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Boletín de la Sociedad Chilena de Química

versión impresa ISSN 0366-1644

Bol. Soc. Chil. Quím. v.45 n.2 Concepción jun. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0366-16442000000200018 

R-FICOERITRINA DE GRACILARIA CHILENSIS: ESTABILIDAD E
INTERACION ENTRE SUBUNIDADES

Marta Bunster, Carlos Contreras-Martel, Carola Bruna y
José Martínez- Oyanedel

Laboratorio de Biofísica Molecular, Depto. Biología Molecular, Facultad de Ciencias
Biológicas, Universidad de Concepción.
(Recibido Abril 11, 2000 - Aceptado Mayo 11, 2000)

En memoria del Doctor Guido S. Canessa C.

SUMMARY

Numerous biological macromolecules are arranged in complex interaction systems, to perform their biological function. Phycobiliproteins, the main polypeptidic components of the phycobilisomes, are very good examples for explaining these interactions because their light harvesting and conduction function depend strongly on the three dimensional arrangement of the complex.

The functional unit of R-phycoerythrin from Gracilaria chilensis is (ab)6 and all the subunits require to be perflectly packed to perform the function. For this reason it was selected to study the rol of the different type of interactions in the stability of the protein. To distinguish the contribution of some of the different type of interactions , differential spectrocopy was used to follow the effect of temperature, ionic strengh and presence of urea and the structural information was used to analyse the interaction surfaces that are produced during the association.

Our results suggest that ( ab ) is the minimum specie detectable because its interaction surface presents an important hydrophobic component and because in this process, 9 new hydrogen bonds are formed, that contribute to the stability. The stabilization of (ab)6, requires the contribution of all the subunits involved.

Key words: R-phycoerythrin, interaction surfaces, stability.

RESUMEN

Numerosas macromoléculas biológicas requieren, para realizar su función, constituir sistemas complejos de interacción. Las ficobiliproteínas, principales componentes polipeptídicos de los ficobilisomas, son buenos ejemplos para explicar estas interacciones, porque su función de captación y conducción de luz depende fuertemente de la organización tridimensional del complejo.

La unidad funcional de R-ficoeritrina de Gracilaria chilensis es (ab)6 y requiere estar empaquetada correctamente para realizar su función. Por lo tanto constituye un buen sistema para estudiar el rol de los diferentes interacciones en la estabilidad de la proteína. Para distinguir la contribución de alguno de los distintos tipos de interacciones, se utilizó espectroscopía diferencial para seguir el efecto de temperatura, fuerza iónica, presencia de urea y se utilizó la información estructural para analizar las superficies de interacción que se producen durante la asociación.

Los resultados señalan que (ab ) es la unidad mínima detectable, porque su superficie de interacción presenta un fuerte componente hidrofóbico y porque durante el proceso de asociación se forman 9 puentes hidrógeno que contribuyen a la estabilidad. Por otro lado, la estabilización de (ab)6 requiere la contribución de todas las subunidades.

Palabras claves: R-ficoeritrina, superficie de interacción, estabilidad.

INTRODUCCION

En los sistemas biológicos existen muchos casos en que la interacción entre macromoléculas en sistemas complejos, proporciona el ambiente estructural para la realización de la función biológica. Es el caso de la interacción entre las subunidades de hemoglobina(1), ADN-proteína (2), viruses(3,4), complejos antígeno-anticuerpo(5), complejos multienzimáticos(6) y otros. En todos ellos las interacciones macromolécula-macromolécula o macromolécula solvente, juegan roles preponderantes. La energía de interacción entre estas moléculas se deben a fuerzas eléctricas, considerando entre éstas, las interacciones dipolo-dipolo y casos particulares como las interacciones puente hidrógeno y las interacciones iónicas que forman verdaderos puentes salinos entre dos iones cuya energía de atracción coulómbica es mayor que su energía térmica . Ninguna de estas fuerzas per se es capaz de explicar la asociación en complejos macromoleculares. Es necesario que exista un balance de fuerzas que desplace el equilibrio hacia la formación de los complejos(7).En este artículo se utiliza una proteína oligomérica R-ficoeritrina, para analizar el rol de estas interacciones en la estabilidad molecular.

Las ficobiliproteínas(8) son proteínas fluorescentes, que contienen grupos tetrapirrólicos covalentemente unidos a la apoproteína. Están organizadas en un complejo macromolecular, el ficobilisoma, cuya principal función es la captación y conducción de luz hasta los centros de reacción fotosintéticos(9). Los ficobilisomas en células intactas son un complejo ordenado de ficobiliproteínas. En Gracilaria chilensis(10) está compuesto de R-ficoeritrina(PE), ficocianina(PC), y aloficocianina(APC), ordenadas de acuerdo a sus propiedades de emisión y absorción para lograr una eficiencia cercana al 100% en la conducción de luz. Constituyen, por esta razón, un modelo de estudio para establecer el perfecto grado de asociación que debe existir entre subunidades y entre diferentes ficobiliproteínas para lograr la función de conducción de energía luminosa hacia los fotosistemas, en algas rojas y cianobacterias.

R-Ficoeritrina está organizada por la asociación de 6 unidades (ab). La cadena a contiene 164 ámino ácidos y dos ficoeritrobilinas enlazados a las cisteínas covalentemente 82 y 139 (aCYE1 y aCYE2); la cadena b contiene 177 ámino ácidos y dos ficoeritrobilinas enlazadas a cisteínas 82 y 158 (bCYE1 y bCYE2), y una ficourobilina enlazada a cisteína 50/61(bCYU) .La localización de cada uno de estos componentes se muestra en la Figura 1. Para demostrar los factores que están involucrados en la estabilidad de R-ficoeritrina como héterohexámero, y de extender esta información a las otras proteínas de la familia( ficocianina y aloficocianina) , se realizaron experimentos de perturbación, monitoreados por espectroscopía de absorción, de fluorescencia y el apoyo de datos de cromatografía de exclusión molecular. La interpretación de estos datos se apoya en los datos estructurales que involucran, la localización de los cromóforos y las superficies de interacción entre subunidades, y asociaciones de ellas.

Fig.1. La figura muestra la organización de una unidad (ab)2. La cadena polipeptídica se indica con un modelo de cintas. Las cadenas laterales de los ámino ácidos no se muestran. Sobre la superficie HD se encuentra la subunidad b en gris oscuro y la subunidad a en gris claro. En la parte inferior de la figura se encuentran las subunidades equivalentes. Los grupos cromóforos se indican como modelos de barras. Las superficies de interacción están señaladas.

MATERIALES Y METODOS

Materiales.

R-ficoeritrina se obtuvo a partir de Gracilaria chilensis de acuerdo a la literatura(10). Gracilaria chilensis se recolectó en la costa del Pacífico en la Estación de Biología Marina perteneciente a la Universidad de Concepción en Dichato. Los reactivos fueron pro-analisis( MERCK, Darrmstadt, Alemania). Se obtuvo una solución de proteína pura ( 3 mg/ml) , que se utilizó en los experimentos posteriores.

Métodos.

Espectroscopía de absorción: La espectroscopía diferencial de absorción se realizó en un espectrofotómetro Shimadzu uV-160 .Se registró el espectro de absorción en el rango 400 a 700 nm. Las muestras(dilución 1:20) se incubaron 10 min a las diferentes temperaturas en tampón fosfato 100mM pH6 o en tampón acetato 100mM pH4. Para los experimentos de perturbación por urea, se registraron los espectros de absorción en el rango de longitudes de onda ya descrito, después de la incubación durante 24 h a 4C de la proteína en tampón fosfato 100mM pH6 en presencia de diferentes concentraciones de urea (0, 2, 3, 4, 5 y 6M).

Cromatografía de exclusión molecular : Estos experimentos se realizaron a temperatura ambiente usando un sistema cromatográfico de baja presión(Merck-Hitachi), con una columna Sigmachrom GFC 13000, a pH 6, después de incubar la muestra durante 1 h a las diferentes fuerzas iónicas. Para todas las medidas se utilizó una dilución 1:4 de la solución stock. La presencia de los diferentes estados de asociación se detectó mediante la calibración de la columna con estándares de peso molecular(BIORAD Laboratories, Hercules, CA, USA): Tiroglobulina(bovino), Gamma-globulina(bovino), Ovalbúmina(pollo), Mioglobina(caballo) y Vitamina B12. ( 670, 158, 44, 17 y 1.3 KD respectivamente ).

Cálculo del area superficial accesible:el area superficial accesible se calculó a partir de las coordenadas de R-ficoeritrina, determinada en nuestro laboratorio(11 ) utilizando el programa MOLMOL 2.6 ( 12), con una esfera de exclusión de 1.4 Å.

Resultados y Discusión

La unidad básica de la R-ficoeritrina es el héterodímero ab, dos cadenas polipeptídicas asociadas de acuerdo a la Figura 1, que se reunen con otra unidad ab para formar una unidad (ab)2 , tres de estas últimas, en un proceso no detectable con los métodos utilizados , se asocian para formar un heterohexámero muy estable (ab)6(13 ) . Las especies ab son tan estables que requieren pH2 y urea 9M para lograr su disociación( 14). Experimentos previos nos permiten señalar que el héterohexámero es también extremadamente estable constituyendo la unidad funcional de la proteína. Los experimentos de perturbación con urea, que se muestran en la Figura 2, indican que cuando se alcanzan concentraciones sobre 3M urea a pH 6 ,disminuye preferencialmente la absorción a 566nm, que corresponde a la absorción de ficoeritrobilinas .Resultados obtenidos previamente (13), indican además, que durante un experimento realizado en las mismas condiciones y monitoreado por cromatografía de filtración molecular, R-ficoeritrina conserva el grado de oligomerización (ab)6 , observándose sólo la expansión del tamaño molecular. Urea se utiliza frecuentemente para inducir el desplegamiento de las proteínas, mediante la interacción a través de la formación de puentes H y la exposición paulatina de regiones hidrofóbicas. En este caso particular, sin embargo, aun a concentraciones 6M urea , se mantiene la estructura global de heterohexámero. Se observa una clara disminución de la absorción a 566nm, mucho mas marcada que a 495nm, lo que confirma que el cromóforo CYE 2 que en el análisis de superficies de interacción se internaliza, es el que se desestabiliza en presencia de urea. Este mismo efecto puede visualizarse en los experimentos realizados variando la temperatura como se observa en la Figura 3. El rango de temperaturas usado fue de 30-70C ; ya a 40C puede observarse claramente una disminución preferencial de la absorción a 566nm. El cambio de temperatura(15) produce una relajación de las interacciones, i.e. los puentes hidrógeno y los puentes salinos. Un aspecto importante es que el aumento de la entropía producida por la libertad de las moléculas de agua hace que la proteína se comporte como si el medio ambiente se hiciese mas hidrofóbico. La urea(16), como agente caotrópico debería producir un efecto similar y en efecto, esto es lo que se produce y la expansión observada parece razonable.

Fig. 2. Espectros de absorción de R-ficoeritrina registrados después de una incubación de 24h a temperatura ambiente a las concentraciones de urea que se indican. Los máximos de absorción corresponden a 495nm (cromóforo ficourobilina), 550nm (cromóforo ficoeritrobilina) y 566 (R-ficoeritrina).

Fig. 3. Espectros de absorción de R-ficoeritrina registrados después de una incubación de 10min a la temperatura que se indica. La explicación de los máximos en la Figura 2.

Alteraciones en la fuerza iónica producen cambios en el estado de asociación de los heterohexámeros pero en ninguna de las observaciones realizadas comprobamos su disociación ; estos últimos resultados se muestran en la Tabla I. Se probó 3 valores diferentes de m, y se observó que a baja fuerza iónica aparece como especie predominante (ab)12 y a fuerzas iónicas mayores se observa nuevamente el heterohexámero como especie predominante. A m mayores la proteína precipita. De este modo, el efecto se observa principalmente en la asociación de las unidades funcionales (ab)6 y no en las interacciones entre las subunidades de ésta. Los estudios de organización de la antena por asociación entre las diferentes ficobiliproteínas están actualmente en ejecución.

Tabla I. Efecto de la fuerza iónica sobre el estado de asociación (EA) de R-ficoeritrina .


m(M) Mw   EA

0.138 390000   ((ab)6)2
  68000   (ab)2
0.550 209900   (ab)6
  33500   (ab)
1.650 213500   (ab)6
  33200   (ab)

Para analizar el comportamiento de esta proteína en solución, se estudiaron las superficies de interacción entre las subunidades que forman esta unidad funcional. Los datos se presentan en la Tabla II. En Figura 1 se definen tres tipos diferentes de superficies de interacción: S , corresponde a la superficie de interacción entre las subunidades a y b ; HD , corresponde a la superficie de interacción entre una unidad ab superior y una inferior, y HT: corresponde a la superficie de interacción lateral entre dos unidades (ab)2. El análisis revela que una parte importante de la responsabilidad sobre la estabilidad del heterodímero recae sobre las interacciones hidrofóbicas, ya que cuando se asocia una subunidad a con una subunidad b ,el 64,79% de la superficie internalizada corresponde a ámino ácidos hidrofóbicos, y a la existencia de 14 puentes H entre ambas. Esto hace que la disociación de esta unidad mínima sea altamente improbable. Además, al considerar esta superficie, resulta interesante notar que 9 ámino ácidos se internalizan entre un 30 y un 50%, y uno de ellos es un ámino ácido cargado(aD13 ) que es responsable de 4 de los puente H que se forman. Es posible observar además, que bCYE2 se internaliza un 30 %. Si se analiza la superficie HD se observa que la nueva superficie hidrofóbica internalizada corresponde solamente a 305.2 Å2 , un 10,26% de la superficie internalizada, y se forman 7 nuevos puente H cuando se produce la asociación. Esta interacción hace que bCYE2 aumenta su internalización en un 11.8% y que el ámino ácido aE25, se internalice contribuyendo a la formación de 3 nuevos puentes H. La superficie hidrofóbica de interacción HT corresponde a un 3.5% de la superficie total con posibilidades de interacción, y se forman 9 puentes H .Para la formación del heterohexámero se internalizan 35958 Å2 (un 30% de la superficie total del héterohexamero),en que 23875 Å2. corresponden a ámino ácidos hidrofóbicos. Cuando se produce este tipo de empaquetamiento aCYE1 aumenta su internalización en un 18.6%. Las propiedades espectroscópicas coinciden con la alteración del ambiente de este cromóforo en particular como se muestra en las Figuras 2 y 3. Esto revela el estricto empaquetamiento que debe presentar este sistema para que la luz sea conducida eficientemente, y que se reproduce en las diferentes ficobiliproteínas cuya estructura se conoce.( 17).

Tabla II.Superficies(1) de Interacción en R-ficoeritrina.

 

Area superficial accesible de subunidad a : 9870 Å2
Area superficial accesible de subunidad b : 10430 Å2
S = Area superficial internalizada al formar (ab): 2991 Å2 (14.73%)
Area superficial hidrofóbica(2) internalizada al formar (ab): 1937.9 Å2 (9.53%)
Area superficial accesible por unidad (ab): 17257 Å2
HD = Area superficial(3) internalizada al formar (ab)2 : 2973 Å2 (8.6%)
Area superficial hidrofóbica(2) internalizada al formar (ab)2: 305.2 Å2 (0.88%)
Area superficial accesible por unidad (ab)2 : 31576 Å2
HT = Area superficial internalizada al formar (ab)2(ab)2: 3031 Å2 (9.5%)
Area superficial hidrofóbica(2) internalizada al formar (ab)2(ab)2: 1109.5 Å2(3.5%)
 

(1) La superficie accesible fue calculada a partir de las coordenadas atómicas de R-ficoeritrina obtenidas en nuestro laboratorio (11), utilizando el Programa MolMol 2.6(12) con una esfera de interacción de 1.4 Å
(2)Se consideraron los áminoácidos A, L, I, V, M, P, F, Y, W.
(3)Para el cálculo del porcentaje se utilizó la superficie correspondiente a 34514 Å2

 

 

 

 

 

 


 

 

 

 

La disociación de las subunidades a y b resulta extremadamente cara energéticamente, sin embargo la exposición de las superficies HD y HT resulta más favorable, porque en la superficie internalizada se encuentran menos ámino ácidos hidrofóbicos y porque los ´que más lo hacen son ámino ácidos polares o cargados( para HD, aE25; para HT, bN76, aR118, y aR114) que no contribuyen a la formación de nuevas interacciones. Es probable que interaccionen a través de moléculas de agua para su estabilización en el interior de la proteína sin embargo los estudios cristalográficos no lo indican. Durante el estudio del proceso de oligomerización de esta proteína, realizado en nuestro laboratorio(13), sólo se detectó las especies (ab) y (abb)6; ésto se explica ahora, por las características de las superficies de interacción.

Para la estabilización de (ab)6 se requiere de la contribución de todas las subunidades (ab) y para su perfecto ensamblaje se requiere además la presencia de polipéptidos de unión o "linkers" cuya función particular está en estudio(18) . Si (ab)6 comienza a disociarse, lo hará rápidamente hasta las unidades básicas (ab).

AGRADECIMIENTOS

Este trabajo fue realizado en el marco de los proyectos : DIUC Universidad de Concepción N 973172-1 y ECOS-CONICYT PC96B02.

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