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Boletín de la Sociedad Chilena de Química

versión impresa ISSN 0366-1644

Bol. Soc. Chil. Quím. v.46 n.4 Concepción dic. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0366-16442001000400009 

USO DE ESPECTROSCOPIA DE RMN Y MALDI-TOF MS
EN LA ELUCIDACION ESTRUCTURAL DE FLAVONOIDES
ANTIOXIDANTES PROVENIENTES DE LA PLANTA
MEDICINAL CHILENA
Cheilanthes glauca (Cav.) Mett.

E. R. Pastene1*, T. Wilkomirsky1, G. Bocaz2a, J. Havel2, I. Peric3,
M. Vega1, M. González1 y J. Alderete4

1 Fac. de Farmacia, Universidad de Concepción, Casilla 237, Concepción, Chile
2 Masaryk University, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Kotlárská 2,
61137 Brno, Czech Republic
a Bajo autorización del: Departamento de Laboratorios, Servicio Médico Legal, Ministerio de
Justicia, Av. La Paz 1012, Santiago, Chile
3 Depto. de Química Analítica e Inorgánica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad de
Concepción, Casilla 160-C, Concepción, Chile
4 Depto. De Química Orgánica, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad de Concepción,
Casilla 160-C, Concepción, Chile

RESUMEN

La especie nativa Cheilanthes glauca (Cav.) Mett., es usada en medicina popular en el tratamiento tópico de heridas y contusiones. Un estudio del extracto metanólico total demostró la presencia de antioxidantes en la fracción extraída con acetato de etilo. De esta fracción se aisló dos flavonoides conocidos, quercetina-3-O-ramnoglucósido y canferol-3,7-O-diramnósido. Ambos compuestos son descritos por primera vez en esta especie. La determinación estructural se llevó a cabo mediante comparación con sustancias patrón, hidrólisis química, espectros UV, RMN-1H y 13C, COSY 1H-1H, DEPT y MALDI-TOF MS. Sólo quercetina-3-O-ramnoglucósido (rutina), demostró tener actividad decolorante inespecífica in vitro sobre el radical DPPH.

PALABRAS CLAVES: Cheilanthes glauca, RMN-1H, RMN-13C, MALDI-TOF MS, Flavonoides, Rutina, Canferol, Antioxidantes.

SUMMARY

Cheilanthes glauca (Cav.) Mett., is a native Chilean species used in popular medicine for the topical treatment of wounds and contusions. A study on the total methanolic extract showed the presence of antioxidants in the ethyl acetate fraction. From this fraction, two known flavonol glycosides were isolated, quercetin-3-O-rhamnoglucoside and kaempferol-3,7-O-dirhamnoside. Both substances are described for the first time in this species. Structural elucidation was carried out by comparison with standard substances, chemical hydrolysis, UV spectra, 1H- and 13C- NMR, COSY 1H-1H, DEPT and MALDI-TOF MS. Only quercetin-3-O-rhamnoglucoside (rutin) showed unspecific in vitro decolourizing activity upon DPPH radical.

KEY WORDS: Cheilanthes glauca, 1H-NMR, 13C-NMR, MALDI-TOF MS, Flavonoids, Rutin, Kaempferol, Antioxidants.

INTRODUCCION

Cheilanthes glauca (Cav.) Mett. (Adiantaceae), es una especie nativa chilena conocida como "Doradilla". Este helecho crece desde la cordillera central al sur del país. En medicina popular se emplea en forma tópica para curar heridas y en uso interno por sus posibles propiedades antiinflamatorias, diuréticas y protectoras hepáticas1). Los representantes del genero Cheilanthes aparecen citados en la literatura como helechos ornamentales sin aplicaciones médicas reportadas. Las investigaciones fitoquímicas llevadas a cabo en diferentes especies de Cheilanthes se han orientado a los compuestos apolares como cheilarinosina; 3,7 di-O-metilcanferol; 3,7,4` tri-O-metilcanferol; 7-O-metilapigenina y D-glucósido de sitosterol2,3). La especie investigada en este trabajo no posee antecedentes fitoquímicos previos ni tampoco estudios de su actividad biológica.

La búsqueda de sustancias con actividad antioxidante en el reino vegetal ha tomado caminos diferentes. Por un lado interesa encontrar fuentes de antioxidantes naturales para ser usados como aditivos alimentarios, que puedan reemplazar total o parcialmente a los sintéticos como el butilhidroxitolueno (BHT) y butilhidroxianisol (BHA) 4, 5, 6). La comprobada toxicidad de éstos ha llevado a que muchos países de la Unión Europea hayan decidido reemplazarlos por productos más inocuos 7, 8, 9). Por otro lado, está la búsqueda de especies vegetales cuyo alto contenido en antioxidantes (fitocomplejo antioxidante) signifique un aporte en el tratamiento y prevención de patologías ligadas a la oxidación de moléculas biológicas. Esto último está avalado por la gran cantidad de información generada por los estudios en el vino y diferentes frutales ricos en antocianos10, 11, 12). El uso popular de Cheilanthes glauca como agente antiinflamatorio y hepatoprotector hace pensar en la existencia de sustancias con capacidad captadora de radicales dentro de su composición. Como es ampliamente conocido, estas especies están involucradas en los mecanismos de daño celular descritos para ambas patologías.

Tras la actividad biológica de un extracto vegetal existe una serie de principios activos. Por lo tanto, el empleo de técnicas espectroscópicas que permitan elucidar la estructura de estas sustancias, es fundamental para delinear futuros estudios en el ámbito farmacológico-clínico y de síntesis de moléculas más activas.

En este trabajo se presenta un fraccionamiento de antioxidantes provenientes de la especie nativa Cheilanthes glauca, empleando como criterio orientador la capacidad captadora del radical libre estable DPPH. La determinación de las estructuras se llevó a cabo empleando técnicas de resonancia nuclear magnética (RMN) y espectrometría de masas. "Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry" (MALDI -TOF MS) es una técnica originalmente ideada para el estudio del peso molecular de macromoléculas (polímeros sintéticos, péptidos y proteínas). En los últimos diez años ésta técnica y la ionización por electrospray (ESI), han significado un aporte importante en el campo de las ciencias químicas y bioquímicas13). ESI puede ser fácilmente acoplada a sistemas de separación por cromatografía liquida (LC) mientras que MALDI permite analizar en forma directa muestras mixtas sin necesidad de acuciosos procesos de purificación. El sistema utiliza un láser UV que desorbe la muestra, la cual es aplicada como cristales o co-cristales formados con una matriz específica. Durante el proceso de desorción y expansión, el analito es ionizado. En general, los iones moleculares son las especies predominantes. Esto último hace más fácil la asignación de las masas, incluso para mezclas que contengan varias especies14,15).

En el estudio de productos naturales constituye una poderosa herramienta porque permite la obtención rápida de información sobre pesos moleculares con pequeñas cantidades de muestra. La aplicación no sólo se ha limitado al estudio de macromoléculas. Los trabajos de Hübner et. al. demuestran la potencialidad de MALDI en la elucidación estructural de glicosilflavonoides. Estos investigadores consideran que el uso conjunto de MALDI con otros tipos de espectrometría de masa con mecanismos diferentes de ionización (FAB-MS, D/CI-MS, etc) en paralelo con los experimentos de RMN (COSY, NOESY, HETCOR, HMBC, etc), entregan información de gran valor para la completa elucidación estructural de flavonoides oligosacáridos16).

PARTE EXPERIMENTAL

Los espectros de RMN-1H y 13C fueron registrados en un espectrómetro Bruker modelo AC 250-P. La muestras se disolvieron en metanol-d4 o DMSO-d6, usando TMS como referencia interna. Se utilizaron los programas de RMN-1H, COSY 1H -1H, Correlación X-H, DEPT a 45 y 135º. Los espectros de masas MALDI-TOF fueron obtenidos en un espectrómetro Kratos Kompact MALDI III (Manchester, UK), equipado con un láser de N2 VSL-337D-10-TTL de Laser Science Inc. (Franklin, MA, USA) y operado a una longitud de onda de 337 nm con una duración de pulso t (tau) = 10 ns. La energía de pulso fue de 250 m J, la potencia promedio a 10 Hz fue de 2,5 mW y la potencia de pico 85 kW. La energía del láser estuvo en el rango de 0-180 unidades relativas. Para cada muestra se promedió un total de 100 disparos del láser. El potencial del campo de extracción continua fue de ± 20kV. Las medidas fueron hechas en un vacío de 10-6 Pa. Las condiciones experimentales fueron controladas usando el software Kratos Kompact V 2.0 en una unidad SPARC Classic Sun Microsystems, Inc, operado por el software UNIX Solaris 2.3. Las muestras fueron aplicadas en una platina de acero inoxidable y secadas con aire. Un primer grupo de fragmentos fue obtenido y analizado usando la modalidad de "laser desorption ionization" (LDI), que no emplea matriz, sino metanol saturado con la muestra (100 mL). Posteriormente, las muestras fueron analizadas usando diferentes matrices (MALDI). Las matrices empleadas fueron el ácido a -ciano-4-hidroxicinámico (a -CHC) y ácido 3,5-dihidroxibenzoico (DHB) ambos de la firma SIGMA-Aldrich Chemie GmBH (Steinheim, Alemania). El a -CHC y DHB se disuelven en acetonitrilo con 0,5 % de citrato de amonio. Se preparó 100m L de solución saturada con a -CHC o DHB. Se mezcló 50m L de acetonitrilo + 50 m L de citrato de amonio 0,5 % en solución saturada de CHC o DHB + 0,5 mL de muestra. Para el análisis de las muestras sin la presencia de matriz (LDI) se depositó en la platina de acero inoxidable una alícuota de 1,0 mL de solución diluida de los extractos metanólicos. De igual forma, usando adición de matrices (MALDI) se depositó en la placa de muestras un volumen total de 1,5 mL correspondiente a 1,0 mL solución de matriz saturada más 0,5 mL de solución diluida de los extractos. Las placas con las muestras preparadas fueron usadas para el análisis y se estudiaron los espectros de masas tanto cuando la modalidad lineal (positivo, negativo) o de reflectron (positivo, negativo) es aplicada en orden a enfocar las partículas en vuelo hacia el detector.

Los espectros de UV fueron registrados en un espectrofotómetro UV-Visible Shimadzu 1601 (Japón). Los reactivos sodio metálico, tricloruro de aluminio, acetato de sodio anhidro y ácido bórico fueron todos de calidad analítica Merck (Darmstadt, Alemania).

El material vegetal fue recolectado en la localidad de Peña Negra a 80 km de Chillán, al norte del estero Las Raíces, 600 m s.m. (36º 58` S ¾ 71º 48` W), entre los meses de Enero y Febrero de 1999. La identificación botánica fue hecha por el Prof. Max Quezada. Un ejemplar fue depositado como testigo en el herbario de la Universidad de Concepción, donde quedó conservado bajo el número CONC148497.

Extracción y fraccionamiento: 500 g de hojas desecadas y pulverizadas (40 mesh) fueron extraídos a temperatura ambiente dos veces con metanol por 8 días. Los extractos reunidos fueron filtrados y concentrados al vacío (Tº < 40 ºC). El residuo (42 g), fue secado en capa delgada hasta una humedad de 3 % aproximadamente. Una parte del extracto seco (15 g) se disolvió en 200 mL agua caliente y dejó reposar por 12 horas en el refrigerador. El precipitado amarillo formado fue separado por centrifugación y posteriormente lavado varias veces con agua fría y finalmente con éter etílico. Se obtuvo 0.93 g de polvo amarillo verdoso (CG-A). El remanente acuoso (CG-B), fue extraído 5 veces con diclorometano. El extracto de diclorometano (EDCL) fue secado a presión reducida (0.462 g). Se continuó la extracción con acetato de etilo (x 5). El extracto de acetato de etilo (EAE) fue secado a presión reducida con un rendimiento de 1.12 g y el remanente acuoso (EACUO) fue liofilizado (10.22 g).

Purificación de la fracción CG-A: El precipitado fue disuelto en metanol y sometido a sucesivas separaciones en columna de Sephadex LH-20 (2,5 x 40 cm), usando metanol como fase móvil. Como resultado se obtuvo un sólo compuesto mayoritario (CG-1), el cual fue purificado por cromatografía en capa fina preparativa (PTLC) sobre gel de sílice 60 PF254 (20 x 20 cm, 2 mm de espesor), usando acetato de etilo/ácido fórmico/agua (9+1+1 v/v) como fase móvil. Finalmente la sustancia fue limpiada en columna de Sephadex LH-20 (1 x 30 cm), usando metanol/agua 80 % como fase móvil. Se obtuvo por cristalización al vacío desde metanol-agua, 452 mg de la sustancia CG-1.

Actividad captadora de radicales libres: Para determinar la actividad captadora de radicales libres se empleó la reducción del radical coloreado DPPH (1,1-difenil-2-picrilhidrazilo). La actividad se expresa como concentración efectiva 50 (EC 50), que es la concentración de la muestra requerida para disminuir la absorbancia del radical en un 50 % comparado con una solución blanco. Se preparó soluciones de los extractos EDCL, EAE y EACUO desde 0,1 hasta 800 m g/mL. En la determinación, 750 m L de las muestras se mezclaron con 1,5 mL de la solución de DPPH. La mezcla se dejó reposar 5 minutos para luego leer la absorbancia a 517 nm. Para la obtención de los resultados se aplicó regresión lineal a los datos entre 1 y 90 %. Como control positivo se usó quercetina (EC 50 = 5,15 mg/mL).

Purificación de EAE: EAE se disolvió en metanol y mezcló con 1 g de quitina. La mezcla se secó a presión reducida y aplicó sobre una columna de quitina (2,5 x 45 cm) acondicionada con cloroformo. La muestra se separó por cromatografía en columna de presión media (MPLC), usando gradiente de CHCl3-CH3OH (0-100 % con incrementos de 5 %). Se obtuvo dos compuestos mayoritarios que fueron purificados siguiendo el mismo protocolo usado para la fracción CG-A. El análisis por CCF analítica permitió establecer que uno de los compuestos correspondía al mismo CG-1 aislado del precipitado CG-A, mientras que el otro se denominó CG-2 (550 mg). Este último fue cristalizado al vacío, desde metanol agua (1:1).

La pureza de CG-1 y CG-2 fue controlada por HPTLC bidimensional (5 x 5 cm), usando placas tratadas previamente con K2HPO4 0,1 M, y con la fase móvil acetato de etilo/ácido fórmico/agua (9+1+1 v/v). Los cromatogramas fueron analizados a la luz UV de 254 nm y 366 nm. Para detección específica de grupos orto hidroxilados se uso el reactivo de fluorescencia difenilboriloxietilamina (SIGMA). Adicionalmente, se confirmó la pureza por electroforesis capilar de alta eficiencia (HPCE), usando un equipo PrinCE 450 Capillary Electrophoresis System conectado a un detector Lambda 1010 UV-Vis (Bishoff, Leonberg, Alemania). El tampón empleado fue un sistema típico para cromatografía micelar electrocinética (MEKC), tetraborato sódico decahidrato 10 mM y sodio dodecilsulfato 30 mM.

Hidrólisis de CG-1 y CG-2: 10 mg de cada sustancia fueron hervidos a reflujo por 1 hora con CF3COOH 0,1N 17). Los aglicones liberados fueron identificados mediante sus espectros UV, utilizando reactivos de desplazamiento. Adicionalmente se comparó con patrones por CCF en gel de sílice G 60, empleando como fase móvil tolueno/cloroformo/acetona (8 + 5 + 7 v/v). Los azúcares fueron identificados por CCF en gel de sílice G 60 pretratada con KH2PO4 0,1 M, usando como fase móvil acetonitrilo/agua (85 + 15 v/v), y multidesarrollo vertical (5 veces)18).

RESULTADOS

El extracto metanólico total de Ch. glauca fue particionado exhaustivamente con solventes de polaridad creciente. Los extractos obtenidos fueron sometidos a fraccionamiento empleando como criterio de potencia antioxidante, la determinación de la EC50 frente al radical DPPH. Las EC50 indicaron una mayor actividad antioxidante inespecífica para EAE (EC50 = 52,21 mg/ml) y EACUO (EC50 = 70,74 mg/ml), mientras que EDCL (EC50 = 1227 mg/ml) mostró una actividad muy débil.

El estudio fitoquímico de la fracción más activa, EAE, indicó la presencia de flavonoides. La estrategia de aislamiento dio como resultado dos compuestos denominados CG-1 y CG-2. Al someter a CG-1 a hidrólisis ácida se detectó quercetina y los azúcares glucosa y ramnosa (1:1). Mediante el mismo procedimiento, de CG-2 se obtuvo la genina canferol y ramnosa como único azúcar. El análisis de los espectros de UV confirmó la estructura de las geninas producto de la hidrólisis (Tabla I). Los espectros de UV para CG-1, obtenidos con los diferentes reactivos de desplazamiento, indican un patrón de oxidación de CG-1 acorde con un derivado de quercetina sustituido en el C-3. Para CG-2, se observó desplazamientos concordantes con un derivado de canferol sustituido en C-3 y C-7. Adicionalmente, las sustituciones fueron estudiadas utilizando el revelador de CCF difenilboriloxietilamina. CG-1 y su genina mostraron una fluorescencia anaranjada al UV, que es típica de sistemas 3´,4´orto-hidroxilados. CG-2 y su genina presentaron una fluorescencia amarillo-verdosa al UV, típica de un flavonoide con un solo hidroxilo en el anillo B ( 3´ ó 4´). El alto Rf de la sustancia CG-2 en diferentes sistemas cromatográficos para glicósidos de flavonoides confirmó la presencia de más de un azúcar.


El espectro de RMN-1H de CG-1 en metanol-d4 mostró el singulete típico de los protones metílicos de la ramnosa a campo alto. Las señales de los protones libres en C-2`, C-6`y C-5`, confirmaron la presencia de OH fenólicos en C-3`y C-4` (Tabla II). El espectro de RMN-13C arrojó 27 átomos de carbonos cuyas asignaciones están detalladas en la Tabla III. La relación entre los protones fue estudiada en los experimentos COSY 1H-1H, mientras que la relación entre protón y carbono fue corroborada mediante la Correlación X-H (datos no presentados). El experimento DEPT a 135º mostró un núcleo de carbono en fase negativa correspondiente al C-6 de la función CH2OH de la glucosa.


El análisis de CG-2 mostró un espectro de RMN-1H en metanol-d4 con dos señales de protones metílicos correspondientes a dos moléculas de ramnosa unidas en dos puntos distintos del flavonoide. La sustitución hidroxilica se confirmó con las señales de los protones en C-2´, C-3´, C-5´ y C-6´, patrón típico de canferol con OH libre en C-4` (Tabla II). El espectro de RMN-1H en DMSO-d6 mostró sólo los singuletes anchos correspondientes a OH fenólicos libres en C-5 y C-4´. El espectro de RMN-13C arrojó 27 átomos de carbono cuyas asignaciones están detalladas en la Tabla III. La relación entre los protones fue estudiada en los experimentos COSY 1H-1H, mientras que la relación entre protón y carbono fue corroborada mediante la Correlación X-H (datos no presentados).


En el estudio de CG-1 y CG-2 por MALDI-TOF/MS, se ensayó diferentes modalidades de detección. Para iones negativos se empleó Linear Negative y Reflectron Negative, las cuales generaron espectros complejos y de difícil interpretación. Los mejores resultados se obtuvieron con las modalidades Linear Positive y Reflectron Positive, donde los iones detectados fueron similares. El empleo de diferentes matrices, tanto para CG-1 y CG-2, no dio mejores resultados que la aplicación de la muestra sin matriz. Los iones Na+ y K+ presentes en las muestras fueron suficientes para absorber la energía del láser, produciendo ionización de los flavonoides sin descomposición.

En la modalidad Linear Positive las partículas cargadas siguen una trayectoria recta hacia el detector (linear fly path), con una mayor distribución de la energía cinética y menor resolución de los picos. No obstante, este modo posibilita la detección de iones metastables y especies neutras.

La resolución del equipo es mejorada ostensiblemente con el Reflectron. En este sistema, los iones extraídos de la fuente son repelidos por un voltaje deflector (V0). Este ocasiona un desvío de las partículas de su trayectoria lineal, llevándolas hacia el Reflectron. Allí son devueltas hacia un segundo detector mediante la aplicación de un segundo voltaje VR (VR > V0). Esto ocasiona que la distribución en el tiempo de vuelo (causada por la energía inicial cuando el ion es generado), para iones que poseen la misma masa, sea eliminada. El fenómeno se conoce como "enfoque en el tiempo" y permite que iones con m/z equivalentes sean detectados al mismo tiempo, independientemente de la magnitud de su energía inicial. El aumento en la trayectoria es directamente proporcional al tiempo de vuelo. Debido a lo anterior, se estrecha la energía cinética de los iones a medida que estos entran al detector, aumentando la resolución del instrumento.

En la Fig.1 se presenta los espectros de masas para ambas sustancias en la modalidad Reflectron Positive, sin uso de matriz. Las m/z observadas en la figura deben ser divididas por el factor 1.04, debido a que es necesario corregir el efecto del Reflectron sobre el tiempo de vuelo. De esta manera se obtienen los mismos resultados de m/z que en la modalidad Linear Positive, donde la m/z de los fragmentos es leída directamente.


FIG. 1. Espectro MALDI-TOF MS de glicosilflavonoides aislados de Ch. glauca. (a) CG-1, Reflectron Positive, potencia del láser 180 r.p.u., sin matriz. (b) CG-2. Reflectron Positive, potencia del láser 180 r.p.u., sin matriz.

En la modalidad Linear Positive, CG-1 mostró un ion molecular con m/z 630.8 generado por adición de protón, correspondiente a [CG-1. H2O + 2H]2+. La señal observada a m/z 323.4 correspondió al fragmento generado por adición de un catión, [quercetina + Na]+. La señal correspondiente a quercetina sola se encontró a m/z 301.3. En la modalidad Reflectron Positive se resolvió una señal de menor intensidad de m/z 340.48 (354.1/1.04), que correspondió a [quercetina + K]+. Una pico de intensidad muy débil se apreció en la modalidad Reflectron Positive, correspondiente al fragmento [ramnosa-glucosa]+. La sustancia fue comparada con un patrón de rutina (Merck, Darmstadt, Germany) para el cual se obtuvo los espectros MALDI-TOF-MS, encontrándose total coincidencia (datos no presentados).

En la modalidad Linear Positive, CG-2 mostró un ion molecular a m/z 618,7 correspondiente a [CG-2. H2O + Na]+. Una señal a m/z 596.7 correspondió a [CG-2 + H2O]+, con un pico muy débil a m/z 454.8 debido al fragmento [canferol-ramnosa + Na]+. Un fragmento a m/z 329.6 se asignó a la genina [canferol + 2Na]2+. El fragmento de relación m/z 307.1 correspondió a [canferol + Na]+ mientras que el de m/z 285.6 a la genina. Finalmente el fragmento de m/z 164.1 correspondió a la masa de ramnosa. No hubo indicios de un fragmento correspondiente a di-ramnosa, lo que confirmó lo indicado por los espectros de UV y RMN en DMSO-d6, que se trataría de una sustitución con dos residuos de ramnosa en C-3 y C-7, quedando libres los hidroxilos en C-5 y C-4´.

DISCUSION

De la fracción más activa de Ch. glauca se aisló dos sustancias de estructura tipo flavonol. Se confirma que CG-1 corresponde al flavonoide rutina, uno de los compuestos fenólicos más corrientes en vegetales superiores. No obstante, su presencia en Ch. glauca se desconocía hasta ahora. CG-2 fue identificado como canferitrin (canferol 3,7-O-diramnósido), sustancia aislada por primera vez en Indigofera arrecta (Leguminoseae). El compuesto también ha sido descrito en otras leguminosas como Lespedeza cyrtobotrya, Lathyrus odoratus y Lotus corniculatus. Se ha reportado su presencia en representantes de otras familias no relacionadas como Tilia platyphyllos (Tiliaceae), Celastrus (Celastraceae) y Tagetes (Compositae)19).

El uso concomitante de ambos tipos de espectroscopía permite obtener mayor información estructural. La RMN ha sido empleada durante muchos años como técnica clave en la determinación de las estructuras de un sinnúmero de sustancias de origen natural. MALDI, aunque conocida hace mucho tiempo, ha evolucionado rápidamente en la última década. Esta tiene la ventaja comparativa sobre otras técnicas indirectas, que para obtención de pesos moleculares no necesita derivatización de los glucósidos altamente polares. Ambas técnicas tienen la limitante de no entregar información relacionada con la configuración absoluta de la fracción azucarada. Para dichos estudios se requiere, si la cantidad de sustancia lo permite, la obtención del poder rotatorio, derivados diastereoméricos, o el empleo de métodos de correlación como HPLC, GC o HPCE con fases móviles o estacionarias quirales.

El ensayo posterior de ambos compuestos puros sobre DPPH mostró una actividad importante sólo para rutina. Este hecho ha sido probado en numerosos trabajos empleando diferentes modelos de oxidación20). Se debe tener presente que una parte importante de la rutina fue removida previamente en el precipitado CG-A, por lo que la actividad de la fracción EAE habría sido aun mayor si hubiese contenido toda la rutina. En este ensayo, canferol 3,7-diramnósido no mostró un efecto importante. Sin embargo, es preciso considerar que la ingestión de estas sustancias necesariamente involucra aspectos metabólicos que pueden llevar a la generación de las geninas libres canferol y quercetina, además de algunos metabolitos biodisponibles. Mientras las geninas poseen un importante efecto antioxidante in vivo, sus metabolitos (principalmente ácidos fenólicos, cinámico, fenilacético, benzoico, fenilpropanoico y floroglucinol), poseen una actividad antioxidante atenuada e inespecífica21). La EC50 (5,15 m g/mL) del control positivo quercetina (uno de los metabolitos de rutina), obtenida bajo nuestras condiciones, es la más baja de todas las muestras ensayadas. Por lo anterior, se concluye que esta planta debe sus efectos beneficiosos, a la presencia mayoritaria de flavonoides. Es sabido que los antioxidantes de plantas se comportan de diferente manera dependiendo de agente oxidante que se emplee en el ensayo22). Debido a esto, actualmente se están realizando estudios para demostrar la actividad antioxidante frente a otros radicales como el OH°• y O2°¯ cuya producción in vivo es importante en diferentes procesos como el envejecimiento y la injuria celular. Asimismo, una parte de los esfuerzos está puesta en la determinación de la capacidad antioxidante en sistemas más complejos y de mayor importancia biológica como las lipoproteinas de baja densidad LDL. A lo anterior hay que sumar la determinación cuantitativa de este tipo de sustancias de la planta, la cual es necesaria para estimar si el uso popular representa una real contribución en la prevención de patologías ligadas a radicales libres.

E. R. Pastene agradece a la Dirección de Investigación de la Universidad de Concepción el apoyo económico mediante el Proyecto DIUC 98074023-11. El autor hace un especial reconocimiento a Silvia Fernández (Universidad de Concepción, Chile), por su colaboración en la obtención de los espectros de RMN y al Dr. J. Havlis (Masaryk University, Czech Republic), por su apoyo en las mediciones realizadas con el equipo MALDI. El Dr. I. Peric agradece a la Deutsche Gesellschaft für Technische Zusammenarbeit (GZT) por el suministro del Aparato de electroforesis capilar.

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