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Boletín chileno de parasitología

versión impresa ISSN 0365-9402

Bol. chil. parasitol. v.54 n.3-4 Santiago jul. 1999

http://dx.doi.org/10.4067/S0365-94021999000300004 

Estudio de la respuesta inmune humoral en cerdos infectados con huevos y posoncosferas de Taeina solium

Gloria Rojas Wastavino, Patricia Tato Zaldívar, Sandra Solano Galvez, Luis Herrera Montalvo, Manuel
Gutiérrez Quiroz y Paz Salazar Schettino.

Departamento de Microbiología y Parasitología. Facultad de Medina. Universidad Nacional Autónoma de
México. C.P. 04510. México, D.F. México.

Abstract

Study on immune humoral response in pigs infected with eggs and posoncospheres of Taenia solium

Due to the importance of cysticercosis in Mexico and Latin America and to the fact that in the last years another mechanism of infection for this disease has been proposed, i.e. through postoncospheres and immunosuppression of the host, we have considered relevant to perform the present work, which consisted in assessing the immune response induced by dexamethasone as well as that produced by parasites in pigs infected with T. solium eggs, or postoncosphere-infected, and in postoncosphere-infected and dexamethasone-treated animals.

We used 10 recently weaned pigs, three were used as controls, two of them without the drug and one with it; two were infected with T. solium eggs; five with postoncospheres receiving also dexamethasone three of them. We evaluated the humoral response against parasite antigen using indirect haemagglutination (IH) and ELISA methods

Results of the immune humoral response revealed titres of up to 1:128 in T. solium eggs infected animals, of 1:16 in postoncosphere infected animals, and of 1:32 towards the end of the experiment in postoncosphere plus dexamethasone animals. Absorbance titres with ELISA confirmed these findings. Data obtained by IH show that the antibody titres of the pigs challenged with postoncospheres and postoncospheres plus dexamethasone are positive as compared to the titres obtained in the pigs infected with T. solium eggs. Results from the ELISA confirmed this finding, since, from weeks 14 to 17, the pigs became positive, behaving as those pigs that developed cysticercosis. This is relevant as it indicates that the antiposcosphere antibodies recognized antigens of T. solium larvae.

Palabras clave (Key words): cisticercosis (cysticercosis); inmunosupresión (immunosuppression); cerdos (pigs); dexametosona (dexamethasone).

INTRODUCCION

La forma larvaria o metacéstodo de Taenia solium, causa en el hombre un problema de salud pública ya que estos parásitos pueden producir enfermedad severa e incapacitante. La cisticercosis humana afecta principalmente el sistema nervioso central aunque se han encontrado parásitos prácticamente en todos los órganos y tejidos del cuerpo, es la parasitosis más común que afecta al sistema nervioso central y uno de los problemas neuropatológicos más frecuentes en México y otros países en vía de desarrollo (Escobar, 1989).

La enfermedad está ampliamente distribuida, encontrándose casos en países de: Africa (Onah y Chiejina, 1995); Asia (Fan y col., 1994); Theis y col., 1994; Malnick y Geltner, 1996). Norteamérica (Moore y col., 1995), y Sudamérica (Schenone, 1989); Ferreira y col., 1994; Levav y col., 1995 , Agapejev, 1996; 1996; Salinas y col., 1996). En México se encuentran registros sobre el conocimiento del binomio teniosis-cisticercosis desde el siglo pasado (Carrada, 1991). En estudios realizados, e el Hospital General de México, entre 1953 y 1984, se encontraron 481 casos de cisticercosis, en 189 de ellos, ésta parasitosis fue la causa principal de muerte, (Uribe y Olvera, 1988). Estudios epidemiológicos, realizados en el Estado de Morelos, indican que el 0,3% de la población humana estudiada presentó infección por huevos de T. solium y serológicamente el 10,8% fue positiva a cisticercosis, la revisión de la lengua de los cerdos demostró que el 4% estaba parasitado (Sarti y col., 1992). Finalmente, en una investigación llevada a cabo en 18 pueblos en la que la cisticercosis porcina es endémica, en el Estado de Guerrero, la positividad en los cerdos estuvo en el rango de 1,0% a 5,4% (Molinari y col., 1993).

Llama la atención el hecho de que el número de casos de teniosis solium es más reducido en comparación con los de teniosis saginata, como también de que el porcentaje de cisticercosis, es mayor que el de teniosis solium, ambas situaciones fueron reportados por Mazzotti (1944), la hipótesis manejada para tratar de explicar este hecho es la ingestión de carne procedente de cerdos que estuvieran desarrollando la cisticercosis y que al sacrificarlos y consumirlos tuvieran formas intermedias entre oncosfera y metacéstodo con capacidad infectante. No obstante la existencia de control en los rastros establecidos, el consumo de carne procedente de cerdos sacrificados en rastros clandestinos o en casas particulares es una realidad, por lo que existiría mayor peligro de que en estos productos hubieran formas embrionarias microscópicas que podría estar produciendo la cisticercosis que tanto llama la atención en cuanto a su frecuencia en México y otros lugares del mundo. En dos investigaciones, para comprobar esta hipótesis, se llevaron a cabo los siguientes estudios: en el primero se usó un lote de cerdos inmunosuprimidos con prednisona, para infectarlos más tarde con posoncosferas de carne cisticercosa decomisada de rastro y otro lote con posoncosferas de carne de cerdos infectados con huevos de T. solium. Los hallazgos reportados demostraron la presencia de cisticercos, en diversos grados de evolución, en un cerdo (Salazar y col., 1984). En el segundo estudio los animales se infectaron de la misma forma pero esta vez se usaron dos fármacos: dexametasona y ciclofosfamida, en este caso el 30% de los cerdos presentó cisticercosis (Salazar, 1987).

Sobre la base de estos resultados y debido al hecho de que no se tenía evidencia sobre el comportamiento de la respuesta inmune, en los cerdos infectados con posoncosferas ni en la provocada por los fármacos usados, que estarían favoreciendo la infección con posoncosferas, se planteó esta investación con objetivo de evaluar la respuesta inmune humoral en los cerdos con estas variables.

MATERIAL Y METODOS

Animales

Se usaron diez cerdos de 30 días, raza York-Landrace y se mantuvieron en condiciones óptimas de alimentación durante todo el experimento. Antes de comenzar el estudio se les tomó una muestra de sangre para determinar la presencia de anticuerpos específicos contra metacéstodos de T. solium.

Obtención de huevos de T. solium.

Habiendo realizado la deteminación de la especie de T. solium a través del conteo de las ramas uterinas en proglótidos grávidos de acuerdo al método descrito por De Haro y col. (1995), éstos se colocaron en solución salina isotónica estéril y con agujas de disección y pinzas sin dientes se procedió a extraer los huevos, comprobada su integridad se contaron en cámara de Neubauer

Obtención de las posoncosferas.

Se utilizaron 400 gramos de carne cisticercosa que se cortaron en trozos pequeños y se colocaron en fracos de boca ancha con solución salina isotónica estéril; se dejaron en refrigeración durante 16 horas a 5°C. Al término de este tiempo se filtraron a través de cuatro capas de gasa, el líquido se centrifugó por 5 minutos a 2.000 rpm; se decantó el sobrenadante y se tomó un muestra del sedimento, diluyéndose con lugol para al observación y conteo de las posoncosferas en el hemocitómetro.

Esquema de inmunodepresión en los cerdos.

El esquema de inmunodepresión que se utilizó en los cerdos para facilitar la infección por posoncosferas y su desarrollo hasta la fase de metacéstodo, se llevó a cabo en tres cerdos que fueron inyectados por vía intramuscular con dexamatasona a razón de dos dosis semanales durante ocho semanas, las dosis fueron en aumento en relación al incremento de peso y edad de los animales (ver infección de los animales).

Se incluyó un animal testigo inmunodeprimido y no infectado.

Infeción de los animales

Dos animales, una hembra y un macho, amrcados con las letras C y D fueron infectados con una dosis única de 50.000 huevos de T. soluim, por vía oral, resuspendidos en solución salina isotónica.

Otros dos animales una hembra y un macho marcados con las letras E y F fueron infectados con posoncosferas, contenidas en el sedimento de 400 g de carne cisticercosa (44x106) por vía oral, dos veces por semana y durante ocho semanas.

Tres cerdos más, dos machos y una hembra marcados con las letras G, H e I fueron infectados con posoncosferas, con las mismas dosis que los cerdos del grupo anterior, al mismo tiempo fueron inyectados por vía intramuscular con dexametasona, dos veces por semana, durante ocho semanas, comenzando con una dosis de 60 mg/kg e incrementándola hasta 360 mg/kg.

Se incluyeron, además dos cerdos sanos una hembra y un macho marcados con las letras A y B como testigos que no recibieron ningún tratamiento ni fueron infectados, mientras que el testigo inmunodeprimido fue marcado conla letra J.

Evaluación de la respuesta inmune humoral.

La respuesta inmune humoral, se evaluó por el método de hemaglutinación indirecta (HI), usando cuatro antigenos obtenidos de cisticercos de T. solium: antígeno somático completo (ASC), antígeno somático incompleto (ASI), antígeno de fluído vesicular (AFV) y antígeno de excreciones y secreciones (AES). Los ASC y ASI se prepararon por el método de sacarosa - acetona descrito por Beltrán y col. (1974). El AFV se preparó a partir de cisticercos completos, se extrajo el líquido vesicular, se centrifugó a 10.000 rpm por 15 minutos y se determinó la concentración de proteínas por el método de Lowry (1951), la concentración de proteínas se ajustó a 3 mg/ml. Para la obtención de los antígenos de excreciones y secreciones (AES), los cisticercos se incubaron durante 22 horas a 37°C en solución salina isotónica, durante este tiempo los cisticercos liberaron metabolitos con propiedades antigénicas al medio en que se encontraban, se retiraron y en la solución de incubación se determinó la concentración de proteínas, ajustándose éstas a 3 mg/ml. y por el método de ELISA, usando una dilución de 1:300 (Molinari y col., 1993).

Al término de la fase de experimentación, todos los animales se sacrificaron, con choque eléctrico.

Durante la necropsia, se hizo una minuciosa revisión macroscópica de cada animal, para la búsqueda de cisticercos. Al mismo tiempo, se tomaron porciones de 250 g o menos según el órgano o tejido, de cerebro, lengua, espaldillas, músculos intercostales, piernas, corazón y pulmones, para la cuantificación de cisticercos y búsqueda en fresco y por histopatología de posoncosferas.

RESULTADOS

En la Tabla I se obaesrva qu elos cerdos infecatos con huevos de Taenia solium (C y D) mostraron títulos positivos de la HI desde la sexta semana y de hasta 1:128 con el AFV. Al sacrificarlos 4 meses después de la infección, se observó una mayor carga parasitaria en la hembra infectada, ya que se encontraron 2.500 cisticercos mientras que en el macho 206.

TABLA I

Título de anticuerpos determinados por
hemaglutinación indirecta de los cerdos infectados
con huevos de T. solium (C y D).


Semanas ASC ASI   AFV   AES 

  C D C D C D C  D

0 1:2 1:4 1:2 1:2 1:4 1:2 1:4 1:2
6 1:4 1:4 1:8 1:8 1:8 1:16 1:4 1:8
11 1:4 1:4 1:4 1:8 1:8 1:16 1:4 1:8
14 1:4 1:4 1:4 1:8 1:8 1:128 1:8 1:8
16 1:4 1:16 1:4 1:8 1:8 1:128 1:8 1:8
17 1:8 1:16 1:8 1:16 1:16 1:128 1:16 1:16

En la Tabla II se muestran los resultados de la HI, de los dos cerdos que fueron infectados con posoncosferas (E y F), los cuales fueron negativos hasta la semana 16. En la última semana al cumplirse cuatro meses de infección, uno de ellos presentó títulos considerados positivos (1.16), mismo título presentado por uno de los cerdos infectado con huevos de T. solium.

TABLA II

Título de anticuerpos determinados por
hemaglutinación indirecta de los cerdos infectados
con pononcosferas sin dexametasona (E y F).


Semanas ASC ASI   AFV   AES 

  E F E F E F E F

0 1:4 1:4 1:2 1:2 1:4 1:4 1:4 1:4
6 1:8 1:8 1:4 1:4 1:8 1:8 1:4 1:8
11 1:4 1:4 1:2 1:2 1:4 1:4 1:4 1:4
14 1:8 1:8 1:4 1:4 1:8 1:8 1:4 1:4
16 1:8 1:8 1:4 1:4 1:8 1:8 1:4 1:4
17 1:16 1:8 1:8 1:8 1:16 1:8 1:16 1:8

TABLA III

Título de anticuerpos determinados por hemaglutinación indirecta de los cerdos infectados con
posoncosferas e inmunosuprimido con dexametasona (GH e I).


Semanas ASC  ASI   FV     ES  
 
  G H I G H I G H I G H

0 1:4 1:2 1:4 1:2 1:2 1:2 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4
6 1:8 1:4 1:4 1:4 1:2 1:2 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4
11 1:8 1:4 1:4 1:2 1:2 1:2 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:8
14 1:8 1:4 1:4 1:2 1:2 1:2 1:4 1:4 1:4 1:4 1:4 1:8
16 1:16 1:8 1:8 1:8 1:8 1:4 1:16 1:16 1:8 1:8 1:16 1:8
17 1:32 1:16 1:16 1:16 1:8 1:8 1:32 1:32 1:16 1:16 1:32 1:8

En la Tabla III se observan los resultados de los títulos de anticuerpos de los tres cerdos inmunosuprimidos con dexametasona e infectados con posoncosferas (G, H e I); aunque estos animales no desarrollaron la cisticercosis, la serología muestra títulos de anticuerpos positivos a todos los antígenos en la última semana, antes del sacrificio.

Los dos cerdos testigos (A y B) a los que no se les aplicó nada, así como el cerdo testigo inmunosuprimido con dexametasona (J), presentaron títulos negativos, con ambos métodos, durante toda la fase experimental.

En la Fig. 1 se muestran los títulos de anticuerpos de los sueros de los cerdos sometidos a los diferentes tratamientos cuantificados por ELISA durante la semana 17, tiempo en el que todos los títulos de anticuerpos de los animales problema se encontraron sobre la línea de corte. Es importante observar que dos de los tres cerdos infectados con posoncosferas e inmunosuprimidos con dexametasona se comportaron como uno de los cerdos que desarrolló la cisticercosis.

Fig. 1. Valores de absorbancia, en ELISA de los sueros de los cerdos tratados con respecto al control.

En la Fig. 2 se ilustra la cinética del incremento del promedio de los valores de los títulos de anticuerpos de los sueros de los cerdos infectados con huevos de T. solium y del promedio de los valores de los títulos de anticuerpos de los tres animales infectados con posoncosferas e inmunosuprimidos con dexametasona, aunque el incremento de estos últimos es menor con respecto a los cerdos que desarrollaron la cisticercosis.

Fig. 2. Cinética del incremento del promedio de los valores de los títulos de anticuerpos de los sueros de los cerdos infectados con huevos de T. solium y del promedio de los valores de los títulos de anticuerpos de los tres cerdos infectados con posoncosferas más dexametasona.

DISCUSION

Los datos obtenidos por HI muestran que los títulos de anticuerpos de los lotes de cerdos desafiados con posoncosferas y con posoncosferas más dexametasona, son positivos, al igual que los títulos de anticuerpos obtenidos de los cerdos infectados con huevos de T. solium, los primeros se positivizan al final del experimento hacia la semana 16, a diferencia de los inoculados con huevos que se positivizaron, en la hembra a partir de la sexta semana y el macho a partir de la semana 14.

Estos nos indica que los anticuerpos en los cerdos infectados con huevos aparecen más tempranamente que los de los cerdos infectados con posoncosferas. Se observó una diferencia en la aparición de los anticuerpos entre la hembra y macho, que pudiera estar relacioda con la carga parasitaria ya que la hembra tuvo una parasitemia mayor que el macho.

Los datos de los resultados obtenidos por ELISA están en concordancia con los obtenidos por HI en el grupo de animales infectados con posoncosferas más dexametasona, ya que en la semana 17 los cerdos se positivizaron comportándose como uno de los cerdos que desarrolló la cisticercosis, esto es importante ya que está indicandoque los anticuerpos anti-posoncosferas reconocen antígenos de las larvas de T. solium.

Por otro lado, no se desarrolló cisticercosis en los animales infectados con posoncosferas (con o sin dexametasona), consideramos que el corticosteroide no debe haber producido en estos animales, un estado de inmunosupresión que pudiera favorecer el desarrollo de las posoncosferas hasta metacéstodo como se ha mostrado en otros estudios utilizando otros fármacos como prednisona y ciclofosfamida (Salazar y col., 1984, 1987), aunque, las dosis del corticosteroide usadas en esta investigación, son las reportadas en experimentos realizados en cerdos y otros animales (Minton y Blecha, 1991). Algunos autores sugieren que el efecto de los corticosteroides está en relación a la edad y a la sensibilidad de algunos animales a éstos (Saulnier y col., 1991; Oldham y Howard, 1992).

Se sugiere que la evaluación de los efectos de corticosteroides como la dexametasona se deben hacer en tiempos más cortos, cada ocho horas, por ejemplo, ya que los animales muestran recuperaciones transitorias aunque las inyecciones sean diarias y contínuas, o puede suceder que el cerdo sea mucho más resistente a la inmunodepresión por corticoides que el ganado bovino, ya que dosis tan bajas como 0,04 mg/kg logran alterar las funciones de linfocitos y neutrófilos (Saulnier col., 1991).

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