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Boletín de la Sociedad Chilena de Química

versión impresa ISSN 0366-1644

Bol. Soc. Chil. Quím. v.44 n.3 Concepción set. 1999

http://dx.doi.org/10.4067/S0366-16441999000300007 

DETERMINACION SIMULTANEA DE SEIS HIDROCARBUROS
POLICICLICOS AROMATICOS EN MEDIO MICELAR POR
REGRESION DE MINIMOS CUADRADOS PARCIALES (PLS-1) 
UTILIZANDO ESPECTROS DE FLUORESCENCIA DE ANGULO
VARIABLE LINEAL

J. AMADOR-HERNANDEZ1, L. LOPEZ-MARTINEZ1, P.L. LOPEZ-DE-ALBA1*,
A. CALDERA2, J.M. ESTELA2, V. CERDA2

1Instituto de Investigaciones Científicas, Universidad de Guanajuato, 36000 México.
2Departamento de Química, Universitat de les Illes Balears, E-07071, España
(Received: October 5, 1998 - Accepted: June 11, 1999)

RESUMEN

En este trabajo, se presenta la determinación espectrofuorimétrica simultánea de los hidrocarburos policíclicos aromáticos de interés medioambiental denominados benzo[a]pireno, benzo[e]pireno, benzo[g,h,i]perileno, coroneno, dibenzo[a,h]antraceno e indeno[1,2,3-c,d]pireno en medio micelar, utilizando el surfactante no iónico éter del 10 laurilo polioxietileno (POLE). Con el fin de utilizar las señales de mayor sensibilidad para la determinación de cada uno de los compuestos en la mezcla, se registraron los espectros por fluorescencia de ángulo variable lineal. Debido al gran solapamiento espectral observado, la resolución del sistema multicomponente se efectuó aplicando el algoritmo de calibración multivariante conocido como Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales tipo 1 (PLS-1). Se aplicaron diferentes criterios para la selección del número de factores óptimo para el modelo de calibración. Los resultados obtenidos tanto en mezclas sintéticas como en muestras de agua de dos orígenes distintos contaminados con cantidades conocidas de los hidrocarburos de interés fueron satisfactorios.

PALABRAS CLAVES: Fluorimetría, PAH's, análisis multicomponente, PLS

ABSTRACT

The multivariate calibration method partial least squares regression type 1 (PLS-1) was applied to the simultaneous spectrofluorimetric determination of aromatic polycyclic hydrocarbons of environmental interest, namely benzo[a]pyrene, benzo[e]pyrene, benzo[g,h,i]perylene, coronene, dibenzo[a,h]antrhracene and indeno[1,2,3-c,d]pyrene in micellar medium by using the non ionic surfactant polyethylene ether (POLE). In order to employ the highest sensitivity signals for the determination of each of the compounds in the mixture, the corresponding linear variable angle fluorescence spectra were recorded. Several data characteristic are taken into account in order to minimize the optimum number of factors required for the construction of calibration model while using various statisticial criteria of selection. The statistical parameters obtained by internal and external validation of the optimum calibration model were in agreement, with satisfactory results. The results obtained in both synthetic mixtures and in water samples of two different origins spiked with known quantities of hydrocarbons of interest are satisfactory.

KEY WORDS: Fluorimetry, PAH's, multicomponent analysis, PLS.
 
 

INTRODUCCION

Desde el descubrimiento de su poder cancerígeno, los hidrocarburos policíclicos aromáticos (PAH's) han sido estudiados con gran interés en numerosas ocasiones1-3). Debido a su formación durante la combustión incompleta o pirólisis de materia orgánica común en diversos procesos naturales o antropogénicos, estos compuestos se encuentran presentes en el aire, suelo y agua en diversas cantidades; por ello, organismos internacionales tales como la Organización Mundial de la Salud y la Agencia de Protección Ambiental (EPA) han regulado el control de estas sustancias en el medio ambiente.

Por otro lado, entre las técnicas instrumentales de análisis más utilizadas para su determinación se encuentran la Cromatografía de Gases (GC) y la Cromatografía de Líquidos de Alta Resolución (HPLC)4-6), así como la espectrofotometría de absorción UV-Visible y la espectrofluorimetría3,7), aún cuando las técnicas espectroscópicas convencionales requieren de procesos de separación previos por las grandes interferencias espectrales presentes. Desde que fue descrita por primera vez por Lloyd8), la fluorescencia sincrónica se ha convertido en una herramienta de gran sensibilidad y determinación simultánea de diversos PAH's 9). No obstante, el gran solapamiento espectral existente entre algunos de estos hidrocarburos no puede eliminarse a través de esta técnica y es necesario recurrir a otras alternativas.

Durante los últimos años, la introducción en los laboratorios de computadores personales (PC's) ha permitido la automatización de diversas técnicas instrumentales. Así, a través del desarrollo del software adecuado en fluorescencia es posible el registro rápido y simple de espectros de ángulo variable sin modificación del hardware, incrementando con ello las posibilidades de aplicación de la propia técnica10). Por otro lado, el desarrollo del software especializado en técnicas quimiométricas permite actualmente la aplicación de poderosos algoritmos matemáticos para la resolución de sistemas químicos complejos, utilizando múltiples señales analíticas, que debido a las interferencias presentes en la determinación, desviaciones de la linealidad, ruido, etc., no es posible resolver directamente11,12). Entre estos algoritmos se encuentran la Regresión Lineal Múltiple (MLR), la Regresión por Componentes Principales (PCR), la Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales (PLS) y las Redes Neuronales Artificiales, por citar algunos13,15). Así la fluorescencia de ángulo variable en combinación con técnicas quimiométricas de análisis multicomponente ha permitido el desarrollo de métodos analíticos sensibles y selectivos para la determinación simultánea de mezclas de PAH's con resultados satisfactorios, sin recurrir a procesos de separación previos16).

Sin embargo, actualmente se reconoce que las características luminiscentes de varios compuestos cambian considerablemente en presencia de surfactantes iónicos o no iónicos en relación al medio acuoso, dando lugar a variaciones en los espectros de excitación y emisión, incremento de la intensidad de fluorescencia, efectos quenching, entre otros17). Así, a través de la explotación adecuada de los fenómenos fotofísicos y/o fotoquímicos presentes en sistemas micelares es posible el desarrollo de métodos fluorimétricos, fosforimétricos y quimioluminiscentes más sensibles y/o selectivos18).

En este trabajo, se describe la puesta a punto de la metodología analítica de un nuevo método espectroscópico por fluorescencia de ángulo variable lineal para la determinación simultánea de seis PAH's de interés medioambiental en medio micelar generado por el surfactante no iónico, éter del 10 laurilo polioxietileno (POLE), cuyas interferencias espectrales entre las señales analíticas de los seis PAH's son resueltas a través de la aplicación del algoritmo matemático de la calibración multivariante, Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales tipo 1 (PLS-1) utilizando el criterio de selección de regiones espectrales para su resolución.

PARTE EXPERIMENTAL

Aparatos

Para este estudio se utilizó un Espectrómetro de Luminiscencia Perkin Elmer LS-5, provisto de una lámpara de descarga pulsada (9,9 W), celda de cuarzo de 1 x 1 cm. El equipo está conectado a través de una interfase serial RS232C a una computadora PC para el control del instrumento y la adquisición

de datos, la representación y el almacenamiento de los datos se realiza con ayuda del programa de cómputo "FLUORPACK", previamente descrito por los autores10). También fue utilizado un baño ultrasónico "P Selecta". El programa de cómputo utilizado para los tratamientos matemáticos fue el GRAMS/32tm v.5 de Galactic Co., en Salem, N.H., EUA.

Reactivos

Los hidrocarburos aromátiocos policíclicos benzo[a]pireno (BAP); benzo[e]pireno (BEP); benzo[g,h,i]perileno (BGP); coroneno (COR); dibenzo[a,h]antraceno (DBA) y indeno[1,2,3-c,d]pireno (IND) fueron suministrados por "Sugelbor, S.A.", España. El surfactante éter del 10 laurilo polioxietileno (POLE), reactivo de Sigma (EUA) y el metanol Promochem (Alemania). El agua utilizada fue purificada con un sistema Milli Q (Millipore, Bedford, EUA).

La disolución acuosa estándar de POLE utilizada en el estudio fue 2,5x10-2 M. Se prepararon disoluciones estándar de los hidrocarburos BAP (20 mg/L), BEP (20 mg/L), BGP (10 mg/L), COR (10 mg/L), DBA (20 mg/L) y IND (20 mg/L), disolviendo en metanol cantidades exactamente pesadas de los reactivos puros grado analítico. Estas fueron almacenadas en refrigeración a 4°C. Las disoluciones de trabajo fueron preparadas diariamente por una dilución apropiada de las disoluciones estándar.

Procedimiento

En matraces aforados de 25 mL, se adicionaron volúmenes adecuados de las disoluciones de trabajo de los PAH's para obtener concentraciones finales de 0,3 a 16 µg·L-1 de BAP, 2 a 110 µg·L-1 de BEP, 1 a 45 µg·L-1 de BGP, 0,5 a 27 µg·L-1 de COR, 0,5 a 29 µg·L-1 de DBA y 1,6 a 106 µg·L-1 de IND, 2,5 mL de disolución de POLE 2,5x10-2 M, metanol hasta obtener una concentración final del 5% y agua hasta el aforo. Los espectros de ángulo variable lineal se registraron por dos rutas propuestas (A y B) con una resolución de 1 nm, manteniendo el ancho de las rendijas de excitación y emisión en 5 y 10 nm, respectivamente.

Fundamentos de la calibración multivariante
Introducción a la calibración multivariante

La calibración multivariante comprende una serie de técnicas matemáticas que constituyen una herramienta de reconocida selectividad y confiabilidad en el análisis cuantitativo multicomponente, aplicable en la determinación de micro y/o macrocomponentes en muestras complejas de distinta naturaleza y bajo diversas técnicas instrumentales de análisis(Espectroscopía UV-Visible, Cromatografía de Gases, Resonancia Magnética Nuclear, Electroforesis, Espectroscopía de Masas, etc.). Entre las principales ventajas que ofrece están la simplificación en la preparación de las muestras reales e incremento en la capacidad analítica y confiabilidad de los instrumentos tradicionales.

El nombre de calibración multivariante se deriva del siguiente hecho: puede decirse que calibrar consiste en usar datos empíricos y conocimientos previos para establecer cómo predecir cuantitativamente información desconocida Y (variable dependiente) a partir de mediciones disponibles X (variable independiente), a través de alguna función matemática de transformación. La calibración multivariante significa entonces utilizar simultáneamente numerosas variables X (x1, x2, ..., xk) para determinar cierta(s) variable(s) Y. Como su propósito fundamental en Química Analítica es establecer la fórmula de predicción Y = f(X), se asume que X corresponde a las mediciones instrumentales e Y a la cantidad de analito(s); por ejemplo, X pueden ser mediciones cromatográficas o espectroscópicas e Y la concentración de una especie a determinar.

Para predecir la información Y a partir de X debe identificarse la fórmula de predicción Y = f(X) que describa el modelo de calibración del sistema en estudio, a través de alguno de los distintos métodos de calibración multivariante existentes. El análisis de sistemas complejos requiere una estimación estadística de los parámetros del modelo de calibración basándose en muestras representativas del sistema con el fin de optimizar la calidad del trabajo analítico.

Uno de los principales problemas que se enfrentan en el análisis químico instrumental son las interferencias, cuyo término se aplica a cualquier efecto en la señal analítica causada por fenómenos físicos o químicos ajenos al de interés.

Las interferencias químicas son errores sistemáticos causados por ciertas sustancias cuya presencia cambia la señal analítica, o bien, interaccionan con los analitos modificando su respuesta frente al instrumento. La mayoría de las muestras (fundamentalmente las de tipo biológico) son mezclas de numerosos componentes, muchos de los cuales son lo suficientemente similares para afectar la señal por lo que es difícil obtener mediciones suficientemente selectivas para el analito, en cuyo caso se recurre normalmente a procesos de separación; sin embargo, la calibración multivariante permite analizar sistemas con interferencias químicas (aún cuando se desconozcan) sin necesidad de manipular excesivamente la muestra.

Por otro lado, ciertos fenómenos físicos aparentemente irrelevantes pueden afectar seriamente la señal de medición (interferencias físicas), siendo necesario mantener constantes sus efectos o compensarlos matemáticamente. Además, la variación de ciertos parámetros como son temperatura, precisión, pH, etc., pueden provocar grandes errores en las mediciones. No obstante, con calibración multivariante es posible eliminar fácilmente cada uno de estos problemas.

Finalmente, debe considerarse que en el momento de efectuar la calibración existen anomalías en la preparación de las muestras o variaciones instrumentales (sin importar qué tan cuidadoso sea el analista) que la calibración multivariante identifica como datos anormales, siendo posible eliminarlos y evitar en un futuro errores mayores en el modelo de calibración estimado.

Así, la calibración multivariante es una herramienta quimiométrica que establece un modelo matemático multivariante del sistema en estudio, donde los parámetros de calibración se derivan de cálculos estadísticos a partir de datos empíricos.

Modelos de calibración lineales

En el caso más simple, el modelo de calibración de un sistema químico es caracterizado por una variable x (señal analítica) relacionada linealmente con una variable "y" (cantidad del analito) a través de la expresión:

y = b0 + b1x + f

(1.1)
donde los parámetros de regresión (b0, b1) y el residuo (f = y-y= yreal - yestimada) son cantidades desconocidas.

Sin embargo, la estimación correcta de los parámetros b0 y b1 requiere el manejo estadístico de los datos de calibración (xi, yi) de i = 1,2, ..., I muestras independientes:

yi = b0 + b1x1 + fI

y2 = b0 + b1x2 + f2

.

. ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ (1.2)

.

yi = b0 + b1xi + fi

de los cuales se desprenden los siguientes vectores y matrices:

· Vector de variables dependientes:
· Vector de parámetros de regresión:
· Vector de residuos:
· Matriz de variables independientes:

En notación matricial, las expresiones (1.2) pueden reescribirse como:

y = Xb + f

(1.3)

En algunos casos, sin embargo, una sola variable "x" no es suficiente para predecir "y" (falta de selectividad), ya sea porque "y" comprende varios fenómenos representados por distintas variables "x", o bien, la señal analítica es influenciada por diversos interferentes presentes en el sistema además del analito.

Para evitar esto, el modelo de calibración puede expresarse en función de "k" variables independientes por cada variable "y":

y = b0 + b1x1 + b2x2 + ... + bkxk + f

(1.4)

cuya notación matricial para "i" muestras tiene la misma forma que (1.3), pero con distintas dimensiones en b y X.

En general, para un sistema de "j" componentes en función de "k" variables independientes en "i" muestras, el modelo de calibración es:

Y = XB + F

(1.5)
donde

Y = {yij; i = 1, 2, ..., I; j = 1, 2, ..., J}
= variables dependientes j = 1, 2, ..., J en las muestras i = 1, 2, ..., I
X = {xik; i = 1, 2, ..., I; k = 1, 2, ..., K}
= variables independientes k = 1, 2, ..., K en las muestras i = 1, 2, ..., I
B = {bkj; k = 1, 2, ..., K; 1, 2, ..., I)
F = {fij; i = 1, 2, ..., I; j = 1, 2, ..., J)

En este modelo, sin embargo, surge el inconveniente de la posible colinealidad en la información contenida en X, la cual impide la aplicación de métodos donde se asume que cada variable "x" arroja información única acerca de cada variable "y, como es el caso de la Regresión Lineal Múltiple (MLR, Multiple Linear Regression). Es por ello que se requieren métodos en los cuales la información relevante contenida en X sea expresada por nuevas variables que constituyan el modelo de calibración.

Compresión de datos en modelos de calibración lineales

Por compresión de los datos se entiende la concentración de la información contenida en K variables independientes x' (x1, x2, ..., xk) en unas cuantas variables llamadas componentes principales,factores, o scores (t1, t2, ..., tA) (A ? K):

(t1, t2, ..., tA)' = f1[x1, x2, ..., xk)']

(1.6)

Estos nuevos factores se usan como regresores en la ecuación de predicción del sistema con "j" componentes:

(y1, y2, ..., yj)' = f2[(t1, t2, ..., tA)'] + f

(1.7)

lo cual simplifica los cálculos estadísticos al reducir el número de parámetros del modelo de calibración.

En notación matricial, el nuevo modelo de calibración corresponde a:

X = TP' + E
T = XV ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------- (1.8)

Y = TQ' + F

donde ' es el símbolo de trasposición, P es la matriz "loading" que representa los coeficientes de regresión de X en T al igual que Q representa los coeficientes de regresión de Y en T; los residuos E y F representan la variación en X y Y no explicada por la nueva estructura de A factores, cuyo origen puede ser ruido en las mediciones, errores del operador, desviaciones de la linealidad de los datos, etc., mientras que la variable V será definida más adelante.

Así, el cálculo de los parámetros de regresión B involucra las nuevas variables establecidas:

Y = Ib0' + XB
B = VQ' ---------------------------------------------------------------------------------------------------------------- (1.9)

b0' = y' + x'

Dentro de calibración multivariante existen distintos métodos que integran a sus algoritmos los componentes principales T. En este escrito, se hará referencia a aquéllos que estiman V a partir de los datos de calibración: los métodos de Regresión del Componente Principal (PCR) y Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales (PLS).

La principal diferencia entre PCR y PLS radica en la propia definición de V. En PCR, V es igual a P y se estima a partir de X; Y tan sólo se utiliza en la regresión final para establecer cuántos componentes principales definirán el modelo de calibración del sistema. Por el contrario, en PLS X y Y se utilizan simultáneamente en la estimación de V (integrada por P y W), con el fin de asegurar que los A factores resuman en conjunto la información de X relevante en el cálculo de Y (Figura 1).

 

FIG. 1. PCR y PLS: dos métodos basados en la compresión de los datos. En PCR, las variaciones sistemáticas en X dan lugar a dos factores o componentes principales a partir de los cuales se calculan las variables Y. En PLS, por el contrario, también Y es involucrado en la definición de los factores (flechas punteadas).

 

 

 

 

 

RESULTADOS Y DISCUSION

Con el fin de establecer las condiciones experimentales óptimas para la determinación simultánea de los seis PAH's, se estudiaron diversos factores. De acuerdo con algunos estudios, la intensidad de fluorescencia de varias especies químicas aumenta considerablemente en medio micelar en comparación con un medio acuoso simple, debido a que las micelas protegen el estado singulete excitado de los fluoróforos, por lo que, los procesos radiantes compiten favorablemente con otros procesos de desactivación. En este trabajo, se seleccionó el surfactante no iónico éter del 10 laurilo polioxietileno (POLE) para establecer el medio micelar, ya que éste incrementa en algunos casos considerablemente la señal analítica de los seis hidrocarburos policíclicos en estudio, sin causar interferencias en sus respectivas señales. En la Tabla II, se muestran las relaciones en la intensidad de fluorescencia en medio micelar y acuoso de cada uno de los PAH's a las longitudes de onda de excitación y de emisión, en donde se observa que la máxima intensidad de fluorescencia se obtiene en medio micelar para todos los analitos en estudio.

En segundo término, se estudió el efecto de la concentración de surfactante. De este estudio se seleccionó una concentración final 2,5 mM de POLE superior a su concentración micelar crítica, observándose que a mayores concentraciones de éste, no causan cambios en la intensidad de fluorescencia de los seis hidrocarburos. Posteriormente, se analizó el efecto de la concentración de metanol, seleccionándose como óptima una concentración final del 5%, la cual tiene un efecto despreciable sobre la señal analítica de los analitos en estudio.

Los espectros de fluorescencia total (Matriz Excitación-Emisión, EEM) de los seis PAH's obtenidos en las condiciones experimentales acordes al procedimiento descrito, se muestran en la Figura 2 como mapas de contorno, donde las curvas presentan longitudes de onda de excitación y emisión con señales isoluminiscentes. Como puede observarse, existen grandes interferencias entre las señales analíticas de los analitos y no es posible su determinación simultánea por técnicas fluorimétricas convencionales, incluso utilizando fluorescencia de ángulo variable. Es necesario recurrir a la aplicación de algoritmos matemáticos tales omo regresión lineal múltiple, regresión por mínimos cuadrados parciales, etc. para la resolución satisfactoria del sistema multicomponente.

Espectros de ángulo variable

Con el fin de obtener espectros bidimensionales representativos de los seis hidrocarburos policíclicos aromáticos estudiados y utilizar las señales de mayor sensibilidad para su determinación, se recurrió a la fluorescencia de ángulo variable.

El programa utilizado para el control automático del fluorómetro, así como la adquisición, representación y almacenamiento de los datos experimentales fue el "FLUOROPACK", el cual permite el registro de espectros de ángulo variable de forma directa, rápida y simple sin necesidad de modificar las condiciones de registro del instrumento. Si bien, tales espectros pueden estar definidos por una sucesión de trayectorias lineales, o bien, una trayectoria circular, en este caso en particular se optó por el primer tipo de espectros debido a la localización de los máximos de intensidad de fluorescencia.

Se definieron dos rutas para el registro de los espectros de ángulo variable lineal: la ruta A, con cinco trayectorias lineales donde los máximos de intensidad de fluorescencia de los seis compuestos se localizan en puntos intermedios de tales trayectorias (374 pares de longitudes de onda excitación-emisión) y la ruta B, con ocho trayectorias lineales, donde los máximos de intensidad de fluorescencia se localizan en las intersecciones (196 pares de longitudes de onda excitación-emisión); las rutas utilizadas se muestran en la Figura 3. Posteriormente, las longitudes de onda de excitación y de emisión se sustituyeron por una serie de números enteros progresivos del 1 al 374 para la ruta A y del 1 al 196 para la ruta B, con el fin de identificar los pares de longitudes de onda de excitación y emisión con números irrepetibles e igualmente espaciados, para la adecuada representación y análisis de espectros bidimensionales. Los espectros de ángulo variable obtenidos por las rutas A y B pertenecientes a los seis hidrocarburos en estudio se representan en las Figuras 4 y 5, respectivamente.

 

FIG. 2. Mapas de contorno de los espectros de fluorescencia total (EEM) de los PAH's bajo estudio: (a) benzo[a]pireno (BAP); (b) benzo[e]pireno (BEP); (c) benzo[g,h,i]perileno (BGP); (d) coroneno (COR); (e) dibenzo[a,h]antraceno (DBA); (f) indeno[1,2,3-c,d]pireno (IND).

 

 

 

 

FIG. 3. Rutas seleccionadas para el registro de los espectros de ángulo variable lineal, representadas en el mapa de contorno correspondientes a una mezcla de los seis hidrocarburos:
(línea contínua) Ruta A, con 374 puntos,
(línea punteada) Ruta B, con 196 puntos.

 

 

FIG. 4. Espectros de ángulo variable lineal registrados a través de la ruta A de los hidrocarburos policíclicos aromáticos de interés, bajo las condiciones experimentales propuestas
(a) benzo[a]pireno (BAP);
(b) benzo[e]pireno (BEP);
(c) benzo[g,h,i]perileno (BGP);
(d) coroneno (COR);
(e) dibenzo[a,h]antraceno (DBA);
(f) indeno[1,2,3-c,d]pireno (IND);

FIG. 5. Espectros de ángulo variable lineal registrados a través de la ruta B, bajo las condiciones experimentales propuestas (a) benzo[a]pireno (BAP);
(b) benzo[e]pireno (BEP);
(c) benzo[g,h,i]perileno (BGP);
(d) coroneno(COR);
(e) dibenzo[a,h]antraceno (DBA);
(f) indeno[1,2,3-c,d]pireno (IND);

Serie de muestras y validación

Para establecer los intervalos de concentración en que serían analizados los compuestos, se utilizó como criterio la relación lineal existente entre la intensidad de fluorescencia localizada a las longitudes de onda de excitación y emisión donde se presenta la máxima señal (Tabla II) y su concentración, siendo estos de 0,3 a 16 µg·L-1 para BAP, de 2 a 110 µg·L-1 para BEP, de 1 a 45 µg·L-1 para BGP, de 0,5 a 27 µg·L-1 para COR, de 0,5 a 29 µg·L-1 para DBA y de 1,6 a 106 µg·L-1 para IND. Sin embargo, no se estudió la linealidd en la región espectral completa o el efecto de filtro interno con el fin de observar la capacidad de respuesta de la calibración por PLS para resolver tales irregularidades en caso de presentarse.

TABLA I. Composición de la serie de muestras de calibración. Todas las concentraciones están dadas en µg·L-1.
 

Muestra
BAP
BEP
BGP
COR
DBA
IND

1
0,3
0
0
0
0
0
2
16
0
0
0
0
0
3
0
2
0
0
0
0
4
0
110
0
0
0
0
5
0
0
1
0
0
0
6
0
0
44,8
0
0
0
7
0
0
0
0,5
0
0
8
0
0
0
27
0
0
9
0
0
0
0
0,5
0
10
0
0
0
0
28,8
0
11
0
0
0
0
0
1,6
12
0
0
0
0
0
90
13
8
0
0
0
0
0
14
0
55,2
0
0
0
0
15
0
0
22,4
0
0
0
16
0
0
0
13,4
0
0
17
0
0
0
0
14,4
0
18
0
0
0
0
0
45
19
6
40
0
0
0
40
20
0
0
19,2
10,8
5,6
0
21
0
110
4,5
0
1,2
0
22
1,4
0
0
0
28,8
9,6
23
0,4
4
1,6
27
0
0
24
0
2,4
2,4
2,4
0
105,6
25
16
0
0
0,7
0,8
6,4
26
0,3
0
44,8
0
1,6
2,2
27
0
64
9,6
6
3,2
16
28
2
12
0
19,2
8
32
29
8,8
8
1,1
1,2
0
60,8
30
0,5
4,8
24
1,8
15,2
0
31
2,8
48
12,8
12
4
25,6
32
10
28
27,2
7,2
2,4
12,8
33
0,8
20
4,8
3,6
17,6
67,2
34
6,4
72
3,2
4,8
7,2
35,2
35
3,6
44
14,4
16,8
4,8
8
36
2,4
10
32
6
9,6
48
37
8
16
3,2
5
11,2
28,8
38
4,4
56
6,4
1,6
10,4
51,2
39
3,2
8
17,6
9,6
19,2
19,2
40
10,8
52
16
5,4
2
9,6
41
3,5
6,4
28,8
12
2,8
36,8
42
4
28
11,2
7,2
7,2
25,6
43
10
10
9,9
10,1
10
10,2
44
1,6
24
6,4
8,4
6,4
70,4
45
1,2
26
8
14,4
13,6
3,2
46
7,2
36
6,7
2,6
6
44,8
47
5,6
33,2
9
4,2
12,8
22,4
48
6,8
14
16
9
14,4
11,5

 

El algoritmo de Regresión por Mínimos Cuadrados Parciales, debido a la complejidad del sistema en estudio, por el número de componentes y solapamiento espectral existente, requiere de un gran número de muestras de calibración para aplicarlo. La composición de la serie de muestras de calibración utilizadas en este trabajo se presenta en la Tabla I , donde pueden observarse muestras con distintas relaciones de concentración y de intensidades de fluorescencia entre los seis componentes del sistema, con el fin de obtener una representación adecuada del sistema.

TABLA II. Relación de la Intensidad de Fluorescencia medio micelar y acouso a las longitudes de onda de excitación y emisión donde se observa la máxima señal en medio micelar, para cada uno de los PAH's (RIF = IF m.micelar/IF m.acuoso).

Compuesto
lexcitación
lemisión
RIF

BAP
264
408
8
BEP
289
392
3
BGP
300
417
20
COR
303
449
6
DBA
298
398
30
IND
256
360
4

Para la validación externa del modelo de calibración, se prepararon diez mezclas sintéticas cuya composición aleatoria dentro de los intervalos de concentración propuestos se muestran en la Tabla III.

TABLA III. Composición de la serie de mezclas sintéticas utilizadas para validar el método propuesto. Todas las concentraciones están dadas en µg·L-1.
 

Muestra
BAP
BEP
BGP
COR
DBA
IND

1
5
11
21
2
11
23
2
5
34
11
3
3
5
3
2
31
13
16
4
24
4
3
23
4
9
10
54
5
5
76
3
6
2
5
6
3
6
7
11
7
38
7
1
46
12
6
9
43
8
5
38
8
0
5
18
9
0
32
26
5
8
0
10
3
0
18
0
0
40

Por otro lado, se calcularon diversos parámetros estadísticos para validar tanto interna como externamente el modelo de calibración. Para la validación interna, se calcularon los parámetros R (R de Pearson), SEC (Error estándar de calibración, "Standard Error of Calibration"), RMSD ("Root Mean Squared Deviation") y REP (Error relativo de predicción, "Relative Error of Prediction") en la serie de muestras de calibración, mientras que para la validación externa se calcularon el porcentaje de recuperación promedio ± la desviación estándar (%R ± SD), SEP (Error estándar de predicción), RMSD y REP en la serie de mezclas sintéticas14). Las ecuaciones de los parámetros estadísticos RMSD, SEC/SEP y REP se describen a continuación:

donde x es la concentración real y xe la concentración estimada de uno de los analitos en una serie de muestras (calibración o validación), x es la concentración real promedio del analito en la misma serie y n corresponde al número de muestras evaluadas.

Una vez seleccionadas las condiciones experimentales y habiendo preparado las muestras correspondientes, se procedió a aplicar el algoritmo de análisis multicomponente PLS-1, el cual permite el análisis de los compuestos que constituyen el sistema de manera independiente, partiendo de la información espectral más relevante. Si bien se considera a priori la relación lineal entre la propiedad analítica de interés (intensidad de fluorescencia) y la concentración de cada uno de los analitos del sistema multicomponente, es posible evaluar variables con desviaciones de la linealidad debido a fenómenos tales como la presencia de sustancias interferentes, el efecto del filtro interno, ruido, etc. Por otro lado, PLS-1 permite establecer el número de componentes principales o factores necesarios para la construcción del modelo de calibración de cada uno de los compuestos de forma independiente. En este caso, se utilizó el programa de computo PLS-Plus, GRAMS/32 de "Galactic Co., Salem, NH, EUA" para la aplicación del algoritmo en la determinación simultánea de los seis PAH's de interés.

Inicialmente, se construyeron seis modelos de calibración: dos modelos con 48 muestras de calibración indicadas en la Tabla I utilizando los espectros de ángulo variable lineal completos de las rutas A y B (MC-1 y MC-2, respectivamente); dos modelos de calibración con 36 muestras cada ruta (MC-3 y MC-4) (no se consideraron las 12 primeras muestras de la Tabla I); dos modelos con 30 muestras para cada ruta (MC-5 y MC-6) (eliminado las 18 primeras muestras indicadas en la Tabla I). Los datos experimentales se sometieron a un tratamiento matemático previo a la calibración, el cual consistió en el proceso de centrado medio y autoescalado de todas las variables respecto al inverso de su desviación estándar.

El algoritmo PLS-1 se aplicó a las muestras de calibración utilizando los datos de los espectros completos (374 pares de datos para la ruta A y 196 pares de datos para la ruta B). Una de las decisiones escenciales en el algoritmo PLS es la elección adecuada del número de factores a ser utilizados para construir la matriz de calibración. El método comunmente utilizado para seleccionar el número de factores es la validación cruzada, dejando una muestra fuera cada vez, calculando el valor de PRESS (Suma de los errores residuales cuadráticos de predicción, "Prediction Residual Error Sum of Squares") para cada modelo de calibración construido cuando una muestra es dejada fuera:

donde Ck es la concentración conocida y Cp es la concentración estimada del analito en cada muestra de calibración.

Para seleccionar el número de factores óptimo, se pueden aplicar los criterios del mínimo valor de PRESS, el valor de PRESS mínimo local o el valor de la estadística F (utilizando como crieterio un valor de F = 0,75) 19-23). No existen reglas estrictas para aplicar uno u otro criterio. En este trabajo se analizaron los tres criterios en cuanto a los parámetros estadísticos SEC, RMSD y R, observándose que para los seis modelos de calibración el criterio del valor de PRESS mínimo local era el que arrojaba los mejores resultados, evitando así sub o sobre ajustes del modelo.

Posteriormente, se efectuó la validación externa de los modelos propuestos a través de las 10 mezclas referidas en la Tabla III, con distintas relaciones de concentración entre los componentes.

De los seis modelos de calibración estudiados, los mejores resultados tanto en la validación interna como externa se obtuvieron con los modelos utilizando los espectros de ángulo variable lineal registrados por la ruta B (MC-2, MC-4 y MC-6) y de estos, el MC-4 es el que arroja los mejores resultados, los cuales se muestran en la Tabla IV.

TABLA IV. Parámetros estadísticos calculados en la validación interna y externa del modelo de calibración propuesto MC-4 (ruta B, espectro completo, 36 muestras de calibrado).

 

 
 Validación Interna 
 
  Validación Externa 
 
PAH
factor
R
SEC
RMSD
REP
%Rec.±DS
SEP
RMSD
REP

BAP
6
0,998
0,38
0,36
7,28
95±12
0,71
0,69
13,8
BEP
5
0,999
0,56
0,54
1,86
98±2
0,95
0,91
2,47
BGP
5
0,999
0,32
0,30
2,87
100±2
0,28
0,26
1,75
COR
4
0,999
0,15
0,14
2,08
98±2
0,18
0,15
1,64
DBA
5
0,999
0,21
0,19
3,23
103±4
0,23
0,20
1,87
IND
6
0,998
0,65
0,64
3,85
105±11
0,86
0,82
4,21

Al observar los resultados obtenidos para BAP e IND, si bien, las recuperaciones son cercanas al 100 por ciento, la desviación estándar es mayor al 10 por ciento. Este hecho nos lleva a estudiar el seleccionar regiones espectrales para la calibración con el fin de observar si se mejoran los resultados para estos dos hidrocarburos24,25).

La restricción de las regiones espectrales permite seleccionar aquelas longitudes de onda (en nuestro caso pares de datos) más relevantes en la estimación de los componentes. Debe evitarse disminuir el número de longitudes de onda a tal grado que se pierdan las ventajas inherentes a cualquier método de calibración multivariante: el uso de gran número de señales analíticas para la estimación de los analitos de interés. En este caso, la selección se efectuó a partir de los espectros de correlación, los cuales se calculan en forma previa a la descomposición espectral y establecen la relación lineal existente entre la señal analítica a cada longitud de onda y la concentración de uno de los componentes en los espectros de absorción que integran la serie de muestras de calibración.

En un sistema como éste, donde los espectros de los compuestos en estudio están tan solapados, puede explicarse el hecho de que en pocas señales existan coeficientes de correlación altos. Siguiendo este criterio, se seleccionaron tres regiones en donde los valores de los coeficientes de correlación fueron mayores de 0,5 (r2 > 0,5) para el modelo de calibración denominado MC-4; estas regiones fueron del punto número 5 al 70 (65 puntos); del 120 al 138 (18 puntos) y del 148 al 180 (32 puntos); se debe recordar que el espectro completo tiene 196 puntos. Los resultados obtenidos se muestran en la Tabla V, en donde se observa que con la selección de las regiones espectrales se mejora grandemente las recuperaciones obtenidas para BAP y tanto para BAP como para IND la precisión aumentó considerablemente. Para los otros hidrocarburos no fue tan marcado la mejora en los resultados.

TABLA V. Parámetros estadísticos calculados en la validación interna y externa del modelo de calibración propuesto MC-4 (ruta B, 3 regiones del espectro seleccionadas, 36 muestras de calibrado).

 

Validación  Interna 
 
Validación Externa 
 
PAH
factor
R
SEC
RMSD
REP
%Rec.±DS
SEP
RMSD
REP

BAP
6
0,999
0,34
0,32
4,78
96±7
0,64
0,61
6,35
BEP
6
0,999
0,45
0,43
1,46
99±1
0,79
0,75
1,74
BGP
5
0,999
0,37
0,35
1,96
101±1
0,30
0,26
1,86
COR
5
0,999
0,19
0,16
1,85
99±2
0,21
0,18
1,65
DBA
5
0,999
0,19
0,17
2,37
102±2
0,21
0,17
1,48
IND
6
0,998
0,61
0,57
2,21
103±5
0,80
0,77
2,96

Como puede observarse, la aplicación del PLS-1 permite la determinación simultánea de los PAH's en estudio con resultados satisfactorios.

Análisis de muestras reales

Finalmente, con objeto de comprobar la validez de los métodos propuestos y tras establecer el modelo de calibración óptimo, se realizó la determinación simultánea de los seis PAH's de interés en las condiciones experimentales antes descritas utilizando como matriz tanto agua proveniente del mar como agua de suministro público. Las muestras de agua provenientes del mar se sometieron a un tratamiento de filtración previo utilizando papel filtro Whatman grado cualitativo N 5, para obtener las partículas sólidas de mayor tamaño en suspensión (>2,5 µm). Posteriormente, se contaminaron ocho muestras con cantidades conocidas de los seis PAH's, cuya composición se muestra en la Tabla VI. Los resultados obtenidos en la determinación de los PAH's se presentan en la misma Tabla VII, en donde se observa una buena relación entre las concentraciones puestas y las estimadas a través del modelo de calibración multivariante aplicado, con resultados de recuperación satisfactorios.

TABLA VI. Composición de las muestras provenientes de agua de mar y agua de suministro público contaminadas con los seis PAH's en estudio. Todas las concentraciones están dadas en µg·L-1.

TABLA VII. Resultados de la determinación simultánea de los PAH's en medio micelar en las muestras de agua.

 

CONCLUSIONES

La presencia del surfactante no iónico POLE en medio metanólico-acuoso propuesto provoca grandes variaciones en las propiedades luminiscentes de los seis PAH's estudiados, observándose en todos los casos un incremento en la intensidad de fluorescencia en distintas proporciones, lo cual permite el desarrollo de métodos analíticos más sensibles para su determinación.

En cuanto a la utilización de la fluorescencia de ángulo variable lineal, es posible registrar espectros de mezclas multicomponentes, conservando la información espectral más relevante de cada uno de los analitos, sin tener que recurrir a los espectros totales de excitación-emisión, cuyo registro y análisis requiere más tiempo.

Por otro lado, en el caso de sistemas con grandes interferencias espectrales entre los compuestos que lo onstituyen como es éste, la aplicación de algoritmos de análisis multicomponente permiten su resolución, sin tener que recurrir a procesos de separación previos. El algoritmo considerado en este trabajo parte de una relación lineal entre la propiedad óptica de interés y la concentración de las especies para establecer el modelo de calibración, permitiendo evaluar convenientemente las interferencias y resolver satisfatoriamente la mezcla de los seis PAH's. Los modelos obtenidos con el algoritmo PLS-1 arrojaron resultados favorables, tras seleccionar adecuadamente las muestras de calibración. Sin embargo, se obtuvieron mejores resultados cuando se realizó la calibración seleccionando algunas regiones espectrales y no con el espectro completo.

AGRADECIMIENTOS

Los autores agradecen el apoyo financiero otorgado para la realización de este trabajo a la Agencia Española de Cooperación con Iberoamérica, al CICyT (Proyec. PETRI, 95-0139-OP) y al Conacyt, México (Proyecto N 28118-E).

____________________________

*To whom correspondence should be addressed. E-mail: lopezp@quijote.ugto.mx

 

BIBLIOGRAFIA

1. J.W. Cook, I. Hieger, E.L. Kennaway y W.V. Mayneord. Proc. R. Soc. London 3(B), 455 (1932).         [ Links ]

2. E.J. Baum. "Polycyclic Hidrocarbons and Cancer". Academic Press, New York (1978).         [ Links ]

3. D.J. Futoma, S.R. Smith, J. Tanaka and T.E. Smith. "Polycyclic Aromatic Hydrocarbons in Water Systems", CRC Press, Boca Raton, Fla. (1981).         [ Links ]

4. W.J. Sinonsick and R.A. Hites. Anal. Chem., 58, 2114 (1986).         [ Links ]

5. J.C. Fetzer, W.R. Biggs and K. Jinno. Chromatographia, 21, 439 (1986).         [ Links ]

6. Ph Diercxens, Ph Thesis, Dep. de Genie Rural et Geometre, Ecole Polytechnique Federale de Laussane, Switzerland (1987).         [ Links ]

7. K.D. Bartle, M.L. Lee and S.A. Wise. Chem. Soc. Rev., 10, 113 (1981).         [ Links ]

8. J.B.F. Lloyd and I.W. Evett. Anal. Chem., 49, 1710 (1977).         [ Links ]

9. T. Vo-Dihn. Anal. Chem., 50, 396 (1978).         [ Links ]

10. M.T. Oms, R. Forteza, V. Cerda, F. García-Sánchez and A.L. Ramos. Computers Chem., 15(1), 87 (1991).         [ Links ]

11. G. Sla, S. Maspoch, H. Iturriaga, M. Blanco and V. Cerdá. Pharm. & Biochem. Anal., 6, 765 (1988).         [ Links ]

12. A. Cladera, J. Alpizar, J.M. Estela, V. Cerdá, M. Catasús, E. Lastres, L. García. Anal. Chim. Acta, 350, 163 (1997).         [ Links ]

13. D.L. Massart, B.G.M. Vandeginste, S.N. Deming, Y. Michotte and L. Kaufman. "Chemometrics: a textbood", Elsevier, Amsterdam (1988).         [ Links ]

14. H. Martens and N. Tormod. "Multivariate Calibration", Wiley, Gran Bretaña (1991).         [ Links ]

15. J. Zupan and J. Gasteiger. "Neural Networks for Chemists. An Introduction", VCH, Weinheim (1993).         [ Links ]

16. M.T. Oms, R. Forteza, V. Cerda, F. García and L. Ramos. Inter. J. Environ. Anal. Chem., 42, 1 (1990).         [ Links ]

17. R.V. Wandruszka. Crit. Rev. Anal. Chem., 23(3), 187 (1992).         [ Links ]

18. A.J. Bermejo. Ph. Thesis, Chemistry Department, Universidad de las Palms de Gran Canaria, Spain (1993).         [ Links ]

19. D.M. Haaland and E.V. Thomas. Anal. Chem., 60, 1193 (1988).         [ Links ]

20. D.M. Haaland and E.V. Thomas. Anal. Chem., 60, 1202 (1988).         [ Links ]

21. E.V. Thomas y D.M. Haaland. Anal. Chem., 62, 1091 (1990).         [ Links ]

22. P.L. López-de-Alba, L. López-Martínez, K. Wróbel-Kaczmarzye, K. Wróbel-Zasada, J. Amador-Hernández. Anal. Chim. Acta, 330, 19 (1996).         [ Links ]

23. D. Mukesh. J. Chem. Educ., 73(5), 431 (1996).         [ Links ]

24. P.L. López-de-Alba et al., J. Radioanal. Nucl. Chem., 220, 167 (1997).         [ Links ]

25. J.J. Berzas Nevado et al., Analyst, 123, 483 (1998).         [ Links ]