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Boletín chileno de parasitología

versión impresa ISSN 0365-9402

Bol. chil. parasitol. v.55 n.1-2 Santiago ene. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0365-94022000000100011 

Efecto in vitro del suero de la trucha Arco Iris (Oncorhynchus mykiss) sobre metacercarias del género Tylodelphys (Trematoda, Diplostomatidae).

Susana Olabuenaga

Cátedra de Ictiopatología, Centro Regional Universitario Bariloche, Unidad Postal Universidad Nacional del Comahue, 8400 Bariloche, Argentina.

Abstract

The in vitro effect of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) serum in Tylodelphys sp. (Trematoda,
Diplostomatidae) metacercariae.

Here, it has been described that normal fresh sera from rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) were able to lyse Tylodelphys sp. metacercariae isolated from Galaxias maculatus (Jenyns, 1842) (Teleostei, Galaxiidae) brain. This effect was time dependent, and progressively increased since 1 h up to 18 h incubation. There were oscillations in the ability of different sera samples to lyse these parasites. Similar values were achieved with other salmonid sera, and also with normal human sera pool. The lytic activity was abolished by heat-inactivated sera, by zymosan treatment and by incubation in the presence of EDTA. However, the mean values obtained in the presence of EGTA-Mg++ did not significantly differ from those found with sera as a source of complement. The results of this study suggested the role of complement alternative pathway on Tylodephys sp. in vitro lysis, under our experimental conditions.

Palabras clave (Key words): Tylodelphys; Galaxias maculatus; metacercarias (metacercariae); suero (serum); trucha Arco Iris (rainbow trout); complemento (complement):

INTRODUCCION

En los peces, el sistema inmune está bien desarrollado y en condiciones normales responde y controla en forma eficiente a los agentes infecciones que toman contacto con el huésped. Sin embargo, bajo condiciones adversas del medio circundante, se pone en peligro la salud de la población, y se facilita de este modo el desarrollo de una determinada infección. La inmunidad innata, o sea la que se posee desde el nacimiento, es particularmente importante en los animales poiquilotermos, aunque en los peces poco se sabe sobre su mecanismo de acción contra distintos parásitos. Los mecanismos humorales y celulares en este tipo de inmunidad se ponen en marcha una vez que el patógeno ha tomado contacto o ha entrado al pez. Dentro de los componentes humorales se encuentran entre otros la lisis asociada al sistema complemento (Bower y Woo, 1977), la opsonización por anticuerpos naturales (Michel y col., 1990), la lisozima ó las proteasas neutras (Murray y Fletcher, 1976; Ellis, 1990), la proteína C reactiva (CRP) (Fletcher y col., 1977; Edagawa col., 1993), la transferrina (Buller y col., 1978) y el interferon (Dorson y col., 1975; Secombes y col., 1996). Con respeto al sistema complemento, filogenéticamente, existen evidencias de haberse desarrollado por primera vez en los peces (Lambris, 1993). Se ha reportado en peces teleósteos, tanto marinos como de agua dulce, la presencia de las dos vías del complemento, la alterna ó independiente del anticuerpo y la clásica ó dependiente del anticuerpo (Sakai, 1992). Se han encontrado ambas vías en la trucha Arco Iris Oncorhynchus mykiss (Nonaka y col., 1981), así como en otras especies (Yano, 1992).

El puyen chico o común Galaxias maculatus, es el pez nativo más abundante en los parques nacionales Nahuel Huapi y Lanín (Valverde, 1990) y un componente muy importante en las tramas alimentarias de los lagos de la región. Es sabido que muchas metacercarias strigeoides están en habitats específicos dentro de los hospedadores. Las larvas migran desde los sitios de penetración y se ubican en lugares específicos, donde evolucionan a metacercarias. Se describió la presencia de metacercarias de tres especies distintas del género Tylodelphys en el cerebro de puyenes del Lago Meliquina, en la provincia de Neuquen (Quaggiotto y Valverde, 1992). También fue analizada en el Lago Gutiérrez la presencia de dos especies de este género en el cerebro de G. maculatus (Flores, 1996). En el puyen del Lago Nahuel Huapi fue reportada la presencia de metacercarias de Tylodelphys barilochensis en el cerebro y se describió la vía de migración hacia el sistema nervioso central (Scheinert y col., 1997). Así, las metacercarias no enquistadas del género Tylodelphys, constituyen parásitos comunes en este pez autóctono de la Patagonia.

En este trabajo se presentan los resultados del efecto del suero fresco de O. mykiss y de otras especies de salmónidos sobre metacercarias de Tylodelphys sp. aisladas del cerebro de G. maculatus. Se estudió su dependencia con respecto a la temperatura y el tiempo, su reversibilidad, y la participación del sistema complemento. Los resultados demostraron que estaba involucrada la participación de la vía alterna del complemento.

MATERIAL Y METODOS

Peces

Se trabajó con ejemplares clínicamente sanos de O. mykiss de 200-500 g aproximadamente, y en algunos experimentos se usaron ejemplares de Salmo trutta fario ó trucha marrón, Salmo salar sebago o salmón y Salvelinus fontinalis o trucha de arroyo, en estos dos últimos casos se utilizaron ejemplares de menor peso (50-100 g). Todas estas especies procedían del Centro de Salmonicultura, piscicultura dependiente de la Universidad Nacional del Comahue. Dentro de los peces silvestres y autóctonos, se usó G. maculatus, de 6 cm de longitud promedio. Estos se obtuvieron por captura con una trampa tipo nasa, sumergida a distintas profundidades en regiones costeras del Lago Nahuel Huapi, en distintos sitios de muestreo y en distintas épocas del año. Luego, se mantuvieron en un acuario de 101 a 8-9° C de temperatura con aireador, hasta su procesamiento.

Necropsia

El sacrificio de los puyenes se efectuó por un golpe en la cabeza. La misma se separó y cuidadosamente bajo microscopio estereoscópico, y luego se separaron los distitos órganos y tejidos, dejando libres a los parásitos.

Parásitos

Las metacercarias de Tylodelphys sp. fueron removidas cuidadosamente bajo lupa, y suspendidas en medio de cultivo frío. Luego se realizó un gradiente de Ficoll-Hypaque (d= 1.077 g/ml) para aislar los parásitos de las células, tejidos y detritus. Se sembró a razón de 3 partes de suspensión a 1 parte de Ficoll-Hypaque. Se centrifugó a 400 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Los parásitos se ubicaron en pellet, se los lavó dos veces centrifugando a 400 xg durante 10 min cada vez, y finalmente se los suspendió en medio completo frío. Se los mantuvo así hasta utilizarlos en la reacción. Cabe mencionar, que las metacercarias se aislaban en fresco para cada experimento, y que cada una de estas preparaciones se componía de larvas provenientes de varios ejemplares de puyenes (5 a 10).

Obtención de sueros

La sangre total se obtuvo por punción cardíaca y la aorta dorsal, de los ejemplares de salmónidos mencionados. Se dejó que la sangre coagulara por 2 horas a temperatura ambiente, y luego en frío, aproximadamente 4 h. Se centrifugó una vez a 400 xg durante 15 min, y se separó el suero. De rutina se utilizó un pool de varios sueros (3-6 ejemplares). El mismo se fraccionó en pequeñas alícuotas y se congeló inmediatamente a -20°C hasta su uso. Sólo se emplearon muestras de hasta 4 semanas de antigüedad. Como sueros no relacionados, se probó un pool de suero humano normal, proveniente de dadores normales.

Inactivación de sueros

Para inactivar el sistema complemento, los sueros fueron calentados a 45°C durante 35 min. Luego se guardó en alícuotas a -20 a 20°C hasta su uso.

Tratamiento de Tylodelphys sp. con sueros

Las metacercarias de Tylodelphys sp. fueron contadas bajo lupa, separándose aproximdamente 15 a 20 ejemplares viables y bien móviles por tubo, luego se les agregó el suero en una dilución final de 1:2 ó medio de cultivo completo, como control, en un volumen final de 100 µl. La reacción se incubó en baño a 18°C durante distintos tiempos. Después de la incubación, eran contados los parásitos totales bajo lupa. Se controló la viabilidad por tinción con azul de metileno. Se definió como lisis a pérdida de movilidad y viabilidad de los parásitos, y su porcentaje era calculado de acuerdo a la siguiente fórmula:

  número de parásitos no viables  
% lisis =
x 100
  número total de parásitos  
 
(viables y no viables)
 

Tratamiento con Zymosan

Se preparó una solución de zymosan a 1 mg/ml, la cual se hirvió en solución salina buffereada (PBS) durante 30 minutos. Luego se lavó dos veces con PBS centrifugando 10 min a 400 xg, y se suspendió nuevamente a 1 mg/ml en solución fisiológica. Así, se trató 0,1 ml de suero fresco con 1 mg/ml de zymosan, y se incubó durante 60 min 17°C. Se lavó dos veces con solución fisiológica, se suspendió a 1 mg/ml, y se usó según protocolo.

Medio de cultivo

El medio de cultivo utilizado fue Leibovitz 15 (L15) (GIBCO), pH 7,0-7,4, suplementado, con 5% de suero fetal bovino inactivo a 56°C durante 45 min y con gentamicina 2,5 µg/ml (L-15 completo).

Reactivos

Se prepararon soluciones de ácido etilendiaminotetracético (EDTA), ácido etilenglicoltetracético (EGTA), y cloruro de magnesio, en PBS pH 7,2 y se usaron a una concentración final de 0.01M.

Análisis Estadístico

Los datos fueron expresados como la media ± el error standard (X ± E.S.) La comparación entre medias fue analizada mediante el test t de Student de 2 colas.

RESULTADOS

Efecto del suero de trucha Arco Iris sobre Tylodelphys sp.

Se observó que al incubar las metacercarias del género Tylodephys con el suero fresco de trucha Arco Iris (STAI), se producía la lisis de estos parásitos, permaneciendo inmóviles y no viables en comparación con los controles. La dilución final usada y elegida como óptima fue de 1:2, disminuyendo su potencial hasta 1:20. A partir de aquí hasta 1:500 no se encontró efecto lítico alguno (datos no mostrados). La reacción se estudió en el curso del tiempo por un período de 18 h. Como se muestra en la Fig. 1, después de la interacción de los parásitos con el suero fresco, su mortalidad era significativa, en contraste con los valores hallados con sueros inacctivos (STAI O y medio) o con los controles en presencia de medio de cultivo.


Fig. 1. Cinética de la lisis de Tylodelphys sp. por suero de Oncorhynchus mykiss
Los datos se expresan como la media ± el error standard (X ± E.S.). Se usaron 9 pools de suero de O. mykiss. Las diferencias entre STAI vs STAIØ ó medio fueron significativas: P<10-6(1h); P<10-9, P<-11(2h); P<10-11 (2h); P<10-4, P<10-5 (3h); P<10-7, P< 0.01 (18h), prueba t de Student de 2 colas.

En esta cinética, vemos un aumento progresivo de la lisis desde una hora hasta las 18 h de incubación, y una temperatura de 18°C. El aumento de los controles fue moderado y no significativo. Los niveles de lisis alcanzados, variaron según los distintos sueros utilizados. De todos modos, el efecto lítico fue significativo con todos los sueros probados, lisando a los parásitos después de un determinado tiempo de incubación.

En la Tabla I se muestran las variaciones entre 4 pools de suero utilizados en distintos experimentos, lo cual es ilustrativo para conocer el comportamiento de distintas muestras séricas y sus oscilaciones. Se observó que a las 2 h de incubación el porcentaje de lisis alcanzado con todos ellos, era significativo.

TABLA I

Tratamiento de Tylodephys sp. con distintos
pools de sueros de Oncorhynchus mykiss.

 
% de lisis 

Tratamiento
Tiempo de incubación 
 

 
1 h
2 h

Pool# 1 (n=7)
24,6 ± 6
50,1 ± 4
Pool# 2 (n=6)
17,1 ± 10
60,5 ± 11
Pool# 3 (n=7)
47,6 ± 15
73,4 ± 14
Pool# 4 (n=7)
21,4 ± 2
40,3 ± 4

Se utilizaron pools 1-4 de suero fresco normal de trucha
Arco Iris, provenientes de 3 o más ejemplares. Los datos se expresan
como la media ± el error standard (X ± E.S.).

 

Como se indica en la Tabla II, al dializar el suero fresco de trucha (STIA-dializado), los resultados no se modificaron. Se descartó así, la presencia de algún péptido pequeño de bajo peso molecular que fuera responsable de un efecto tóxico, que produjera la muerte de las metacercarias.

TABLA II

Incubación de Tyldelphys sp. con suero fresco de
Oncorhynchs mykiss, sin tratar y dializado.

 
% de lisis 

Tratamiento
Tiempo de incubación 

 
2 h
5 h

STAI.*
42,3 ± 5
66,2 ± 1
STAI-dializado
37,2 ± 9
58,4 ± 14
medio
0
0
Los datos se expresan con la media ± la desviación standard (X ± D.S.) de un experimento representativo realizado pr triplicado. (*); Se utilizó un pool de STAI sin tratar ó STAI-dializado.

 

Incubación de Tylodelphys sp. con diferentes sueros

Fue investigado el fecto de otros sueros de salmónidos sobre las metacercarias de Tylodelphys sp. Los sueros probados pertenecían a trucha marrón, trucha de arroyo y salmón. Los resultados que se muestran en la Tabla III demostraron que estos 3 tipos de sueros eran también capaces de lisar a los parásitos de forma similar al STAI. Como suero no relacionado, se probó un pool de suero humano normal (SHN), en este caso los porcentajes de lisis que se registraron fueron: X ± E.S.: 3,11 ± 2,1, 27,9 ± 5,7 y 72,9 ± 5,4 (n=8) a 1,2 y 18 horas de incubación, respectivamente.

TABLA III

Tratamiento de Tylodelphys sp. con distintos
sueros de salmónidos.

 
% de lisis  

Suero de:
Tiempo de incubación

 
1h
2h
4h
 

Trucha marrón (a)
48,9 ± 9
73,7 ± 15
86,1 ± 9
Trucha marrón (b)
88,2 ± 1
100,0
--*
Trucha de arroyo
29,1 ± 6
71,7 ± 5
90,3 ± 2
salmón
74,5 ± 11
97,1 ± 4
100,0
Trucha Arco Iris 25,4 ± 8 41,2 ± 2 82,5 ± 6

Los datos se expresan como la media ± la desviación standard (X ± D.S.), n=2. Los sueros provenían de un pool de 3 o más ejemplares de los salmónidos mencionados. (a) y (b): indican 2 polls de suero diferentes.

(*): no se hizo.

 

Tratamiento con zymosan, EDTA y EGTA

Los resultados encontrados con el suero inactivado de los ejemplares de trucha Arco Iris, sugirieron fuertemente la participación del sistema complemento. Por lo tanto, con el fin de averiguar cual era la vía del complemento involucrada, se incubaron las metacercarias con sueros pretratados con zymosan, que es un activador de la vía alterna. Los resultados hallados después de 4 h de incubación, expresados como el valor medio ± la desviación standard (n=2), fueron los siguientes: % de lisis: STAI: 66,0 ± 12 y STAI-Zymosan: 22,7 ± 8. Como vemos, este tratamiento deplecionó en forma efectiva la actividad lítica del suero. Posteriormente, se hizo una remoción selectiva de iones Ca++ y Mg++, mediante el empleo de los quelantes, EDTA y EGTA. Como se indica en la Fig 2, se observó que en presencia de EDTA (STAI-EDTA) a la hora y a las 4 h de incubación, los valores de lisis fueron similares a los encontrados en presencia de suero solo (STAI). Esto demostraba nuevamente, que al impedir que el sistema complemento actuara ya sea por una o otra vía, el suero no tenía ningún efecto lítico sobre los parásitos.


Fig. 2. Tratamiento de Tylodelphys sp. con suero de Oncorhynchus mykiss en presencia de EDTA

Los datos se expresan como la media ± el error standard (X ± E.S.), 1h n=7 y 4h n=3. La significativa estadística STAI vs STAI-EDTA 1 h: P<0.007; 4 h: P<0.01, prueba t de Student de 2 colas.

Por último se ralizaron las incubaciones en presencia de EGTA y Mg++. Los resultados, durante una incubación de 4 horas expresados como la media ± el error standard fueron: X ± E.S. n=3, % de Lisis: STAI = 82,73 ± 6,2 y STAI EGTA-Mg++ = 77,1 ± 7,7. La función del EGTA era la de quelar solamente los iones calcio, por lo que en presencia de Mg++, sólo se podía llevar a cabo la vía alterna del complemento. Por lo tanto, estos resultados sugirieron que la probable vía involucrada fuera la alterna.

DISCUSION

Los resultados indicaron que existía in vitro una reducción significativa de la viabilidad de las metacercarias de Tylodelphys sp. que habían sido aisladas del cerebro de G. maculatus ó puyen, por acción del suero fresco de O. mykiss ó trucha Arco Iris, en comparación con los parásitos no tratados. Este efecto no se observó por la inactivación del sistema complemento. La mortalidad de los parásitos aumentó con el tiempo de incubación, comenzando a la hora y alcanzando un máximo a las 18 h y la temperatura óptma fue de 18°C. Se observó un pequeño aumento de la lisis en las muestras incubadas con medio a partir de las 4 h de incubación, pero se mantuvo, sin embargo, una diferencia significativa con respecto a las muestras tratadas con suero. Se observaron variaciones entre los distintos pools de suero usados, no obstante todos ellos indujeron la lisis de las metacercarias, descartando que se trate de un fenómeno aislado. A los parásitos pretratados con suero, se los sometió a sucesivos lavados, y luego se los mantuvo en cultivos cortos de 1,2, 18 ó 48 h en medio completo. Al término de los mismos, el porcentaje de parásitos lisados se mantuvo sin cambios, sugiriendo que el efecto era irreversible y el daño producido era letal (datos no mostrados). Los sueros frescos provenientes de otros salmónidos también fueron capaces de lisar a las metacercarias en forma similar al STAI. También se observó un efecto lítico con un pool de suero humano normal, como fuente fresca de complemento.

Después de estas observaciones iniciales, el posterior tratamiento del suero de O. mykiss con zymosan, también deplecionó su actividad lítica, al igual que el tratamiento con EDTA. En contraste, la presencia de EGTA adicionado de Mg++, no modificó el efecto lítico del suero. Todos estos datos sugirieron la participación del complemento a través de la vía alterna.

El sistema complemento es uno de los más importantes mecanismos del sistema inmune en el reconocimiento y eliminación de sustancias extrañas. Su activación genera un grupo de moléculas inflamatorias y un complejo lítico que actúa en la destrucción y eliminación de agentes que pueden ser potencialmente perjudiciales. De ahí, que resulte de interés que el suero fresco de trucha Arco Iris, de otros salmónidos ó humano normal utilizados como fuente de complemento, fueran capaces de actuar contra las metacercarias de Tylodelphys sp.

Es sabido que los parásitos han desarrollado numerosas estrategias, por las cuales tratan de evitar o al menos reducir la repuesta inmune del huésped y así facilitar su permanencia. En cuanto al puyen, la migración de T. barilochensis es mu rápida y se hace vía los nervios espinales y craneales (Scheinert y col. 1997). Probablemente una de las razones principales sea la de localizarse cuanto antes le sea posible en un sitio protegido de control inmunológico y que a su vez favorezca la continuidad de su ciclo de vida. Por lo tanto, si bien el sistema complemento constituye una barrera importante de defensa, en el puyen su acción podría verse ampliamente dificultada.

Se ha reportado en peces, la acción del sistema complemento, a través de ambas vías, demostrando un requerimiento de los cationes, Ca++ y Mg++, similar al encontrado en mamíferos y que el componente C3 sería una pieza clave en los distintos tipos de activación (Yano, 1996). Se describió en algunas especies de peces, la activación del sistema complemento a través de la vía alterna, como mecanismo de protección contra determinadas infecciones. Algunos autores trabajaron en modelos similares, utilizando como parásitos, Cryptobia catostomi ó Trypanoplasma salmositica, tanto in vivo como in vitro (Bower y Woo, 1977; Wehnert y Woo, 1980). Sus resultados demostraron que los sueros pertenecientes a las distintas especies de peces resistentes a estas infecciones, fueron capaces de eliminar a los parásitos por activación de la vía alterna del complemento, pero esto no ocurría en el caso de provenir de especies susceptibles. Estos autores cocluyeron que en peces resistentes, el parásito era lisado por la vía alterna del complemento, representando mecanismo de inmunidad innata. Otros autores, había reportado la lisis de epimastigotes de Trypanosoma cruzi con suero humano fresco, suero de cobayo y de conejo a través de la vía alterna del complemento (Nogueira y col., 1975), y también fue descripta su habilidad para evadir la lisis por dicha vía (Scher y col., 1986). Estas observaciones están de acuerdo con los datos hallados aquí, y que demostraron la participación de la vía alterna en la lisis de Tylodephys sp. No se descarta la presencia de anticuerpos en los sueros por acción del suero fresco, se debería a la actividad del complemento siendo eliminado su efecto por inactivación del mismo, lo que demuestra su dependencia.

La conclusión es que las metacercarias del trematode strigeoide Tylodelphys sp. fueron susceptibles a la lisis e inmobilizadas in vitro por los distintos sueros frescos utilizados diferentes produciendo su muerte, y que los datos hallados, involucraron la participación del sistema complemento, a través de su vía alterna. Estos resultados sugieren la posibidad de que este mecanismo fuese relevante en el control de la parasitemia, pudiendo funcionar in vivo en defensa del huésped, y evitar que se instale una determinada infección.

Agradecimientos.- Agradezco a la técnica Patricia Noguera por haber realizado las extracciones de sangre, al personal del Centro de Salmonicultura, dependiente de la UNC por contribuir generosamente con los ejemplares de salmónidos utilizados en este trabajo, y al Lic. Oscar Serra por su valiosa ayuda en la preparación de este manuscrito y su apoyo permanente. Este estudio fue realizado con el subsidio BO37 otorgado por la UNC.

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