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Boletín chileno de parasitología

Print version ISSN 0365-9402

Bol. chil. parasitol. vol.56 no.3-4 Santiago July 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0365-94022001000200011 

Implementación de un ensayo de ELISA para el diagnóstico de la fascioliasis equina

Danilo Vargas L., Silvia Del Pino A., Carmen Gloria González I. y Macarena Vidal O.

Facultad de Ciencias Silvoagropecuarias, Universidad Mayor. Casilla 234. Correo 35. Las Condes. Santiago. Chile.

Abstract

Implementation of an ELISA technique in the diagnosis of equine fascioliasis.

And indirect enzyme linked immunosorbent assay was developed for the diagnosis of fascioliasis in naturally infected equines as a screening test with secretory and excretory antigens of adult flukes, in order to support the diagnosis of the disease. Fascioliasis in an economically important disease and the trematode Fasciola hepatica infects a wide variety of mammals and occasionally can infect man.

The standarization was performed with negative sera (collected in the XII Region of Chile) and positive sera checked by post mortem examination.

The evaluation was done in 226 sera samples: 115 negative, and 70 positive with confirmed fascioliasis, 19 from animals with other pathologies and 22 from apparently healthy animals. The ELISA presented a 85.7% of sensibility and a 97.4% of specificity.

Palabras clave (Key words): inmunodiagnóstico (immunodiagnosis), ELISA, antígenos de secreción y excreción (exretion and secretion antigens), fascioliasis equina (equine fascioliasis).

INTRODUCCIÓN

La fascioliasis es una zoonosis parasitaria causada por tramátodos del género Fasciola. En Chile se ha descrito exclusivamente Fasciola hepatica. Infecta a un amplio número de animales sean estos domésticos, silvestres y de abasto como bovinos y ovinos, igualmente puede infectar en forma accidental al hombre (Atias y Neghme, 1991). Los hospederos definitivos adquieren la infección por consumo de agua contaminada y principalmente por pastos como berros (Nasturtium officinale), que crecen a la orilla de vertientes de bajo flujo (Atias y Neghme, 1991).

La fascioliasis es endémica en nuestro país, se presenta en todas las regiones excepto en la XII. Constituye la primera causa de decomiso de hígado en las plantas faenadoras, superando a otras enfermedades como hidatidosis y tuberculosis (Ministerio de Agricultura, 1997). Su importancia radica en que constituye una zoonosis y genera pérdidas económicas a partir del decomiso de hígados, reducción en la ganancia de peso, propensión a otras enfermedades y muerte. Conjuntamente, el productor debe aplicar terapias con productos fasciolicidas reiteradamente, lo que implica un costo adicional en la producción (Gorman, 1991; Silva y col., 1995).

En los equinos, las manifestaciones clínicas son muy variables y podrían resumirse en alteraciones hepatodigestivas, anorexia, emaciación, bajo rendimiento deportivo y físico y en algunos casos la muerte (Alcaíno y col., 1983; Colahan y col., 1998).

A pesar de las variadas medidas de control de la fascioliasis, tanto para los hospederos intermediarios como para los definitivos, como son los tratamientos con productos químicos, la fasciolasis no ha disminuido, por lo que las estrategias basadas exclusivamente en tratamientos farmacológicos no son suficientes para su control, dado su escaso efecto en la mayor parte de los casos (Gorman, 1991; Gorman y col., 1991; Silva y col., 1995).

Entre las actuales técnicas utilizadas en el diagnóstico de la fascioliasis, podemos citar el examen coproparasitario, que a pesar de su economía, no siempre es ventajoso, puesto que requiere de la presencia de parásitos adultos que eliminen huevos, y en equinos presenta un 16% de falsos negativos, (Alcaíno y col., 1983; Gorman y col., 1991). Por otra parte no permite procesar grandes volúmenes de muestras por el tiempo que demora su ejecución cuando se plantean estudios masivos (Gorman, 1991).

Todos estos antecedentes revelan la necesidad de disponer de nuevas alternativas de diagnóstico de la fascioliasis en equinos, que deberían caracterizarse por su eficiencia técnica (sensibilidad, especificidad), operatividad, bajo costo y aplicabilidad en estudios seroepizotiológicos.

Como metodología diagnóstica, el ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) indirecto, ha sido utilizado por otros investigadores en diversas especies (por ejemplo: bovinos, porcinos), incluyendo al hombre y se ha determinado que es una prueba sensible y adecuada para el diagnóstico de la fascioliasis, con excelentes resultados de sensibilidad y especificidad (Gorman, 1991; Gorman y col., 1991; Silva y col., 1995).

Con el propósito de satisfacer las actuales demandas biotecnológicas en la identificación oportuna de F. hepatica en el hospedero equino, en el presente trabajo se expone la implementación de la técnica de ELISA como metodología de diagnóstico de la fascioliasis, en esta especie animal, utilizando como antígenos los extractos protéicos de secreción y excreción de F. hepatica, la aplicación de ésta, sin duda facilitará un diagnóstico precoz de la parasitosis a fin de adoptar medidas terapéuticas adecuadas y acciones profilácticas apropiadas que permitan disminuir los daños de la etapa invasiva de la parasitosis y en consecuencia, minimizar el deterioro en la salud y productividad en estos animales.


MATERIAL Y MÉTODO
Obtención de parásitos

Desde los canalículos biliares de equinos beneficiados en matadero, se extrajeron ejemplares adultos de F. hepatica, los que posteriormente se sometieron a lavados con agua destilada a fin de eliminar los restos de sangre y bilis. A continuación fueron transportados en envases limpios a 4ºC, para su trabajo en laboratorio.

Preparación de antígeno de secreción y excreción (S/E)

Los parásitos se sometieron a un shock hipoosmótico con 5 volúmenes de agua, a una temperatura de 4ºC, toda la noche, a continuación los parásitos fueron removidos y el líquido resultante se sometió a una centrifugación a 10.000 r.p.m. durante 30 minutos a 4ºC. el sobrenadante se dializó contra 5 volúmenes de agua a 4ºC y posteriormente se liofilizó. El producto antigénico se almacenó a -20º C hasta su utilización. La concentración del preparado antigénico se determinó mediante el método de Bradford (1976).

Obtención de los sueros

Las muestras de sangre de equinos se obtuvieron de la Planta Faenadora La Pintana, después del beneficio de los animales. Cada suero se obtuvo por centrifugación a 4.000 r.p.m. durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente, las muestras de suero se inactivaron a 56ºC durante 30 minutos, para evitar la actividad del complemento.

Después, las muestras se almacenaron a -20ºC hasta su utilización.

La estandarización se realizó con dos sueros negativos y con un suero positivo confirmado a la inspección Médico Veterinaria. La evaluación se realizó con cuatro grupos de sueros de equinos, el primero conformado por 70 sueros positivos, provenientes de la Planta faenadora La Pintana que presentaron ejemplares adultos a la inspección post mortem, el segundo grupo, formado por 115 sueros negativos provenientes de la XII Región, el tercer grupo constituido por 19 sueros de equinos, que correspondieron a otras etiologías de acuerdo a la inspección Médico Veterinaria y un último grupo formado por 22 sueros de equinos aparentemente sanos.

Prueba de ELISA

Se utilizó el método descrito por Coltorti (1986) modificado por Vargas y col., ( 1995).

El ensayo se realizó en microplacas de fondo plano (Nunc®) sensibilizadas con solución de antígeno de S/E de F. hepatica en tampón carbonato/bicarbonato 0,05% M por 18 horas a 4½C. Posteriomente, se lavó con solución tampón fosfato salino/Tween 20 (PBS/Tween 20) al 0,5%, para en esta forma bloquear los sitios del pocillo que no adsorbieron antígeno. Posteriormente, las placas se trataron con una solución tampón carbonato/bicarbonato pH 9,6 y leche descremada al 5% y se incubó por una hora en cámara húmeda a 37ºC. Se lavaron y almacenaron a -20ºC hasta su utilización.

Se adicionaron alicuotas de las muestras de los sueros controles y problema en cada pocillo diluido en tampón PBS/Tween 20 pH 7,4 0,5%. Las placas se incubaron durante 30 minutos en cámara húmeda a 37ºC. Como segundo anticuerpo se utilizó una anti-IgG de equino conjugada con peroxidasa (Sigma®) diluida en tampón PBS/Tween 20 pH 7,4 al 0,5%. Posteriomente se incubó en cámara húmeda y se lavó.

A continuación las placas se incubaron con solución reveladora en tampón fosfato pH 6 0,1 M, durante 15 minutos en cámara oscura. La reacción se detuvo con ácido sulfúrico al 12,5% (v/v). La lectura se ralizó en un lector de ELISA (MRX Microplate Reader® DYNEX technologies®) a una longitud de onda de 490 nanómetros (nm).

Análisis estadístico

Las muestras de sueros se analizaron por duplicado y los resultados se expresaron como el promedio de la absorbancia. El valor de corte (cut off), se determinó por la suma de los valores promedios de los sueros controles negativos más tres veces su desviación estándar. En cada microplaca se incluyeron tres sueros controles negativos y uno positivo.

Las diferencias de los resultados obtenidos con esta reacción se analizaron estadísticamente mediante la prueba de chi-cuadrado, con un 95% de confianza y una significancia del 5%.
 

RESULTADOS
Estandarización de la técnica

La concentración óptima de antígeno se determinó de acuerdo a un diagrama de titulación. La microplaca de poliestileno fue dividida cada tres columnas de pocillos las cuales se fijaron con igual concentración de antígeno. El preparado proteico se trabajó entre 0.05 y 2 µg por pocillo. Por bloque se adicionó un conjunto de sueros negativos y positivos en diluciones crecientes y por duplicado. De forma similar, se procedió a la estandarización de las concentraciones óptimas de suero y conjugado, las que se determinaron en 1/200 y 1/2500.

Evaluación de la técnica

En la Tabla I, se resumen los resultados obtenidos mediante el ensayo de ELISA, en el que se analizaron cuatro grupos de sueros de equinos incluidos en el estudio.


La concordancia de los resultados se alcanzó en 212 muestras (93,8%) y una discordancia en 14 muestras (6,2%).

De acuerdo con los resultados obtenidos, la sensibilidad (proporción de muestras positivas o reactivas correctamente identificadas por la prueba empleada), alcanzó un 85,7% y la especificidad (proporción de muestras negativas, no reactivas correctamente identificadas por la prueba empleada) fue de un 97,4%. Los resultados son similares a los obtenidos por otros autores (Gorman y col., 1991; Silva y col, 1995). El valor predictivo positivo, se refiere la probabilidad que tiene un individuo, con resultado positivo a la prueba, de estar verdaderamente infectado. En este estudio, correspondió a un 93,8%, mientras que el valor predictivo negativo, que representa la probabilidad que tiene un individuo de no presentar la infección, cuando el resultado es negativo, a un 93,8%.

El análisis estadístico no reveló diferencias significativas en los resultados analizados. Esto significa, que los resultados obtenidos por la prueba de ELISA no difieren con los presentados por el examen port mortem realizado en los equino incluidos en este estudio.

En la Tabla II, se resumen los resultados para las distintas etiologías encontradas a la inspección post mortem.


Se observó que 4 de las 19 muestras de sueros de equino con otras patologías presentaron serología positiva a la prueba de ELISA indirecta (2,6%). Entre ellas, dos casos corresponden a abscesos hepáticos, uno a microabsceso, y uno a migración parasitaria. Por otra parte, 10 de las muestras con fascioliasis confirma-da (14,2%) presentaron serología negativa a la técnica.

Todas las muestras de sueros de equinos aparentemente sanos, resultaron negativas, lo que refuerza la confiabilidad en la especificidad de esta técnica.

DISCUSIÓN

La fascioliasis, que en Chile es producida exclusivamente por F. hepatica, es una problema de sanidad animal, debido a su defícil control y al bajo desarrollo de metodologías diagnósticas que permitan identificar la infección en forma oportuna.

La técnica de ELISA, es ampliamente utilizada en relación a otras técnicas de diagnóstico dada su simplicidad, sensibilidad, especificidad, confianza y bajo costo de implementación (Muñoz y col., 1986). Algunas de estas ventajas, como la sensibilidad y especificidad, dependen de las características de la concentración del antígeno adsorbido en los pocillos de poliestileno, el cual está estrechamente relacionado con la calidad del preparado antígenico que se utilice (Muñoz y col., 1986; Gorman, 1991). La concentración y calidad adecuada del antígeno, por otra parte, son factores cruciales que determinarán en definitiva la sensibilidad del ensayo (Coltorti, 1986; Muñoz y col., 1986; Vargas y col., 1995). Por este motivo, en este estudio se utilizó el método de Bradford (1976) como procedimiento para la determinación de la concentración de proteínas dado que se caracteriza por su fácil y sencilla ejecución, igualmente, presenta una mayor sensibilidad y estabilidad frente a cationes (sodio, potasio), carbohidratos, en comparación con otros métodos colorimétricos como el test de Lowry y el test de Biuret (Bradford, 1976) y que ha sido ensayada con éxito por otros investigadores (Coltorti, 1986; Gorman y col., 1991; Silva y col., 1995; Vargas y col., 1995).

La acción antigénica de F. hepatica estimulada por medio de las fracciones somáticas y de secreción y excreción, genera en el hospedero la producción de inmunoglobulinas IgE e IgG especialmente el tipo IgG1 en los animales con infección aguda y crónica (Clery y col., 1996; Bossaert y col., 2000).

Dado el propósito del estudio, de una preparación sencilla del extracto antigénico, y la posibilidad de identificar la infección en forma precoz la IgG1, se decidió la preparación del antígeno de S/E de F. hepatica, mediante ELISA indirecta, que puede identificar anticuerpos, del tipo IgG, desde la segunda semana post-infección (Bossaert y col., 2000). Las experiencias realizadas por otros investigadores indican que el extracto proteico de S/E, presenta una mayor sensibilidad que una preparación de antígeno crudo proveniente de un parásito adulto (Hillyer, 1993). Por otra parte, se describe que tanto los antígenos somáticos y de S/E, comparten algunos de sus determinantes antigénicos (Espino y col., 1987; Gorman y col., 1991; Hillyer, 1993; Sánchez y col., 2000), la cantidad relativa de epitopes es más vaiable en los antígenos de S/E, que en un antígeno somático, haciendo más estable la respuesta inmune frente a estos antígenos (Bossaert y col., 2000).

Estos antecedentes indicarían que la técnica es apropiada para el diagnótico de la infección por F. hepatica en consecuencia permitiría el diagnóstico desde una etapa temprana (Bossaert y col., 2000).

Con respecto de los valores de sensibilidad y especificidad, los resultados son similares a los obtenidos por otros autores (Gorman, 1991; Gorman y col., 1991; Silva y col., 1995) en los trabajos realizados con extractos crudos del parásito (Gorman, 1991), se obtuvieron valores de sensibilidad y especificidad inferiores a los obtenidos en este estudio.

La presencia de falsos negativos, que corresponden al 14,2% del total de sueros positivos, podría ser explicada por una disminución en los niveles de anticuerpos, debida a que una vez que la F. hepatica se localiza en los canalículos biliares quedaría apaentemente aislada del sistema inmune del hospedero, dado que ejerce una menor acción agresora en comparación a las etapas juveniles, además habría una probable disminución en la carga parasitaria, lo cual reduce la posibilidad de una estimulación antigénica; esta hipótesis ha sido planteada por otros investigadores (Gorman, 1991; Silva y col., 1995; Bossaert y col., 2000).

Se debe considerar que los animales beneficiados en los mataderos, utilizados en este estudio, pueden presentar algún grado de inmunodeficiencia, ya que corresponde a animales que no presentan el peso promedio esperado para su edad, sumado al mal estado de salud o debilitados por infecciones crónicas, como por ejemplo las producidas por F. hepatica, entre otras.

Los resultados falsos positivos, se presentaron en el 2,5% de los equinos (dos casos con abscesos hepáticos, una caso con microabsceso y un caso con migración parasitaria).

Estos resultados, podrían explicarse porque la presencia de este tipo de lesiones en el hígado puede ser provocada por la acción traumática de estados juveniles de F. hepatica, en el parénquima o bien a anticuerpos residuales posteriores a la infección primaria tratada (Sánchez y col., 2000).

También, en la literatura se ha descrito que la presencia de abscesos hepáticos es poco frecuente en los equinos, adultos y potrillos, donde se asocian a migración por Ascaris, septisemia bacteriana o infección ascendente de la vena umbilical (Robinson. 1992). Por último, la presencia de parásitos intestinales del equino podría explicar también las respuestas de falso positivo, dado que helmintos de la fauna intestinal presentan una comunidad antigénica compartida (Silva y col., 1995); en consecuencia el trabajo con extractos semipurificados de antígenos de uso diagnóstico, permitiría fortalecer y optimizar la sensibilidad y espicificidad de la técnica (Hillyer, 1993). Sin embargo, la identificación de epitopes por ejemplo efectuados por electroinmunotransferencia (E.I.T.) realizados por otros investigadores proporcionarían una real alternativa en el diagnóstico de esta parasitosis en otras especies de abasto (Espino y col., 1987; Gorman y col., 1991).

Frente a los resultados obtenidos en el presente estudio, podemos decir que el ensayo de ELISA, implementado para el diagnóstico de la fascioliasis equina, es satisfactorio. Los resultados de sensibilidad (85,7%) y especificidad (97,4%), VPP (93,8%), VPN (93,8%) entregados por la técnica, concuerdan con los resultados obtenidos para esta parasitosis en otras especies de abasto tales como bovinos, ovinos y pocinos (Gorman y col., 1991; Silva y col., 1995), permitirían disponer de una alternativa metodológica de diagnóstico en equinos que padecen esta parasitosis, en regiones de alta frecuencia, dado que el VPP de la técnica se ve modificado por el valor de la prevalencia en distintas regiones de nuestro país. En forma hipotética, si aplicamos la prevalencia de 1,8%, el VPP alcanzaría al 37,6%, esto implicaría una baja probabilidad de que los individuos reactivos a la prueba sean positivos. Por otro lado, si trabajamos con prevalencia media de un 9,1%, se alcanzaría un VPP de 76,8% y un VPN de 98,5%, resultados que sin duda, son prometedores para la aplicación de la técnica a estudios seroepizotiológicos de esta parasitosis en equinos.

REFERENCIAS

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