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Boletín de la Sociedad Chilena de Química

versión impresa ISSN 0366-1644

Bol. Soc. Chil. Quím. v.46 n.4 Concepción dic. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0366-16442001000400012 

MODIFICACION QUIMICA DE PECTINA DE LIMON
CHEMICAL MODIFICATION OF LEMON PECTIN

BETTY MATSUHIRO* Y MARIA JOSE RUBIO

Departamento de Ciencias Químicas, Facultad de Química y Biología,
Universidad de Santiago de Chile, casilla 40, Santiago 33, Chile.
(Recibido: Enero 19, 2001 - Aceptado: Octubre 25, 2001)

RESUMEN

La hidrólisis básica del extracto de mesocarpio de limón dio una pectina enriquecida en ácido galacturónico. La reacción con bromo permitió la oxidación selectiva del carbono 2, dando un grupo cetónico con buen rendimiento. El polisacárido oxidado por aminación reductiva y posterior acetilación dio un análogo del polisacárido Vi de Salmonella typhi. El análogo se usó como modelo para introducir una cadena lateral por amidación con caprolactama que hiciera más accesible la conjugación de un polisacárido acídico en una segunda amidación a albúmina de suero bovino.

PALABRAS CLAVES: Pectina, oxidación, aminación, polisacárido.

ABSTRACT

The basic hydrolysis of the extract from lemon mesocarp afforded a pectin rich in galacturonic acid. The reaction with bromine allowed the selective oxidation of carbon 2, giving a ketone function in good yield. The reductive amination of the oxidised polysaccharide and subsequent acetylation gave an analog of the Vi polysaccharide of Salmonella typhi. The analogue was used as a model compound for the introduction of a side chain by amidation with caprolactam and for the conjugation of an acidic polysaccharide by amidation to the protein, bovine serum albumin.

KEY WORDS: Pectin, oxidation, amination, polysaccharide

INTRODUCCION

Las pectinas son polímeros de residuos de ácido a -D-galactopiranurónico unidos a través de enlaces 1® 4 que se obtienen de frutas, especialmente cítricos y manzanas, de girasol y remolacha. Algunos de los grupos carboxílicos en los residuos, se encuentran esterificados por grupos metilo. La cadena principal de galactouronano puede estar interrumpida por unidades de L-ramnosa que pueden llevar a su vez, cadenas laterales de L-arabinosa y D-galactosa (1).

Es posible introducir nuevos grupos funcionales, a través de reacciones químicas o enzimáticas, en la estructura de los polisacáridos naturales que pueden conferirles propiedades físico-químicas y biológicas novedosas. Así, por ejemplo, la hidroxipropilación de celulosa, seguida de la esterificación del grupo alcohólico introducido permite unir covalentemente esteroides o drogas anticancerígenas facilitando la liberación lenta y selectiva del fármaco en el organismo humano (2). Otra forma de acoplar una molécula orgánica a una matriz de polisacárido, por ejemplo dextrano, es a través de la oxidación con ácido peryódico y la aminación reductiva de los grupos aldehidos formados con los grupos amino de un fármaco para dar una amina secundaria (3).

En 1994, el grupo de Robbins trató pectina comercial con anhídrido acético, para acetilar los grupos alcohólicos libres y luego, por reacción con cistamina obtuvo un derivado que se unió covalentemente a la proteína, toxoide tetánico. El polisacárido modificado y el conjugado mostraron formar anticuerpos en ensayos con ratones, aunque en menor grado que el polisacárido capsular de Salmonella typhi (4). Este último polisacárido, llamado polisacárido Vi, por su virulencia, es un homopolímero lineal del ácido 2-acetamido-2-deoxi-3-O-acetil-a -D-galacturónico con enlaces 1® 4. Se emplea como vacuna en adultos y niños mayores de cinco años, para prevenir la fiebre tifoidea (5). Una manera de aumentar su eficacia y producir una respuesta inmune en infantes es unirlo covalentemente a una proteína transportadora (6).

En este trabajo se presentan los resultados de la modificación química de pectina de limón y la obtención de un análogo del polisacárido Vi de Salmonella typhi.

PARTE EXPERIMENTAL

Las lecturas de absorbancia se efectuaron en un espectrofotómetro Shimadzu modelo UV-150. Los espectros de infrarrojo con transformada de Fourier (IR-TF) se registraron en pastillas de KBr, en un equipo Bruker IFS 66v. Las segundas derivadas de los espectros se determinaron usando el programa OPUS/IR 1.4 incorporado al equipo (7). Los espectros de RMN 1H se realizaron en la Universidad Católica de Chile, en un equipo Bruker de 200 MHz con la técnica de supresión de la señal de agua, utilizando metanol como referencia interna. Las muestras se prepararon por disolución en agua deuterada (99,9%), congelamiento y liofilización. El proceso se repitió tres veces y las muestras se disolvieron en D2O. La cromatografía gas-líquido (CGL) se realizó en un cromatógrafo Shimadzu, modelo GC-15B, provisto de detectores de ionización por llama. Se utilizó una columna SP-2330 de 15 m x 0,25 mm y como gas portador helio a un flujo de 1,5 mL/min. Las condiciones de trabajo fueron: temperatura inicial 160ºC, tiempo inicial 5 min, velocidad de calentamiento 2ºC/min, temperatura final 10 min, temperatura inyector 220ºC y temperatura de detector 220ºC. La cromatografía líquida de alta eficiencia (CLAE) se realizó en un cromatógrafo Merck Hitachi L-6000 con detector UV l-4000 usando una columna Whatman Partisil 10-Sax de 250 x 4,6 mm. Los microanálisis se realizaron en la Universidad Católica de Chile. Yoduro de metil 1-etil-3-(3-dimetil-aminopropil)carbodiimida (EDC) se adquirió en Sigma. Los frutos de Citrus limon provienen del comercio local.

Métodos espectrofotométricos
Determinación del porcentaje de esterificación

a) Se efectuó según el método de Scott (7) con el reactivo 3,5.dimetilfenol, leyendo la absorbancia a 450 nm. Como muestra patrones se usaron soluciones acuosas de ácido D-galacturónico monohidratado (Sigma) de concentración conocida entre 10-90 mg/mL.

b) Se realizó con el reactivo m-hidroxidifenilo de acuerdo a Blumenkrantz y Asbol-Hansen (9). Las lecturas de absorbancia se efectuaron a 520 nm. Se usaron las mismas muestras patrones que en a).

Determinación de azúcares totales

La determinación de los monosacáridos reductores se efectuó con el reactivo fenol-ácido sulfúrico (10). La absorbancia se registró a 490 nm. Como muestras patrones se prepararon soluciones de D-galactosa (Sigma) de concentración conocida entre 25-150 mg/mL.

Determinación de proteínas

Se efectuó con el reactivo de Bradford (11), efectuando las lecturas de absorbancia a 595 nm. Como muestras patrones se prepararon soluciones de albúmina de suero bovino (Sigma)de concentración conocida entre 0,2-1,0 mg/mL.

Extracción de pectina

Los frutos de limón se pelaron y el mesocarpio o albedo, que corresponde a la parte blanca de la piel, se molió en un aparato Moulinex modelo D56. Mesocarpio molido (440 g) se agitó con 100 mL de etanol 96% durante 2 h a temperatura ambiente y a continuación se centrifugó a 4.000 rpm. El sólido residual se calentó a reflujo con 500 mL de etanol durante 2h, se enfrió y se centrifugó. El sólido resultante se secó a temperatura ambiente y se agitó con 500 mL de una solución 50mM de EDTA/50 mM de oxalato de amonio en 50 mM de acetato de sodio (pH 5,2) a 70ºC durante 2 h (12). La mezcla se enfrió, se centrifugó y el sobrenadante se dializó primero contra agua desionizada durante 24 h y luego, contra agua destilada durante 24 h, efectuando cambios del agua cada cuatro horas. La solución resultante, se concentró y se secó por liofilización. El sólido obtenido se disolvió en el mínimo volumen de agua a 80ºC y se volcó en 5 veces su volumen en etanol 96%. El sólido obtenido se separó por centrifugación y se secó en estufa a 60ºC durante 24 horas.

Hidrólisis básica

Una solución acuosa de pectina al 1,5% se trató con NaOH 0,1 M hasta alcanzar pH 12 y la mezcla se mantuvo a una temperatura de 4ºC durante 48 h. La solución se llevó a pH 5,0 por adición de HCl, se precipitó sobre etanol al 96% (1:5 v/v) y se centrifugó. El precipitado se lavó con etanol y se secó.

Hidrólisis total

Una alícuota (0,020 g) del polisacárido obtenido por hidrólisis básica de la pectina se trató con 17 mL de ácido fórmico al 90% y se calentó en un tubo cerrado a 100ºC durante 6 horas en estufa. La solución resultante se diluyó con 85 mL de agua, se reflujó durante 2 h y se concentró en evaporador rotatorio. Los restos de ácido se eliminaron por evaporaciones sucesivas con agua destilada. El jarabe obtenido se disolvió en 4 mL de agua destilada y se sembró en una columna de Sephadex A-25 de 30 x 2,5 cm. La elución se efectuó primero con agua destilada y cuando el eluyente no dio reacción con el reactivo fenol-ácido sulfúrico, con ácido fórmico al 10%. La fracción que eluyó con agua se concentró en evaporador rotatorio y se trató con borohidruro de sodio. El jarabe resultante se acetiló con una mezcla piridina-anhídrido acético y se analizó por CGL.

La fracción que eluyó con ácido fórmico al 10%, se concentró en evaporador rotatorio y se eliminó el ácido por sucesivas evaporaciones con agua destilada. Una alícuota se disolvió en 1 mL de agua destilada, se trató con 0,02 mL de trietilamina y después de 10 min se analizó por CLAE. El resto, se secó a 53ºC y a 0,1 mm Hg, se pesó, se disolvió en 2 mL de agua destilada y se determinó la rotación específica en un espectropolarímetro Perkin Elmer modelo 241.

Oxidación con bromo

Pectina desesterificada (0,600 g) se disolvió en 20 mL de agua destilada, se agregaron 50 mL de solución acuosa 0,1 M de bromo y se agitó durante 36 h a 30ºC. A continuación se dializó primero contra agua desionizada y luego contra agua destilada por períodos de 24 horas. La solución incolora resultante, se concentró al vacío y se liofilizó.

Análisis del producto de oxidación

Una alícuota del producto de oxidación (0,035 g) se suspendió en 35 mL de metanol anhidro y 1 mL de cloruro de acetilo. La mezcla se reflujó durante 16 h y se enfrió. El metanol se eliminó al vacío y el sólido resultante se disolvió en el mínimo volumen de agua y se trató con 0,080 g de borohidruro de sodio. Después de 24 horas a temperatura ambiente, se llevó a pH con una resina Zeo-Karb 225, se filtró, se concentró y el ácido bórico residual se eliminó en evaporador rotatorio en presencia de metanol. El sólido obtenido se trató con 18 mL de ácido trifluoroacético 2 M durante 16 h a 90ºC, se enfrió y se concentró al vacío. El jarabe resultante se volvió a tratar con borohidruro de sodio, se acetiló y analizó por CGL.

Aminación reductiva de la pectina oxidada

A una solución de la pectina oxidada (0,300 g) en 60 mL de agua destilada, se agregaron 3,0 g de acetato de amonio, disueltos en 60 mL de metanol y 0,600 g de cianoborohidruro de sodio y la mezcla se agitó a 40ºC. Después de 48 horas se ajustó el pH a 4,0 con ácido acético y se agitó durante 2 h a temperatura ambiente. El producto de la reacción se dializó contra agua destilada, se concentró al vacío y se secó por liofilización.

Acetilación

El sólido proveniente de la aminación reductiva se trató con 6,25 mL de piridina anhidra, 1,1 mL de anhídrido acético y 0,5 mL de trietilamina y la solución resultante se agitó a 25ºC durante 96 h. El producto de la reacción se suspendió en metanol (7,5 mL) y se volvió a tratar con anhídrido acético por 24 h. Luego, se filtró y el sólido obtenido se lavó con metanol seguido de éter etílico y se secó. Se obtuvo un sólido blanco con un rendimiento del 78%. IR-TF n (cm-1): 3.433,6 (f), est. O-H; 2.927,4 (m) est. C-H ; 1.735,9 (m) est. C=O; 1.423 (f) est. H-C-O; 1.014,8 (f) est. , C-C, C-O, C-C-O. 2ª derivada: 1.679,1 (f) est. C=O de grupo N-acetilo.

Reacción con caprolactama

A una solución de 0,106 g de EDC en 2,5 mL de acetona al 65% se agregó el producto acetilado (0,120 g) y se ajustó el pH a 6,5 por adición de carbonato de sodio. Luego, se añadieron 0,12 g de caprolactama, disueltos en 1 mL de agua y se agitó durante 18 h a 25ºC. A continuación, se dializó contra agua destilada, se concentró al vacío y se liofilizó. Se obtuvo un sólido ligeramente amarillo. IR-TF n cm-1: 3.431,1 (f) est. O-H; 2922,1 (d) est. C-H; 2.851,2 (d) est. C-H de grupo metileno; 1.413,8 (d, ancha) deformación CH2.

Conjugación a proteína

A una solución de 0,010 g del derivado con caprolactama en 2 mL de dimetilsulfóxido, se agregaron 0,020 de EDC disueltos en 1 mL de buffer fosfato (pH 7,0). Luego, se añadieron 0,010 g de albúmina de suero bovino disueltos en 2 mL del mismo buffer y se agitó durante 6 días a 25ºC. El producto de reacción se suspendió en agua destilada, se dializó contra agua destilada y se separó por centrifugación.

El sólido obtenido se analizó por electroforesis en gel de poliacrilamida al 8% de acuerdo a la técnica de Laemmli (13).

RESULTADOS Y DISCUSION

La extracción de mesocarpio de limón condujo a la obtención de un sólido blanco con un rendimiento del 13,0% y con un contenido de ácidos urónicos del 40% que no dio reacción con el reactivo de Bradford, indicando la ausencia de proteínas. El extracto se sometió a una desesterificación en medio básico, dando un sólido con un 83% de rendimiento y con un contenido de ácidos urónicos del 70%. El espectro de IR-TF mostró la señal característica del estiramiento C=O del carbonilo del anión carboxilato a 1.621 cm-1 y no se observó la señal correspondiente al carbonilo de éster. Sin embargo, el espectro de RMN 1H (d , ppm): 5,12 (H1), 4,73 (H5), 4,46(H4), 3,99 (H3), 3,79 (OCH3), 3,55 (H2), mostró las señales características de una pectina parcialmente esterificada (14). El análisis por cromatografía de exclusión en geles (figura 1) indica que la muestra es moderadamente homogénea. El producto de la hidrólisis total con ácido fórmico se fraccionó por cromatografía de intercambio iónico. La fracción que eluyó con agua, muy minoritaria, mostró por CGL, luego de reducción y acetilación la presencia de los acetatos de alditoles correspondientes a arabinosa, galactosa y ramnosa en una relación molar de 11:3:1. La fracción que eluyó con ácido fórmico mostró por CLAE contener solamente ácido galacturónico cuya rotación específica de [a ]D25º= +44,42º (c, 0,385, agua), lit.[a ]D= +50,9º (15) para el anómero a , indica que posee la configuración D.


Fig. 1. Curva de elución de la pectina desesterificada en Sepharose CL-6B.

El producto enriquecido en ácido poli-D-galacturónico se sometió a oxidación con bromo obteniéndose un sólido blanco, soluble en agua con un rendimiento del 71,2%. Su espectro IR-TF presenta una nueva señal, respecto al polisacárido de partida, a 1.737,2 cm-1 que se asignó al estiramiento C=O de una cetona. La esterificación del producto oxidado permitió su fácil reducción y la hidrólisis total seguida de reducción y acetilación, permitió analizar por CGL los acetatos de alditoles. La ausencia de una señal correspondiente al acetato de gulitol indica que la oxidación se produjo predominantemente en el C-2.

La aminación reductiva del producto oxidado se efectuó a pH 7,0 para evitar la reducción del grupo carbonilo. Se obtuvo con un rendimiento de un 90% un sólido blanco, soluble en agua cuyo espectro de IR-TF no presenta la señal correspondiente al grupo carbonilo de cetona y presenta una nueva señal a 1.583,4 cm-1 atribuible a la deformación N-H de una amina primaria (16). Microanálisis: C 33,39%, H 5,23%, N 2,17%. Calculado para [(C6H9O5N)0,33(C6H8O6)0,67.2H2O]n : C 33,86%, H 4,85%, N 2,17%. Este resultado estaría indicando que aproximadamente una de cada tres unidades monoméricas se encuentra aminada. La peracetilación del polisacárido aminado permitió la obtención de un sólido, soluble en agua cuyo espectro de IR-TF mostró una señal a 1.735,9 cm-1 asignada al estiramiento C=O del O-acetilo y un hombro alrededor de los 1.650 cm-1 que en la segunda derivada se resuelve en una señal a 1.679,1 asignada al estiramiento C=O del grupo-N-acetilo. Este espectro presenta las mismas señales que el correspondiente al polisacárido Vi de Salmonella typhi lo que estaría indicando la formación de un análogo (17).

La pectina modificada constituye un modelo adecuado para el estudio de la conjugación de polisacáridos acídicos a proteínas. El bajo rendimiento logrado por Robbins y colaboradores en la conjugación del polisacárido Vi se explicaría considerando el impedimento estérico que sufren los grupos carboxilo para la unión con una molécula grande como la de una proteína (5). En este trabajo se aplicó la reacción de amidación de los grupos carboxilo de los residuos de ácido D-galacturónico con caprolactama con el objeto de introducir una cadena lateral que permitiera la reacción con los grupos amino de una proteína (18). La reacción del análogo con caprolactama en presencia de carbodiimida, dio un producto insoluble en agua, en etanol-agua y en hidróxido de sodio 0,05 M, poco soluble en dimetilformamida y soluble en dimetilsulfóxido, con un rendimiento del 89,3%. El espectro de IR-TF muestra señales nuevas a 2.891,2 cm-1 que se asignó al estiramiento C-H de los grupos CH2 y una banda ancha centrada a 1.413,8 cm-1 que en la segunda derivada se resuelve en tres señales a 1.493,0 cm-1, 1.473,1 cm-1 y 1.382,8 cm-1 asignadas a las vibraciones de deformación de los grupos CH2. El contenido de nitrógeno (4,99%) estaría indicando que todas las unidades monoméricas estarían unidas a caprolactama; sin embargo, el contenido de carbono menor a lo esperado no permite asignar una fórmula molecular para el producto de amidación.

La reacción de este análogo modificado con albúmina de suero bovino (ABS) en presencia de carbodiimida dio un producto blanco, insoluble en agua que por electroforesis en gel de poliacrilamida en presencia de dodecilsulfato de sodio (fig. 2) muestra una banda correspondiente a la proteína sin conjugar y otras menores que corresponderían a diferentes fracciones de la pectina conjugada a ASB.


Fig. 2. Electroforesis en gel de poliacrilamida al 8%, st: standard de proteínas. 1,2,3: soluciones de pectina modificada-ASB a concentración 0,07, 0,7 y 1,75 mg/mL en buffer pH 7,6.

CONCLUSIONES

La pectina aislada de mesocarpio de limón constituye una materia prima importante para la preparación de polímeros con nuevas funcionalidades y aplicación biológica potencial.

AGRADECIMIENTOS

Se agradece a FONDECYT (proyecto 1980828) y a DICYT de la Universidad de Santiago de Chile por el apoyo financiero y a la bioquímico Elisa Zúñiga por la asistencia técnica en la electroforesis.

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* A quien debe dirigirse la correspondencia. E.mail: bmatsuhi@lauca.usach.cl