SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.54 número3-4Ectoparasitosis humanas: Estado actual en el UruguayHidatidosis en la provincia de La Pampa, Argentina, 1998 índice de autoresíndice de materiabúsqueda de artículos
Home Pagelista alfabética de revistas  

Boletín chileno de parasitología

versión impresa ISSN 0365-9402

Bol. chil. parasitol. v.54 n.3-4 Santiago jul. 1999

http://dx.doi.org/10.4067/S0365-94021999000300012 

Estandarización de ELISA IgM e IgA para el inmunodiagnóstico de la triquinosis humana

María del C. Contreras, Elsa Acevedo, Susana Aguilera, Lea Sandoval y Patricia Salinas

Programa de Parasitología. ICBM. Facultad de Medicina. Universidad de Chile. Casilla 9183. Santiago, Chile. Email: ccontrer@machi.med.uchile.cl

Abstract

Standarization of ELISA IgM and IgA for immunodiagnosis of human trichinosis

An ELISA test for trichinosis using as antigen a larvae soluble fraction from Trichinella spiralis was carried out for the detection of IgM and IgA specific antibodies in 45 serum samples from patients confirmed or suspected to have trichinosis by strong clinical and epidemiological evidences. All the patients had positive serology detected by precipitin test, bentonite floculation test, indirect hemagglutination test and ELISA IgG test.

The cut-off value was determined using two criteria. Criterion A was determined in each plate, using three positive controls and two negative ones; the average of the negative controls and the weakest positive control, muliplied by a 1.2 factor was, considered the cut-off value. Criterion B was determinated using the average plus three standard deviations from 64 apparently healthy persons serum samples. In both cases, three serum dilutions (1:10, 1:100 and 1:500) were used.

The sensitivity of ELISA IgM was 100.0, 93.3 and 82.2% using serum dilutions of 1:10, 1:100 and 1:500 respectively (criterion A) and 100.0, 97.8 and 95.6% for the same dilutions (criterion B), whereas the values for ELISA IgA were: 100.0, 91.1 and 86.7% (criterion A) and 100.0, 100.0 and 91.1% (criterion B).

In order to find out the specificity of ELISA IgM and ELISA IgA, additional 118 serum samples from individuals with other parasitoses, such as cysticercosis (18) hydatidosis (39), fascioliasis (12), toxocariasis (30), Chagas' disease (12) and individuals with non-specif eosinophilia (7), were also tested. ELISA IgM presented a specificity of 92.3, 93.4 and 97.3% (criterion A) and 96.2, 97.8 and 97.8% (criterion B) whereas the results for ELISA IgA were 97.8, 98.9 and 99.4% (criterion A) and 98.4% for the 1:10 and 1:100 dilutions and 100.0% for the 1:500 dilution (criterion B).

The positive predictive values of ELISA IgM were 76.3, 77.8 and 88.1% (criterion A) and 86.5, 91.7 and 91.5% (criterion B) whereas the negative ones were 100.0, 98.3 and 95.7% (criterion A) and 100.0, 99.4 and 98.9% (criterion B).

The positive predictive values of ELISA IgA were 91.8, 95.3 and 97.5% (criterion A) and 93.8, 93.8 and 100.0% (criterion B) whereas the negatives ones were: 100.0, 97.8 and 96.8% (criterion A) and 100.0, 100.0 and 97.8% (criterion B).

The use of ELISA IgM and ELISA IgA in the immunodiagnosis of trichinosis is discussed.

Palabras clave (Key words): diagnóstico (diagnosis); triquinosis (trichinosis); ELISA IgM, ELISA IgA.

INTRODUCCION

En Chile la principal fuente de infección de Trichinella spieralis para el hombre es la carne de cerdo, al consumirla en preparados crudos o insuficientemente cocidos. Esta zoonosis tiene carácter endémico, de preferencia en sectores rurales, donde un número no determinado de cerdos se cría y se faena en los domicilios, constituyendo la fuente de brotes epidémicos. La tasa de prevalencia de la triquinosis humana, determinada mediante estudios serológicos, es de un 1,5%, en tanto que la búsqueda de larvas de T. spiralis en autopsias médico-legales de individuos que eran aparentemente sanos, ha oscilado desde un 2,2 a un 0,8% entre 1966 y 1997 (Contreras y col., 1994; Schenone y col., 1997).

El diagnóstico de la triquinosis humana se basa fundamentalmente en la consideración de antecedentes epidemiológicos y clínicos, junto con algunos exámenes de laboratorio, entre los cuales destacan el recuento de eosinófilos y las reacciones inmunobiológicas.

La detección de anticuerpos específicos (Acs) anti T. spiralis ha sido usada ampliamente mediante una serie de pruebas inmunológicas, siendo las más apropiadas aquellas que posean un adecuado valor diagnóstico (Kagan, 1986; Contreras, 1990).

En nuestro laboratorio se han utilizado las reacciones de precipitinas (RP), de floculación con bentonita (RFB), de hemaglutinación indirecta (RHAI) y ELISA IgG. La RP, que es sensible en el período agudo, tiene cierta inespecificidad (Knierim, 1964). Por otra parte, la RFB presenta una especificidad adecuada, detectando Acs a partir de la tercera semana post infección (Kagan y Norman, 1970). La RHAI y la ELISA IgG poseen una adecuada sensibilidad y especificidad (Sandoval y col. 1990, 1995).

El objeto del presente trabajo es estandarizar ELISA IgM y ELISA IgA para el diagnóstico de la triquinosis humana, usando como antígeno una fracción ácido soluble de larvas de T. spiralis delipidizas, con el propósito de contribuir a mejorar el diagnóstico serológico de dicha parasitosis.

MATERIAL Y METODOS

Sueros utilizados

- 45 sueros de personas con infección triquinósica, comprobada clinicamente y con serología positiva determinada mediante RP, RFB, RHAI y ELISA IgG.

- 111 sueros de pacientes con diversas parasitosis (39 con hidatidosis confirmada quirúrgicamente, 18 con neurocisticercosis confirmada clinicamtnee y con serología positiva, 12 con sospecha clínica de fascioliasis comprobada por el hallazgo de huevos del parásito en las deposiciones y/o bilis, y con serología positiva, 30 con sospecha clínica y serología positiva para toxocariasis y 12 con enfermedad de Chagas con xenodiagnóstico y serología positivos).

- 7 sueros de pacientes con eosinofilia de causa no precisada elevada.

- 64 sueros testigos obtenidos de adultos aparentemente sanos.

Antígeno empleado.

Se utilizó la fracción ácido-soluble constituyente del antígeno de Melcher. El procedimiento consiste en una delipidización de larvas liofilizadas de T. spiralis con éter etílico en Soxhlet, durante siete días. El polvo seco se extrae con buffer borato pH 8,3 a una concentración del 1% mantenido durante la noche a 4° C. El sobrenadante obtenido luego de una centrifugación a 10.000 g. por 30 minutos a 4° C, es llevado a pH 4,8 precipitando algunas fracciones proteícas, después de una centrifugación en las mismas condiciones que la anterior. Se obtiene el sobrenadante que es la fracción-soluble a la cual se le midieron proteínas según el método de Bradford (1976), obteniéndose una concentración de 0,6 mg/ml.

Técnica usada.

ELISA.- Se siguió lo descrito para ELISA IgG para triquinosis (Sandoval y col., 1995). En líneas generales consistió en sensibilizar placas de poliestireno con fondo plano (Dynatech) con 100 ml de antígeno diluído en buffer carbonato pH 9,6 0,05M a una concentración de 0,05 mg por pocillo. Las placas se incubaron dos horas a 37° C y por la noche a 4° C, para posteriormente ser lavadas cinco veces en lavador automático Labsystems con el tradicional buffer fosfato salino 0,01M pH 7,2 con Tween 20 a una concentración del 0,05% (PBS-T). Posteriormente, se incubó la placa a 37° C, por una hora, con una solución bloqueadora (leche descremada al 3% en PBS-T), eliminándose el líquido y conservándose a -20° C hasta su uso.

Los sueros fueron diluídos al 1:10, 1:100 y 1:500 en leche descremada-PBS-T, agregándose a los pocillos 100 ml de cada dilución, incubándose y lavándose como se ha descrito. Los conjugados fueron anti IgM y anti IgA humanas-peroxidasa (Sigma) a dilución óptima obtenida de titulaciones previas (1:10000 y 1:5000 para IgM e IgA respectivamente) adicionándose 100 ml a cada pocillo y procediéndose nuevamente a incubar y lavar como se ha descrito.

Se agregaron 100 ml de sustrato (0,04% de ortofenilendiamina y 40 ml de H2O2 al 30% en buffer citrato 0,1M pH 5,0) a los pocillos respectivos, dejándose incubar en la oscuridad por un período de 10 minutos, luego de lo cual la reacción enzimática fue detenida con 50 ml de H2SO4 4M.

La cantidad de color producto de la acción enzimática se determinó mediante la medición de la densidad óptica (DO) a 492nm en un espectrofotómetro Organon Teknika. A las lecturas de la DO de los sueros se les restó la correspondiente al blanco (leche descremada-PBS-T).

Métodos estadísticos

1.- Determinación del valor de corte

Criterio A.- Para analizar la variabilidad de la técnica en cada placa estudiada se usaron como controles tres sueros positivos y dos sueros negativos. El promedio de las lecturas de los dos controles negativos más el de la lectura más baja de los positivos multiplicado por un favor de 1,2 fue considerado el valor de corte (Zicher y col., 1991). Criterio B.- El valor de corte consistió en el promedio de las lecturas de DO obtenidas a 492 nm de los 64 sueros controles más tres desviaciones éstandar.

2.- Determinación del valor diagnóstico

El estudio de la sensibilidad, la especificidad y de los valores predictivos positivo y negativo se realizaron con el programa EPIINFO v. 6.01.

3.- Pruebas estadísticas

La prueba de Fisher permitió comparar los promedios de los sueros controles y los de otras parasitosis respecto al promedio de los sueros con triquinosis, con el fin de determinar si eran estadísticamente significativos.

RESULTADOS

En la Fig. 1 y en la Fig. 2 se muestran las positividades para la ELISA IgM y la ELISA IgA de los 45 sueros de pacientes con triquinosis, usando dos criterios de valor de corte (A y B). Para la ELISA IgM (criterio B) los valores de corte fueron de 1,07, 0,492 y 0,125 para las diluciones 1:10, 1:100 y 1:500 respectivamente y de 0,465, 0,142 y 0,100 en el caso de la ELISA IgA. En líneas generales, se encontró, una mayor positividad al usar el criterio B para ambas inmunoglobulinas y en las tres diluciones empleadas.

Fig. 1. Positividad de la ELISA IgM según los criterios A y B de valor de corte.

Fig. 2 Positividad de la ELISA IgA según los criterios A y B de valor de corte.

Con el fin de evaluar la especificidad de la ELISA IgM y de la ELISA IgA para triquinosis, se examinó un papel de 182 sueros (64 controles, 111 con otras parasitosis y 7 con eosinofilia de causa no precisada elevada) cuyos resultados se exponen en las Tablas I y II respectivamente.

TABLA I

Especificidad de la ELISA IgM para triquinosis en 111 personas con otras parasitosis, 7 con eosinofilia elevada inespecífica y 64 controles aparentemente sanos, usando sueros a diluciones 1:10, 1:100 y 1:500 y dos criterios de valor de corte A y B.


ELISA IgM.
 
Valor de corte A
 
Valor de corte B
 
 

 

Número
 
1:10
1:100
1:500
Grupos examinados

Positivos
Positivos
Positivos
Positivos
Positivos
Positivos
%
%
%
%
%
%

E. de Chagas
12
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Toxocariasis
30
5
16,7
4
13,3
0
0,0
2
6,7
0
0,0
0
0,0
Cisticercosis
18
1
5,6
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Hidatidosis
39
4
10,3
4
10,3
1
2,6
1
2,6
0
0,0
0
0,0
Fascioliasis
12
4
33,3
4
33,3
4
33,3
4
33,3
4
33,3
4
33,3
Eosinofilia
7
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
inespecífica
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Controles
64
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0

TABLA II

Especificidad de la ELISA IgA para triquinosis en 111 personas con otras parasitosis, 7 con eosinofilia elevada inespecífica y 64 controles aparentemente sanos, usando sueros a diluciones 1:10, 1:100 y 1:500 y dos criterios de valor de corte A y B.


ELISA IgA.
   
 
 
Valor de corte A
 
Valor de corte B

 

Número
1:10
1:100
1:500
1:10
1:100
1:500
Grupos examinados

Positivos
Positivos
Positivos
Positivos
Positivos
Positivos
%
%
%
%
%
%

E. de Chagas
12
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Toxocariasis
30
1
3,3
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Cisticercosis
18
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Hidatidosis
39
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
Fascioliasis
12
2
16,7
1
8,3
0
0,0
2
16,7
2
16,7
0
0,0
Eosinofilia
7
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
0
0,0
inespecífida
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Controles
64
1
1,6
1
1,6
1
1,6
1
1,6
1
1,6
0
0,0

Si se consideran en conjunto las reacciones positivas encontradas en las otras parasitosis, en las eosinofilias elevadas inespecíficas y en los sueros controles, la especificidad de la ELISA IgM para triquinosis fue de 92,3, 93,4 y 97,3% para las diluciones 1:10, 1:100 y 1:500 respectivamente según el criterio A de valor de corte, y de 96,2, 97,8 y 97,8% para el criterio de corte B. Dos sueros positivos para toxocariasis y uno para hidatidosis a la dilución 1:10 coincidieron con ambos criterios, en tanto que cuatro sueros positivos para fascioliasis fueron positivos con ambos criterios usados y con las tres diluciones empleadas. En el resto de los sueros positivos, las lecturas de DO estuvieron cercanas a los respectivos valores de corte calculados para cada placa.

En cuanto a la ELISA IgA, presentó un mayor grado de especificidad que la ELISA IgM con un 97,8, 98,9 y 99,4% para las diluciones 1:10, 1:100 y 1:500 respectivamente, según el criterio de corte A y de 98,4% para las diluciones 1:10 y 1:100 y de un 100% para la dilución 1:500, según el criterio B. Un suero control resultó positivo según el criterio A para todas las diluciones, coincidiendo con la positividad según el criterio B en las diluciones 1:10 y 1:100; dos sueros positivos para fascioliasis también coincidieron con ambos criterios en la dilución 1:10.

Los promedios de las lecturas de DO entre los sueros con triquinosis y los sueros controles y con otras parasitosis en las tres diluciones empleadas presentaron diferencias significativas (p<0,01) tanto en la ELISA IgM como en la ELISA IgA.

En las Tablas III y IV, se muestra el valor diagnóstico de la ELISA IgM y de la ELISA IgA, pudiendo apreciarse que el criterio de corte B es el más adecuado en la estandarización de ambas inmunoglobulinas.

TABLA III

Valor diagnóstico de la ELISA IgM para triquinosis humana


Dilucions séricas
Parámetro (%)

 
Valor de corte A
Valor de corte B
 


 
1:10
1:100
1:500
1:10
1:100
1:500

Sensibilidad
100,0
93,3
82,2
100,0
97,8
95,6
Especificidad
92,3
93,4
97,3
96,2
97,8
97,8
Valor predictivo
 
 
 
 
 
 
positivo
76,3
77,8
88,1
86,5
91,7
91,5
Valor predictivo
 
 
 
 
 
 
negativo
100,0
98,3
95,7
100,0
99,4
98,9

TABLA IV

Valor diagnóstico de la ELISA IgA para triquinosis humana


 Dilucions séricas     
 
 
 
 
 
 
 
Parámetro (%) 

 
Valor de corte A 
 Valor de corte B  
 


 
1:10
1:100
0.388889
1:10
1:100
1:500

Sensibilidad
100,0
91,1
86,7
100,0
100,0
91,1
Especificidad
97,8
98,9
99,4
98,4
98,4
100,0
Valor predictivo
 
 
 
 
 
 
positivo
97,8
95,3
97,5
93,8
93,8
100,0
Valor predictivo
 
 
 
 
 
 
negativo
100,0
97,8
96,8
100,0
100,0
97,8

DISCUSION

Los resultados expuestos indican que tanto la ELISA IgM como la ELISA IgA son adecuadas en el diagnóstico de la triquinosis humana.

Las sensibilidades de la ELISA IgM y de la ELISA IgA encontradas con ambos criterios de valor de corte (A y B), demuestran la apropiada capacidad inmunogénica de la fracción ácido soluble de larvas de T. spiralis en el reconocimiento de Acs específicos.

En la literatura se describen sensibilidades variables para ELISA IgM, las que según el tiempo de la infección transcurrido, varían entre 12,5% a los 23 días y 100% a los dos meses. Generalmente, las diversas sensibilidades encontradas pueden explicarse según el antígeno empleado, los valores de corte utilizados, el tiempo transcurrido post infección y el número de larvas ingeridas por el huésped (van Knappen y col., 1982; Au y col., 1987; Morakote y col., 1991), además de los valores de cortes utilizados.

Para ELISA IgA, van Knappen y col. (1982) encontraron una sensibilidad del 62% al mes de infección. Debido a que el presente trabajo es de estandarización se emplearon sueros positivos para la RP, RFB, RHAI y ELISA IgG. Como la RFB se hace positiva alrededor de la tercera semana postinfección por larvas de T. spiralis (Kagan y Norman, 1970), todas las muestras de suero utilizadas tenían alrededor de ese tiempo o más post infección.

Mientras más cercana sea la proximidad filogenética entre los parásitos, mayor es la probabilidad de encontrar reacciones cruzadas (Ambroise-Thomas, 1986), sobre todo al usar fracciones antigénicas crudas o parcialmente purificadas. Diversos autores han encontrado reacciones cruzadas entre antígenos de T. spiralis y Acs específicos de otros helmintos (De la Rosa y col., 1995; Bitkowska, 1996). Sin embargo, debido a la tasa de 1,5% de prevalencia serológica encontrada en Chile, tampoco se puede descartar una infección multiparasitaria (Contreras y col., 1994).

Los resultados del valor diagnóstico de la ELISA IgM y de la ELISA IgA para triquinosis indican que se obtiene un mayor rendimiento al aplicar el criterio de corte B y que entre ambas inmunoglobulinas se consiguen mejores resultados con la IgA. La detección de Acs específicos de la clase IgA sería de importancia clínica ya que indicaría la etapa de infección intestinal por el parásito, puesto que esta inmunoglobulina es producida localmente en el intestino del huésped, pudiendo ser detectada en la circulación como resultado de la estimulación por los parásitos adultos (van Knappen y col., 1982).

REFERENCIAS

Ambroise-Thomas, P. 1986. Inmunoparasitología: Origen, Estado Actual y Perspectivas. Bol. Of. Sanit. Panam. 101: 247-253.         [ Links ]

Au, A.C.S., Ko, R.C., Simon, J.W., Ridell, N.J., Wong, T.W.T. and Templer, M.J. 1983. Study of acute trichinosis in Ghurkas. Specificity and sensitivity of enzyme-linked immunosorbent assay for IgM and IgE antibodies to Trichinella larval antigens in diagnosis. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg. 77: 412-415.         [ Links ]

Bitkowska, S. 1996. Phosphocholine antigens in muscle larvae of Trichinella spiralis Wiad. Parazytol. 42: 57-63.         [ Links ]

Bradford, M.M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of proteindye binding. Anal. Biochem. 72: 248-264.         [ Links ]

Contreras, M. del C. 1990. Inmunodiagnóstico de las parasitosis humanas II. Su uso en protozoosis y helmintiasis. Bol. Chile. Parasitol. 45: 61-72.         [ Links ]

Contreras, M. del C., Schenone, H., Sandoval, L. y García, M. 1994. Epidemiología de la triquinosis en Chile. Estudio de la prevalencia mediante reacciones inmunodiagnósticas. Bol. Chil. Parasitol. 49: 73-74.         [ Links ]

De la Rosa, J. L., Alcántara, P and Correa, D. 1995. Investigation of cross-rections against Trichinella spiralis antigens by enzyme-linked immunosorbent assay and enzyme-linked immunoelectrotransfer blot assay in patients with various diseases. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2: 122-124         [ Links ]

Kagan, I.G., and Norman, L. 1970. The serology of Trichinosis. In: Trichinosis in Man and Animals. Ed. S.E. Gould Springfield. Illinois. Charles C. Thomas. pp. 222-238.         [ Links ]

Kagan, I.G. 1986. Serodiagnosis of parasitic diseases. In: Manual of Clinical Laboratory Immunology. 3th Ed. Noel R. Rose, Herman Friedman and John Faberg. American Society for Microbiology. Washington, D.C. pp. 467-496.         [ Links ]

Knierim, F. 1964. El valor de las reacciones serológicas en el diagnóstico de algunas infecciones parasitarias. Bol. Chil. Parasitol 19: 119-123.         [ Links ]

Morakote, N., Khamboonruang, C., Siriprasert, V., Suphawitayanukul, S., Marcanantachoti, S. and Thamasonthi, W. 1991. The value of enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for diagnosis of human trichinosis. Trop. Med. Parasitol. 42: 172-174.         [ Links ]

Sandoval, L., Pérez, S. y Contreras, M. del C. 1990. La reacción de hemaglutinación indirecta en el diagnóstico de la triquinosis. Bol. Chil. Parasitol. 45: 80-83.         [ Links ]

Sandoval, L., Salinas, P., Rugiero, E. y Contreras, M. del C. 1995. Valor diagnóstico de la ELISA IgG para triquinosis usando antígeno de Melcher. Bol. Chil. Parasitol. 50: 92-96.         [ Links ]

Schenone, H. López, R., Barilari, E., Contreras, M. del C. y Castillo, D. 1997. Tendencia actual de la triquinosis humana en Chile. Bol. Chil. Parasitol. 52: 22-25.         [ Links ]

Van Knappen, F., Franchiment, J.H., Verdone, A. R., Stumf, J and Undeutsch, K. 1982. Detection of specific immunoglobulins (IgM, IgA, IgE) and total IgE levels in human trichinosis by means of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA ). Am. J. Trop. Med. Hyg. 31: 973-976.         [ Links ]

Zicher, F., Smith, P.G., Luquetti, A. O. y Oliveira, O.S. 1991 Detección de infectados por Trypanosoma cruzi mediante inmunofluorescencia, ELISA y hemaglutinación en sueros y eluídos de sangre seca. Bol. Of. Sanit. Panam. 110: 489-498.         [ Links ]