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Boletín de la Sociedad Chilena de Química

versión impresa ISSN 0366-1644

Bol. Soc. Chil. Quím. v.45 n.2 Concepción jun. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0366-16442000000200006 

COMPOSICION DEL ACEITE ESENCIAL Y ACTIVIDAD
ANTIMICROBIANA DE EUPATORIUM PATENS

PEDRO N. BAILAC1, ALEJANDRO D. DELLACASA1*, HUGO O. BERNASCONI1, NORBERTO H. FIRPO2 Y MARTA I. PONZI1

1Area de Química y Area de Procesos Químicos, Facultad de Ingeniería y Ciencias Económico Sociales, Universidad Nacional de San Luis, INTEQUI-CONICET, Av. 25 de Mayo 384, 5730 Villa Mercedes, San Luis, Argentina.
2CINDECA-CONICET. Calle 47 N 257, 1900 La Plata, Bs. As., Argentina
(Recibido: Diciembre 2, 1999 - Aceptado: Enero 27, 2000)

En memoria del Doctor Guido S. Canessa C.

RESUMEN

El estudio del aceite esencial de Eupatorium patens por cromatografía gaseosa, espectrometría de masas e índices de retención, determinó que los principales componentes son: (E)-cariofileno (14,15%), g-muuroleno (13,47%), a-pineno (11,11%). El análisis de las propiedades antimirobianas resultó positivo frente a Bacillus subtillis.

PALABRAS CLAVES: Aceite esencial, Eupatorium patens, actividad antibacteriana.

ABSTRACT

The study of Eupatorium patens essential oil by gas chromatography, mass spectrometry and retention index determined that the main compounds were: (E)-caryophyllene (14.15%), g-muurolene (13.47%), a-pinene (11.11%). Analysis to determine their antimicrobial activities, showed positive activity against Bacillus subtillis.

KEY WORDS: Essential oil, Eupatorium patens, antimicrobial activity.

INTRODUCCION

La especie Eupatorium patens Don ex Hooker et Arnott (Compositae), es un arbusto densamente ramoso, con tallos débiles, semiapoyantes o rastreros, frecuente en el Dominio Chaqueño, desde Bolivia y Paraguay hasta la Patagonia1). En la zona de recolección (provincia de San Luis, Argentina) es conocida con el nombre vulgar de "acancio".

Las especies aromáticas silvestres, de acuerdo al lugar o zona ecológica de recolección, pueden presentar considerables diferencias en la composición del aceite esencial (AE) y por lo tanto variar su potencial utilización como productos naturales. Algunos AE presentan actividad biológica2), no contaminando con su uso al medio ambiente. No se han publicado trabajos determinando la composición del AE de E. patens.

Con el objeto de conocer la composición química del AE y su eventual relación con la bioactividad, es que se estudió el AE de E. patens.

En el presente trabajo se describen el aislamiento y caracterización de los componentes del AE de E. patens así como el estudio de la actividad antimicrobiana frente a Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtillis, Candida albicans y Aspergillius niger.

PARTE EXPERIMENTAL

El material vegetal objeto de este estudio proviene de la localidad de Luján, provincia de San Luis, Argentina y fue recolectado en abril de 1998. Un ejemplar del mismo se encuentra depositado en el Herbario de la Facultad de Ciencias Química, Cátedra Botánica, Universidad Nacional de Córdoba.

Para la extracción del AE de E. patens se usaron 382 g de hojas oreadas (4 días), se sometieron a hidrodestilación durante 4 horas y se recogió el aceite de color amarillo pálido en una trampa tipo Clevenger. El AE fue deshidratado con sulfato de sodio anhidro, filtrado y almacenado a baja temperatura.

Los componentes del AE se determinaron por cromatografía gaseosa, por cromatografía gaseosa con detector de masas y por índices de retención.

CG: se utilizó un cromatógrafo gaseoso marca SHIMADZU MODELO GC-17A, con detector FID y una columna capilar no polar de metilsilicona DB-1 (J&W Scientific) de 60 m por 0,25 mm y 0,25 µm de espesor de film. Se usó el siguiente programa de temperatura: 60°C (5 min), 60-220°C (3°C/min) y 220°C (22 min), como gas portador se utilizó nitrógeno (0,9 ml/min); temperatura del inyector: 230°C; temperatura del detector: 250°C.

CG/EM: los espectros de masa se obtuvieron en un cromatógrafo de gases Perkin Elmer Autosystem con espectrómetro de masas tipo cuadrupolo Q. Mass 910. Se utilizó una columna capilar de sílice fundida de 30 m por 0,32 mm, marca Supelco SPB-1. La temperatura de columna se programó a 60°C (5 min), 60-220°C (3°C/min) y 220°C (8 min), se utilizó como gas portador helio (1 ml/min); temperatura del inyector y detector: 250°C. Startig mass 45, voltaje de ionización 70eV.

Los componentes del A.E. de E. patens se identificaron por índices de retención relativos (IR) a una serie homóloga de ésteres metílicos de ácidos grasos (C4-C20), y por índices de Kovats (IK) para una columna capilar no polar3) y se los comparó con los espectros de masa almacenados en bancos de datos4-6).

Las propiedades antimicrobianas del AE fueron ensayadas frente a los siguientes microorganismos: Staphylococcus aureus (ATCC 25923), Escherichia coli (ATCC 35218), Bacillus subtillis (ATCC 6633), Candida albicans (ATCC 10231) y Aspergillus niger (ATCC 9276).

Como medio de cultivo se utilizó agar nutritivo para bacterias7) y agar glucosa 4% SABOURAUD (reactivo para diagnóstico Merck) para hongos.

Con el objeto de determinar la actividad antibacteriana del AE8), se desarrollaron pruebas que utilizan una fase sólida de agar nutritivo, usando cajas de Petri estériles de 9 cm de diámetro.

Aplicando el método de dilución de agar9,10), 5 µl de AE se mezclaron con 25 ml de medio agar nutritivo estéril. Esta mezcla se agitó por dos minutos utilizando un vortex a 3000 rpm para ser homogeneizada.

Se prepararon mezclas cuyas concentraciones finales de AE en medio de cultivo corresponden a: 1/125, 1/250, 1/500, 1/1000 y 1/2000 v/v; 25 ml de cada una de estas mezclas se transfirieron a cajas de Petri estériles y a continuación se enfriaron hasta su solidificación.

El medio de cultivo fue inoculado con células de bacterias (106 células de bacterias/ml). La actividad antibacteriana se estimó después de que el medio fue incubado por 24 horas a 37°C.

Las pruebas se repitieron tres veces y los controles consistieron en la inoculación de las bacterias en agar nutritivo sin AE.

Con el objeto de estudiar el efecto del agregado de un solvente, se desarrollaron pruebas combinando el AE con dimetilsulfóxido (DMSO) (1:20 v/v aceite:DMSO) y diluyendo con agua antes de adicionar los cultivos. Una alícuota de esta dilución se mezcló con agar nutritivo estéril fundido. Los cultivos de bacterias se inocularon en cajas de Petri. El rango de concentraciones finales se modificó entre 1/125 y 1/2000 v/v solución/medio.

Se establecieron además los controles H2O:DMSO (1:10 y 1:40 v/v) como blanco. En los microorganismos probados, el DMSO no mostró toxicidad bajo las mencionadas condiciones experimentales.

Para determinar la actividad antifúngica del AE, se utilizó agar glucosa 4% SABOURAUD (reactivo para diagnóstico Merck), 25 ml de este medio de cultivo fundido se colocó en cada caja de Petri y a continuación se enfrió hasta 45°C, usando suspensiones de microorganismos cuya concentración fue 106 levaduras/ml o conidias/ml, el medio se inoculó con Candida albicans y Aspergillus niger. Se utilizó el método de difusión de agar con discos de papel11-13), 5 µl del AE se utilizaron para impregnar discos de papel de filtro de 6 mm de diámetro. Cada disco fue impregnado con el AE bajo condiciones estériles y fue colocado sobre el agar al que se le había inoculado previamente los hongos, a una distancia tal que 5 o 6 discos, de manera equidistante, fueron ubicados en cada placa. Además en la misma placa se ubicaron, para cada prueba, discos de control con ketoconazol (concentración: 1 mg/ml) y discos como blancos con solvente puro (DMSO). Las placas de cultivos fueron incubadas por 72 horas a 28°C. Finalmente se realizó la lectura e interpretación de los resultados y se se determinó la actividad antifúngica del AE.

RESULTADOS Y DISCUSION

Los componentes del AE de E. patens se muestran en la Tabla I, representan el 93,62% del AE estudiado. Se observa que en los compuestos identificados: 28,25% corresponden a hidrocarburos monoterpénicos, 0,73% a monoterpenos oxigenados, 50,65% a hidrocarburos sesquiterpénicos y 6,15% a sesquiterpenos oxigenados. De los compuestos no identificados por bibliografía4-6) se infiere a través de la determinación de índices de Kovats que 4,04% corresponden a hidrocarburos sesquiterpénicos y 3,80% a sesquiterpenos oxigenados.

TABLA I. Composición del aceite esencial de Eupatorium patens.

 


Compuesto*

IK** IR*** Area %

a-tuyeno

932 248 3,55
a-pineno 942 251 11,11
Sabineno 972 260 1,55
b-pineno 977 262 2,81
b-mirceno 983 264 0,64
d-2-careno 1013 272 0,17
Orto-cimeno 1016 273 0,24
Limoneno 1028 276 2,46
(Z)-b-ocimeno 1045 280 5,51
g-terpineno 1059 284 0,21
Perileno 1115 300 0,53
Terpinen-4-ol 1171 330 0,20
d-elemeno 1347 418 3,92
b-elemeno 1392 444 1,35
(Z)-a-bergamoteno 1418 457 0,32
a-santaleno 1428 461 5,69
(E)-cariofileno 1434 464 14,15
g-elemeno 1440 466 0,66
No identificado1 1449 470 0,72
Epi-b-santaleno 1453 472 0,49
a-humuleno 1466 478 0,72
g-muuroleno 1496 492 13,47
Biciclogermacreno 1512 499 7,64
g-cadineno 1517 500 0,25
No identificado2 1523 504 3,32
d-cadineno 1528 507 1,15
(E,E)-a-farneseno 1533 510 0,35
a-cadineno 1544 516 0,49
(E)-nerolidol 1555 522 0,34
No identificado3 1567 528 2,57
No identificado4 1579 534 0,90
Espatulenol 1581 536 0,98
Oxido de cariofileno 1589 540 1,86
No identificado5 1624 557 0,33
Epi-a-muurolol 1634 562 0,40
Cubenol 1637 564 0,67
a-muurolol 1644 568 0,74
a-cadinol 1651 571 1,16

*Compuestos ordenados de acuerdo al tiempo de elución para una columna no polar DB-1.
**IK: Indices de Kovats.
***IR: Indices de retención relativos.
1No identificado-EM m/z (rel. int. %): 205 [M]+ (0,6), 204 (3,7), 105 (22,9), 93 (19,3), 69 (19,7), 55 (19,5), 41 (100).
2No identificado-EM (rel. int. %): 220 [M]+ (0,2), 121 (100), 93 (79,5), 91 (20,6), 43 (57,7), 41 (100).
3No identificado-EM (rel. int. %): 220 [M]+ (0,1), 202 (49,3), 159 (68,9), 131 (41,9), 91 (39,6), 41 (100).
4No identificado-EM (rel. int. %): 220 [M]+ (0,2), 202 (7,3), 121 (50,0), 93 (66,6), 85 (69,0), 43 (51,4), 41 (100).
5No identificado-EM (rel. int. %): 222 [M]+ (0,4), 204 (81), 161 (26,3), 105 (19,3), 81 (38,0), 55 (25,4), 43 (100).

El rendimiento del AE fue de 0,52% (V/P) sobre material oreado.

Se encontró que el AE sólo tiene actividad antimicrobiana frente a Bacillus subtillis.

Los bioensayos realizados con los organismos probados frente al AE mostraron:

1. En Bacillus subtillis: inoculando 106 células de bacterias/ml, después de que el medio fue incubado por 24 horas a 37°C, se observó actividad antibacteriana para todas las concentraciones finales de AE en medio de cultivo hasta 1/2000 v/v.

2. En Escherichia coli y Staphilococcus aureus: no mostró actividad antibacteriana.

3. En Aspergillius niger y Candida albicans: no mostró actividad antifúngica. Los resultados obtenidos mostraron que el AE provocó un retardo en el crecimiento de estos microorganismos por 24 horas a partir de la inoculación.

Intentando correlacionar la composición química del AE con la actividad antimicrobiana del mismo, se observó en un estudio previo14), actividad en el AE que contenía un alto porcentaje de terpenos oxigenados (71,5%). Analizando, además, otras publicaciones que relacionan la composición química del AE con su actividad antimicrobiana15,16), se puede inferir que la presencia de estos terpenos oxigenados serían los responsables de dicha actividad. En el presente trabajo se observa escasa actividad antimicrobiana y un porcentaje de sólo un 6,88% de terpenos oxigenados conocidos, de la cual se puede reafirmar lo expresado anteriormente.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen al Dr. L. Ariza Espinar, Departamento de Farmacia, Facultad de Ciencias Químicas, Universidad de Córdoba, Argentina, por la determinación del material vegetal y a la Dra. Susana Zacchino, Area de Farmacognosia, Universidad Nacional de Rosario, Argentina, por el suministro de cepas ATCC.

Este trabajo fue posible realizarlo por el aporte financiero provisto por la UNSL, INTEQUI y CONICET.

*A quien debe ser dirigida la correspondencia (delale@fices.unsl.edu.ar)

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