

PARTE EXPERIMENTAL

En este trabajo fueron empleadas técnicas cromatográficas, por lo cual fue necesario calibrar una columna de filtración molecular utilizando como patrones las soluciones de albúmina de suero de bovino y del aminoácido tirosina, los que fueron cromatografiados previamente para obtener volúmenes de elución conocidos.

En los ensayos de determinación de los tiempos óptimos de hidrólisis en microondas se emplearon como muestras, 200 mg de albúmina de suero de bovino, disueltos en 2 mL de HCl 6 N, introducidos en pequeñas cápsulas de teflón de 3 mL de capacidad, de alta resistencia y sello hermético. Las cápsulas se trataron en un horno de microondas Samsung RE-610 TC, al 50% de la potencia ( 300 W ) Los diferentes tiempos de hidrólisis ensayados fueron: 0 - 7 - 10 - 13 - 17 - 20 - 25 y 30 min.

Una vez terminada la hidrólisis, la solución se dejó enfriar y luego fue neutralizada con 3 mL de NH4OH 4 N, y se centrifugó por 20 minutos a 5.500 r.p.m. en una centrífuga Martin Christ Osterode / Harz UJ2. De este centrifugado se tomaron 0,5 mL del sobrenadante y se aplicaron a una columna de Sephadex G-25 (1,0 x 57,5 cm), para realizar una cromatografía líquida, utilizando como eluyente agua destilada, a una velocidad de flujo de 10 mL/h. El eluído fue monitoreado por medio de un detector UV, LKB a 254 nm registrándose la señal en un inscriptor LKB con una velocidad de papel de 20 mm/h. Las fracciones obtenidas, de 5 mL cada una, fueron recogidas en tubos ubicados en un colector de fracciones LKB Ultrorac 7000.

Hidrólisis de harinas

Se tomaron cantidades de 1 g de harinas de pescado, las que fueron divididas en 5 fracciones de 200 mg cada una, para ser sometidas luego a hidrólisis con 2 mL de HCl 6 N en las cápsulas de teflón, de 3 mL de capacidad, con tapa atornillada, por 30 minutos en el horno de microondas, empleando el 50% de la potencia ( aprox. 300 W ). La hidrólisis de las muestras fue realizada como etapa de preparación previa a una purificación por cromatografía de intercambio iónico, llevada a cabo en columna Dowex 50 W-X8 (1,5 x 2,2 cm) y posteriormente fueron sujetas a los análisis para la determinación de aminoácidos básicos y las aminas biógenas tóxicas histamina y mollerosina 13), luego de reacción con fenilisotiocianato, determinando los PTC-derivados, por medio de un cromatografo HPLC marca KNAUER, detector UV Perkin Elmer LC-15 e integrador Spectra Physics SP 4270

RESULTADOS Y DISCUSION

En el estudio de hidrólisis proteica por microondas se empleó material de teflón, teniendo en consideración su alta resistencia al calor y las posibilidades de cierre en forma hermética, para evitar evaporación y soportar las altas presiones, que se generan en el interior del horno de microondas, en lugar de utilizar ampollas de vidrio, selladas a la llama, procedimiento frecuente en estufa convencional, debido a que éstas resultaron ser poco resistentes y se quiebran con facilidad. Además se utilizó un recipiente más grande de material de poliestireno expandido, con su tapa y de capacidad suficiente para contener varias cápsulas de teflón, a objeto de proteger la cavidad del horno, frente a fugas accidentales, que sin ser demasiado frecuentes, se pueden producir, cuando las cápsulas se encuentran en mal estado o en aquellas que, debido a la fatiga del material, se han producido deformaciones presentando fallas en la hermeticidad del cierre.

En la figura 1 se puede apreciar los volúmenes de elución de los dos patrones utilizados, el de la proteína que se encuentra saliendo de la columna en aproximadamente 30 mL, en cambio el correspondiente a los aminoácidos libres, representado por el de la tirosina, se estaría ubicando cercano a los 80 mL. Los volúmenes de elución de estas sustancias son suficientemente diferentes, para que se encuentren bastante separados en los cromatogramas, lo que comprueba que la elección de emplear un procedimiento basado en estas diferencias, para seguir el progreso de la reacción, sería la adecuada.



Fig. 1. Elución de patrones cromatográficos en columna de Sephadex G-25: la proteína (A) y el aminoáciso aromático tirosina (B).

Las cromatografías realizadas en columna de filtración molecular, han permitido seguir el progreso de las reacciones de hidrólisis de la proteína patrón, teniendo en consideración que la ruptura de los enlaces peptídicos presentes originalmente en la proteína, conduce a la obtención de sus unidades fundamentales, es decir los aminoácidos, que son los productos de la reacción y que tienen menor tamaño molecular, los que eluyen en volúmenes mayores. En consecuencia, la observación de los cromatogramas, permitió visualizar rápidamente el estado de avance de la reacción, al obtener una disminución clara de la proteína en el tiempo, lo que condujo a la aparición de aminoácidos liberados como productos de la reacción de ruptura de los enlaces peptídicos, presentes originalmente en la cadena polipeptídica.

El seguimiento de la reacción de hidrólisis de la proteína patrón, realizada en el horno de microondas, que se estudió para establecer los tiempos óptimos para esta reacción y que fue realizado mediante el análisis, de muestras de albúmina irradiada por diferentes tiempos, con el empleo del método cromatográfico de filtración molecular, permitió examinar el comportamiento del sistema, durante el transcurso de la reacción, observándose ya desde los pocos minutos una efectiva acción, con la producción inicial de una pequeña cantidad de producto, que luego en los tiempos intermedios va en aumento, hasta completarse a los 30 minutos.

En la figura 2 se muestra el esquema de progreso de la hidrólisis en el tiempo, donde se puede observar el estado inicial, a los 0 minutos, luego se visualiza que el avance es relativamente rápido, para alcanzar un estado intermedio de una velocidad algo inferior, entre 10 y 17 minutos, donde se observa que las muestras analizadas a diferentes intervalos de tiempo, van presentando un progresivo grado de hidrólisis, al encontrarse una clara disminución de la absorbancia a tiempos de elución correspondientes a la proteína, mientras que se va encontrando un efectivo aumento de la banda, que aparece a tiempos de elución de la tirosina (que representa a los aminoácidos libres ), para proseguir finalmente, hasta completarse la reacción a los 30 minutos, tiempo en el que, según aparece en la figura, corresponde a la curva donde se puede observar que ha desaparecido totalmente la banda correspondiente a la proteína y en su reemplazo estaría encontrándose una banda mayoritaria, que aparece en el volumen de elución de la tirosina, la que si bien no se observa como única, sino que va acompañada por otras bandas más pequeñas, por lo tanto no está totalmente limpia, ésto sin embargo es explicable, ya que se esperaría la presencia de la gran variedad de aminoácidos naturales, comportándose como otros productos de reacción de menor tamaño molecular, donde podrían también ubicarse, pequeñas cantidades de productos de descomposición de aminoácidos lábiles (triptófano por ejemplo), que están eluyendo en volúmenes mayores, lo que es común de observar también en las otras curvas, que aparecen en la figura, correspondientes a tiempos menores que media hora de hidrólisis. La vida media de hidrólisis, calculada según una cinética de decaimiento monoexponencial, es de 6,39 + 0,55 min.


Fig. 2. Curvas de evolución cromatográfica en columna de Sephadex G-25 de alícuotas de mezclas de reacción, para el transcurso de la hidrólisis de albúmina con HCI 6N, luego de diferentes tiempos de tratamiento, en horno de microondas.

Con el propósito de verificar que la reacción de hidrólisis por microondas había sido adecuada, se procedió a comparar el esquema de elución en Sephadex G-25, de la muestra correspondiente a la reacción de 30 minutos, con un esquema obtenido luego de procesar igual cantidad de la misma proteína, pero por hidrólisis convencional en estufa a 108° C por 24 horas, considerada como reacción completa para la proteína patrón. La reducción de tiempo al emplear microondas, es de alrededor de un orden de magnitud, según lo que han conseguido otros autores, al disminuir a 2 horas 5) el tiempo de hidrólisis haciéndolo más simple y rápido 6). Al aplicar microondas, en este trabajo, se logró bajar aún más el tiempo, ya que en sólo 30 minutos, se alcanzó el mismo efecto que se puede conseguir, luego de 24 o más horas, por hidrólisis habitual en estufa eléctrica. Siendo el componente tiempo uno de los más importantes desde el punto de vista económico, el ahorro que se consigue es de fundamental importancia, además se logra satisfacer también las expectativas de urgencia con los clientes.

Los cromatogramas obtenidos, se muestran en la figura 3, lo que permite confrontar los resultados de ambos esquemas, donde se observa que son muy similares, sin embargo, la curva que se obtiene para la hidrólisis en estufa tradicional presenta, aún después de 24 horas, una clara aunque pequeña señal correspondiente a remanentes de la proteína inicial, en cambio en el trazado obtenido para los productos de la reacción realizada con microondas, no se observa una banda bien definida, de los restos de la proteína sin hidrolizar, por lo que se podría deducir que el último tratamiento, podría considerarse como más completo.


Fig. 3. Curvas de elución cromatográfica de Sephadex G-25, de muestras de los hidrolizados de la proteína albúmina, A: en estufa convencional (24horas) y B: en horno de microondas (30 min.). P = proteína sin hidrolizar; Aa = aminoácidos libres (productos de la reacción).

La metódica descrita, para el tratamiento previo de los materiales que serán sometidos al análisis, se aplicó a una muestra de harina de pescado, cuya cantidad inicial recomendada para el tratamiento de hidrólisis tradicional era de 10 g. Cantidades mayores a 1 g de muestra inicial originaban una proporción excesiva de residuo de hidrólisis (material carbonizado), lo que involucraba mayor tiempo de análisis, por la necesidad de proceder a su eliminación. Sin embargo, en el tratamiento con microondas no se observó residuos dentro de las cápsulas. Se procedió a hidrolizar inicialmente, por medio de microondas, la cantidad de 1 g de muestra, sin embargo las limitaciones de la metódica dictaron la necesidad de subdividir la muestra en 5 fracciones de 200 mg, introducidas cada una en las cápsulas de teflón previamente mencionadas, las que fueron sometidas a hidrólisis en horno de microondas por un tiempo de 30 minutos y posteriormente se reunieron, para realizar el siguiente tratamiento consistente en purificación por medio de cromatografía de intercambio iónico en Dowex 50 WX8, reduciendo notablemente el tamaño de las columnas debido a la cantidad pequeña de muestra inicial, consiguiendo con ello acortar aún más los tiempos de preparación previa. Una vez purificada la muestra, se procedió a derivatizar las aminas biógenas y los aminoácidos básicos con fenilisotiocianato, para introducir un cromóforo, obteniéndolos en la forma de feniltiocarbamil-derivados (PTC-derivados)14), los que se pueden detectar posteriormente en la zona ultravioleta. Finalmente, debido a que sólo se requiere una alícuota de las muestras derivatizadas, para el análisis final, se procedió a disminuir el tamaño de muestra inicial, considerando que era suficiente utilizar un total de 200 mg, el equivalente a la cantidad que se puede introducir en una sola cápsula de teflón, lo que facilita el manejo además de incidir aún más sobre la disminución del tamaño de las columnas de intercambio iónico, permitiendo eluciones notablemente más rápidas y por ende, en esta etapa del tratamiento, también se vieron acortados considerablemente, los tiempos de preparación de las muestras. Sin embargo el pequeño tamaño de muestra inicial, puede significar un inconveniente ya que se requerirá un estricto procedimiento de muestreo, para conseguir representatividad. Una ventaja adicional, que tiene relación con la característica que presentan algunos aminoácidos, que sufren descomposición en los tratamientos tradicionales, en las drásticas condiciones de hidrólisis, es aquella que está asociada al tratamiento con microondas, donde se ha observado que el triptófano, el más lábil de los aminoácidos, no sufre gran degradación en estas condiciones, probablemente debido al corto tiempo de exposición, entre 0,5 y 2 horas 5,12).

En la figura 4 se muestra el resultado obtenido luego de someter a cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), una alícuota de dicha muestra hidrolizada con microondas, después de ser purificada y derivatizada, donde si bien no se obtiene un perfil definido de las bandas, éstas presentan una resolución similar a la que se encontró, al analizar del mismo modo, la muestra proveniente de la hidrólisis tradicional, con la cual se realizó la comparación.


Fig.4. Cromatograma (HPLC), de PTC-derivados de aminoácidos básicos y aminas biógenas, presentes en muestras de harina de pescado, cuya proteína fue hidrolizada con HCl 6 N, A: por 24 h., en estufa convencional y B: por 30 minutos en horno microondas.

El tratamiento previo con microondas, es una metodología rápida, resultando apropiada para un amplio rango de muestras, incluyendo minerales y alimentos. La digestión de proteínas, que funciona sin producir alta descomposición del triptófano, se visualiza como más atractiva y con ventajas, para determinaciones tanto de sustancias orgánicas como inorgánicas.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece a la Dra. Carolina Aguirre, por leer el manuscrito de este trabajo y por sus valiosas sugerencias

REFERENCIAS

1. F. Hoke, The Scientist, 6 (14), 19 (1992)        [ Links ]

2. H. M. Kingston and L. B. Jassie, Introduction to microwave sample preparation: Theory and practice. Amer Chem Soc, Washington, D. C. (1988)        [ Links ]

3. K. S. Kuhn, K. Schuhmann, P. Stehle, D. Darmaun and P. Furst, Am. J. Clin. Nutr., 70 (4), 484 - 489 (1999)        [ Links ]

4. E. Jackwerth, and S. Gomiscek, Pure Appl. Chem., 56 (4), 480-489 (1984)        [ Links ]

5. J. Kroll ; H. Rawel ; R. Kröck ,.Zeitschrift für Lebensmittel-Untersuchung und -Forschung A (Food Research and Technology) 207 (3), 202-206 (1998)        [ Links ]

6. E-S. Ong, Y-L. Yong, S-O. Woo and L-K Kee, Anal. Sci., 16/4 (2000).        [ Links ]

7. R. L. Heinrickson and S. C. Meredith, Anal. Biochem. 136, 65-74 (1984)        [ Links ]

8. C. H. Hirs, W. H. Stein and S. Moore, J. Biol. Chem., 211, 941-950 (1954)        [ Links ]

9. W. Dreyer and, E. Bynum, Methods in Enzymology, 11, 32-39 (1967)        [ Links ]

10. S-H., Chiou and K-T. Wang, J. Chromatogr. , 491, 424-431 (1989)        [ Links ]

11. S. A. Margolis, L. Jassie and , H. M. Kingston, J. Autom. Chem., 13, 93-95 (1991)        [ Links ]

12. M. Mancini y C. Herrera. Evaluación de transferencia de calor en hidrólisis proteica por microondas y efectos protectores sobre el triptófano. XXI Congreso Latinoamericano de Química. Panamá. (1994)        [ Links ]

13. C. Herrera, M. Tello, I. Ibañez, O. Valenzuela and L. Olivares, Bol. Soc. Chil. Quím., 44, 117-121 (1999)        [ Links ]

14. Edman, P., Acta Chem. Scand., 10, 761-768 (1956)        [ Links ]