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Agricultura Técnica

versión impresa ISSN 0365-2807

Agric. Téc. v.61 n.4 Chillán oct. 2001

http://dx.doi.org/10.4067/S0365-28072001000400003 

DIVERSIDAD BIOQUÍMICA Y MOLECULAR EN FRUTILLAS
CHILENAS (Fragaria chiloensis L. Duch.) Y SU IMPLICANCIA
EN EL MEJORAMIENTO GENÉTICO DE LA ESPECIE1

Biochemical and molecular diversity in Chilean strawberries
(Fragaria chiloensis L. Duch.) and its implication for genetic
improvement of the species

Viviana Becerra V.2, Mario Paredes C.2, Agnes Romero O.2, Arturo Lavín A.3

1 Recepción de originales: 22 de mayo de 2000.
Investigación financiada por el Proyecto FONDECYT Nº 1980166.
2 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación Quilamapu, Casilla 426, Chillán, Chile. E-mail: vbecerra@quilamapu.inia.cl
3 Instituto de investigaciones Agropecuarias, Centro Experimental Cauquenes, Casilla 165, Cauquenes, Chile.

ABSTRACT

The Chilean wild strawberry (Fragaria chiloensis L. Duch.) is a native species of Chile that was domesticated before the arrival of the Spanish. This species is one of the progenitors of the commercial strawberry (F. x ananassa), and is widely distributed throughout the country in variable agroecological systems. Apparently, these diverse habitats have forced this species to develop a high variability of morphological and agronomic traits. The objectives of this work were: a) to determine the genetic diversity of a representative sample of the Chilean strawberry using biochemical and molecular markers; b) to compare this information by random amplified polymorphic DNA (RAPD) diversity within the same accessions; and c) to determine the feasibility of using this information for a breeding improvement program. Eighty-three Chilean wild accessions were analyzed by three isozyme systems, glucose phosphate isomerase (GPI), leucine amino peptidase (LAP) and phosphoglucomutase (PGM), and sixty-one of them were analyzed by amplified fragment length polymorphism (AFLP). The results indicated a low level of genetic diversity, only a few accessions were polymorphic for LAP and GPI. The AFLP analysis also detected a low level of polymorphism among the accessions evaluated. The results and their implications for future genetic improvement of the species are discussed.

Key words: isozyme, AFLP marker, genetic diversity.

RESUMEN

La frutilla chilena (Fragaria chiloensis L. Duch.) es una especie nativa de Chile que fue domesticada antes de la llegada de los españoles. Esta especie es uno de los progenitores de la frutilla cultivada (F. x ananassa) y se encuentra distribuida en una amplia zona del país, colonizando diferentes sistemas agroecológicos. Aparentemente, en estos diversos hábitats se han desarrollado diferentes ecotipos que presentan una gran diversidad de características morfológicas y agronómicas. Los objetivos del trabajo fueron: a) determinar la diversidad genética de una muestra representativa de frutillas chilenas usando marcadores bioquímicos y moleculares; b) comparar la información previamente generada por la amplificación de ADN polimórfico al azar (RAPD) en las mismas accesiones; y c) determinar el posible uso de esta información en un programa de mejoramiento de la especie. En este trabajo se analizaron 83 accesiones silvestres con los sistemas enzimáticos fosfoglucosa isomerasa (GPI), leucina aminopeptidasa (LAP), y fosfoglucomutasa (PGM) y 61 accesiones mediante la amplificación de fragmentos polimórficos (AFLP). Los resultados del estudio enzimático indicaron una baja diversidad genética y sólo algunos genotipos fueron polimórficos para LAP y GPI. Los resultados de AFLP detectaron también un bajo nivel de polimorfismo entre las accesiones analizadas. Se discuten estos resultados y sus implicaciones sobre el mejoramiento genético de la especie.

Palabras clave: isoenzima, marcador AFLP, diversidad genética.

INTRODUCCIÓN

La frutilla silvestre, Fragaria chiloensis L. Duch., también llamada frutilla de la costa de Chiloé, es una especie nativa de Chile, que se encuentra distribuida desde el círculo ártico en el oeste de Norte América hasta el extremo más austral de Chile y Argentina (Bringhurst, 1990; Hancock, 1990).

La frutilla chilena (Fragaria chiloensis) y F. virginiana son los progenitores de la frutilla comercial (F. x ananassa). Ambas especies son predominantemente diocas, aunque existe algún porcentaje variable de plantas hermafroditas (Hanckock y Luby, 1993), lo cual contribuye a la alta heterocigocidad de la frutilla cultivada. Debido a esta situación, el proceso de consanguinidad afecta negativamente a la planta, lo que se manifiesta en la rápida pérdida de vigor, rendimiento y tamaño del fruto (Morrow y Darrow, 1952).

Fragaria chiloensis y F. virginiana son especies octoploides (2n=8x=56), producto de antiguos procesos de poliploidización y selección, actualmente altamente diploidizadas (Bringhurst, 1990). Basados en estos antecedentes, se ha propuesto recientemente una nueva estructura genómica para esta especie, 2A2A`2B2B` (Bringhurst, 1990) en reemplazo de AAA’Â’BBB’B’ propuesta anteriormente por Senanayake y Bringhurst (1967).

Fragaria chiloensis y F. virginiana están distribuidas sólo en el hemisferio occidental, aunque se postula que la primera especie octoploide se originó en Asia Oriental, y desde allí se habría diseminado hacia Norte América a través del estrecho de Bering. Por otro lado, el origen de la frutilla chilena es poco claro, aunque se presume que fue introducida desde Norte América por aves migratorias. En Chile la especie se ha distribuido en diversas zonas agroecológicas, desarrollando adaptaciones específicas para esos ambientes. Aparentemente, la F. chiloensis presente en Chile es más adaptativa que la norteamericana, ya que se encuentra colonizando un mayor rango de situaciones agroclimáticas, en comparación con la totalidad de la zona geográficas ocupadas por F. chiloensis y F. virginiana en Norte América (Hancock et al., 1999).

La frutilla chilena tiene una larga historia de cultivo en nuestro país. Ha sido utilizada por más de 1.000 años por los aborígenes chilenos mapuches y picunches. Se estima que los picunches fueron los primeros habitantes que domesticaron esta especie en América, ya que antes de la llegada de los españoles era cultivada en el centro y sur del país (Hancock et al., 1999). Durante la conquista, los españoles se encargaron de diseminar esta especie a varios países de Norte y Sudamérica, especialmente a Perú, Colombia, Ecuador y posteriormente a Europa, donde dio origen a la actual frutilla cultivada (F. X ananassa). En 1766, Nicholas Duchesne determinó que la frutilla cultivada era un híbrido entre F. chiloensis y F. virginiana (Hancock et al., 1999).

La amplia adaptación de F. chiloensis chilena a una gran variedad de condiciones agroecológicas y climáticas, y su aparente diferenciación a la F. chiloensis norteamericana, hacen suponer la presencia de una gran diversidad genética, que podría ser fuente de genes para los programas de mejoramiento genético de la especie o del híbrido cultivado. Esta hipótesis es apoyada fuertemente por la gran diversidad morfológica y agronómica detectada en las diversas evaluaciones del germoplasma colectado en Chile (Hancock, 1990, Cameron et al., 1993).

La evaluación del material de frutilla se ha realizado principalmente sobre características hortícolas, morfológicas y fisiológicas. Este tipo de evaluaciones está sujeto a una fuerte influencia ambiental, por lo tanto, es necesario completar esta caracterización con otro tipo de marcadores, como son los bioquímicos y moleculares, que puedan ayudar a complementar la información genética presente en la especie.

En frutillas, el uso de las isoenzimas ha estado dirigido principalmente a la identificación de cultivares y a la caracterización de la diversidad genética presente en la frutilla norteamericana y europea (Bringhurst et al., 1981, Nehra et al., 1991, Greco y Martelli, 1993, Bell y Simpson, 1994). El número de sistemas usados en este tipo de trabajos ha sido bastante reducido, debido a que algunos sistemas no presentan polimorfismo, y otros presentan inconsistencia en los patrones isoenzimáticos obtenidos (Bell y Simpson, 1994). Los sistemas más usados han sido glucosa fosfato isomerasa (GPI), leucina amino peptidasa (LAP) y fosfo glucomutasa (PGM) (Arulsekar et al., 1981, Bringhurst et al., 1981, Nehra et al., 1991, Greco y Martelli, 1993, Bell y Simpson, 1994).

Actualmente, los marcadores moleculares presentan un mayor poder de resolución que los marcadores bioquímicos, por lo tanto, presentan varias ventajas para identificar y caracterizar individuos altamente emparentados (Vos et al., 1995, Sharma et al., 1996, Hill et al., 1996). Entre los marcadores moleculares disponibles con mayor poder de resolución y reproducibilidad están, los fragmentos de amplificación polimórficos (AFLP) que son de herencia dominante, usan una mínima cantidad de ADN y detectan un gran número de loci (50-100) por reacción, comparado con la amplificación de ADN polimórfico al azar (RAPD). La técnica combina los principios de los fragmentos de restricción polimórficos (RFLP) y de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), donde primeramente se digiere el ADN con enzimas de restricción y luego se generan los AFLPs por amplificación selectiva.

Los objetivos de este trabajo fueron: a) determinar la diversidad genética de una muestra representativa de frutillas chilenas usando isoenzimas y AFLP; b) comparar la información generada con RAPD; y c) determinar el posible uso de esta información en un programa de mejoramiento genético de la especie.

MATERIALES Y MÉTODOS

Las accesiones de frutilla chilena silvestre analizadas fueron colectadas entre las Regiones VII y XI por el Instituto de Investigaciones Agropecuarias (INIA) (Cuadro 1). De este germoplasma se han seleccionado algunos genotipos con características agronómicas superiores para iniciar un programa de mejoramiento.

Análisis isoenzimático
Extracción de la proteína total

La proteína total se obtuvo a partir de hojas apicales en crecimiento activo. Las hojas fueron cosechadas, transportadas y almacenadas a 4ºC por un máximo de tres días antes de ser procesadas. Un total de 83 accesiones y cinco individuos por accesión (Cuadro 1) fueron analizados, también se incluyeron accesiones de F. virginiana (1) y F. x anannassa (2). Aproximadamente 0,5 g de cada muestra fue macerada en un mortero con el tampón de extracción (Tris-citrato, pH 7,5; cisteína hidroclorídrica, 0,1%; polietilenglicol y ácido ascórbico (0,1%); polivinilpolipirrolidona). Para evitar la denaturación de las proteínas, el proceso de extracción se realizó a baja temperatura, colocando el mortero sobre hielo.

Cuadro 1. Accesiones chilenas analizadas con isoenzimas y amplificación de fragmentos polimórficos (AFLP).
Table 1. Chilean accessions analyzed by isozymes and amplified fragment length polymorphism (AFLP).

Accesión

Lugar

Provincia

Latitud sur

Longitud oeste

Altitud
m.s.n.m.

Fragaria chiloensis L. Duch

2COC9A

* Laguna Larga

Cap. Prat

47°28’

72°55’

366

2COC3A

* San Lorenzo

Cap. Prat

47°33’

72°30’

366

2MAL2A

* ª Mallín Grande

Gral. Carrera

46°08’

72°06’

351

2BAL1B

* ª Balmaceda

Aisén

45°52’

71°51’

530

2TAP1A

* La Tapera

Aisén

44°40’

71°58’

s/i

2TAP3A

* ª La Tapera

Aisén

44°40’

71°45’

s/i

2TAP4A

* ª La Tapera

Aisén

44°38’

71°39’

s/i

2PAL2A

* ª Río El Salto

Chiloé

43°30’

71°55’

183

2PAL3A

* ª Palena

Chiloé

43°35’

71°45’

s/i

2FUT4A

* ª Futaleufú

Chiloé

43°08’

71°40’

s/i

2CAM1A

* ª Río Camahueto

Chiloé

42°50’

72°53’

2

2BRA1A

* ª Mar Brava

Chiloé

41°50’

73°55’

2

2QUI2A

* Quildaco

Chiloé

41°51’

72°43’

s/i

2LTS1A

*ª Lago T. Los Santos

Osorno

41°14’

72°45’

229

3PUY1A

*ª Paso Card. Samoré

Osorno

40°44’81"

72°05’59"

1060

3PUY3A

* Puyehue

Osorno

40°41’07"

72°01’02"

1050

3NIE1A

* ª Niebla

Valdivia

39°47’59"

73°23’24"

30

3FLO2A

* ª Tres Chiflones

Valdivia

40°02’80"

73°10’49"

360

3MAI1A

* ª Lago Maihue

Valdivia

40°12’44"

72°08’29"

s/i

3ICA4A

* ª Laguna Icalma

Cautín

38°49’53"

71°23’40"

1285

3ICA8A

* ª Laguna Icalma

Cautín

38°41’23"

71°20’10"

1155

3MEL9A

* ª Captren

Cautín

38°38’34"

71°47’19"

1210

3NAH2A

* Nahuelbuta

Malleco

37°46’78"

72°49’23"

770

3FRI1A

* ª Agua fría

Malleco

37°46’02"

72°48’12"

775

3CAY5A

* ª Cayucupil

Arauco

37°48’18"

73°09’34"

660

3TCH4A

* Termas de Chillán

Chillán

36°54’48"

71°25’41"

1395

3LLE4A

* Los Lleuques

Chillán

36°54’49"

71°29’58"

1170

3VIL1A

* ª Vilches

Talca

35°34’13"

70°37’34"

535

3HUE1A

* ª Huelón

Talca

35°05’75"

72°03’55"

50

3TRI1A

* Playa Trinchera

Talca

35°06’26"

72°11’50"

10

3RRI1A

* ª Carrizal

Talca

35°16’45"

72°14’20"

245

3RAH1A

* Rahue

Cauquenes

35°45’45"

72°31’51"

120

3CUR1A

* ª Curanipe

Cauquenes

35°51’55"

72°37’00"

165

3BUC1A

* Buchupureo

Ñuble

36°05’24"

72°47’16"

225

3COB1A

* ª Cobquecura

Ñuble

36°12’20"

72°47’42"

155

90SAU1A

* ª Río Los Sauces

Ñuble

36°25’

71°08’

s/i

3REC1A

* Recinto

Ñuble

36°50’09"

71°40’85"

800

3TCH5A

*ªTermas de Chillán

Ñuble

36°54’27"

71°24’54"

1500

3RAM1A

* ª Ramadilla

Arauco

37°20’21"

73°13’58"

240

3LAJ2A

* ª Laguna Laja

Biobío

37°23’74"

71°24’52"

1020

3APO1A

* ª Quilapo

Arauco

37°24’47"

73°33’74"

180

3IDA1A

* Caramávida

Arauco

37°33’58"

73°21’20"

235

3TRO1A

* ª Trongol

Arauco

37°33’59"

73°21’17"

130

3CAÑ1A

* ª Cañete

Arauco

37°37’49"

73°25’02"

160

3MAN1A

* ª El Manzano

Malleco

37°47’45"

72°51’34"

560

3CON2A

* Contulmo

Arauco

38°03’58"

73°14’23"

640

3LOL2A

* Lolco

Cautín

38°07’45"

71°24’14"

750

3OYO1A

* Troyo

Cautín

38°09’50"

71°48’45"

760

3LON6A

* ª Lonquimay

Cautín

38°21’02"

71°16’44"

840

3GAL2A

* ª Galletué

Cautín

38°35’33"

71°26’12"

1140

3PIN2A

* ª Pino Hachado

Cautín

38°38’55"

70°57’07"

1620

3SAA2A

* ª Pto.Saavedra

Cautín

38°46’48"

73°16’13"

s/i

3NIM1A

* ª Nueva Imperial

Cautín

38°45’81"

72°54’99"

90

3HAN1A

* ª Chanquín

Valdivia

39°16’39"

73°11’38"

50

3NIG1A

* ª Nigue

Valdivia

39°19’12"

73°11’53"

50

93PET1A

* ª Petrohué

Osorno

41°08’

72°16’

s/i

2CPU2A

* Carelmapu

Llanquihue

41°48’S

73º47’O

4

94BAU1A

* Pelluhue

Cauquenes

35º48´S

72°14’20"

245

2FUT6A

* Futaleufú

Chiloé

43°08´S

71°48’ O

366

2MAR1A

*ª Puerto M. Balmaceda

Aisén

43°47´S

72°57´O

0

94CAY1A

* ª Cayucupil

Arauco

96 AMB1A

* ª Ambato

Ecuador

01°01’

s/i

2500

97PUR1A

* ª Purén

-

s/i

S/i

s/i

92ILO1A

* ª Iloca

Curicó

34°55’S

72°11´O

s/i

3BUC2A

* Buchupureo

Ñuble

36°05’25"

72°47’17"

226

3LLE1A

* ª Los Lleuques

Ñuble

36°52’06"

71°35’87"

1000

3LLI2A

* Llico

Arauco

37°11’89"

73°33’85"

10

3NAH7A

* ª Nahuelbuta

Malleco

37°47’20"

72°59’59"

1290

3ELI1A

* ª Elicura

Arauco

37°48’19"

73°09’34"

325

3NIT1A

* ª Nitrito

Cautín

38°07’54"

71°20’08"

805

3SIE1A

* ª Sierra Nevada

Cautín

38°26’93"

71°22’80"

1050

3GUI2A

* ª Conguillío

Cautín

38°38’85"

71°38’15"

1120

3LLA1A

* ª Llaima

Cautín

38°41’24"

71°49’48"

1200

3ICA7A

* ª Lago Icalma

Cautín

38°43’22"

71°12’53"

1120

3MEL5A

* ª Conguillío

Cautín

38°45’94"

71°37’93"

750

3BUD1A

* ª Lago Budi

Cautín

38°48’17"

73°23’43"

80

3CUN1A

* ª Cunco

Cautín

38°51’06"

71°40’51"

410

3COR1A

* ª Corral

Valdivia

39°56’21"

73°13’28"

s/i

3FLO1A

ª Tres Chiflones

Valdivia

40°02’80"

73°10’49"

360

3ONO1A

* ª Futrono

Valdivia

40°09’59"

72°35’16"

s/i

3RIÑ1A

ª Riñinahue

Valdivia

40°17’74"

72°10’86"

80

3PUY5A

* ª Puyehue

Osorno

40°43’60"

71°56’66"

1290

3HUI1A

* Chaihuin

Valdivia

39°56’58"

73°34’23"

5

F. virginiana

LH4

* Black Hills

EE.UU.

43°30´N

103°20´E

1380

F. x ananassa

SELVA

* Cv. comercial

PAJARO

* Cv. comercial

s/i = sin información.
* = Accesión analizada con isoenzimas. ª = Accesión analizada con AFLP.

En cada muestra se colocó un papel filtro, para absorber el extracto crudo de la proteína. El extracto crudo restante fue filtrado y almacenado a -20ºC en caso de tener que repetir la evaluación.

Preparación del gel de almidón

Los geles de almidón (10%) fueron preparados el día anterior a la electroforesis. Los tampones usados fueron los siguientes: a) sistema discontinuo tris-citrato 0,05 M, pH 8,3 y litio-borato 0,22 M, pH 8,3; b) el sistema continuo, tris-citrato 0,18 M, pH 7,0; y c) histidina 0,065 M, pH 6,5.

El volumen total del gel fue de 370 mL; se vaciaron 80 mL del tampón en un kitasato de 1.000 mL para mantener el almidón en suspensión. Los 290 mL restantes se calentaron hasta ebullición y fueron agregados al kitasato, el cual fue agitado vigorosamente. Una vez homogeneizada la mezcla se extrajo el aire mediante vacío y la mezcla fue vaciada en la cámara electroforética. El gel se dejó solidificar a temperatura ambiente y se cubrió con plástico para evitar deshidratación (Arulsekar et al., 1981).

Electroforesis

A los geles se les realizó un corte transversal a 4 cm del borde (origen de migración), en el cual se colocaron los filtros embebidos en el extracto crudo de la proteína. En cada extremo del corte se colocaron filtros con azul de bromofenol como indicador.

El proceso de la electroforesis se realizó en refrigerador a 4ºC con 150 V en un período inicial de 1 hora hasta la elución de las proteínas en el gel. Posteriormente, se sacaron los filtros y se continuó con la electroforesis usando 300 V constante, hasta que el azul de bromofenol alcanzó 10 cm de migración desde el origen. Terminada la electroforesis los geles se laminaron para ser sometidos a la tinción histológica. Los geles teñidos fueron fijados en 50 % de glicerol para su evaluación.

Durante la evaluación se midió la distancia de migración desde el origen (cm) de las bandas nítidas y reproducibles.

Sistemas isoenzimáticos

Las 84 accesiones de Fragaria chiloensis L. Duch. fueron evaluadas para los siguientes sistemas isoenzimáticos:

Aspartato amino tranferasa (AAT; EC.2.6.1.1); diaforasa (DIAP; EC.1.6.4.3); esterasa (EST; EC.3.1.1.1.1); 6-fosfo-glucodehidrogenasa (6PGD; EC.1.1.1.44); fosfo-glucosa isomerasa (GPI; EC.5.3.1.9); leucina aminopeptidasa (LAP; EC.4.11.1); enzima málica (ME; EC.1.1.1.40); malato dehidrogenasa (MDH; EC.1.1.1..37) y peroxidasa (PXR; EC.1.11.1.7), estos sistemas enzimáticos fueron evaluados con el sistema discontinuo tris-citrato-litio- borato, pH 8,1. Fosfoglucomutasa (PGM; EC.2.7.5.1) fue evaluada con el sistema continuo de tris-citrato, pH 7,0. Mientras que los sistemas shikimato dehidrogenasa (SKDH; EC.1.1.1.25) y fosfatasa ácida (ACP; EC.3.1.3.2) fueron evaluados bajo el tampón histidina, pH 6,5.

Análisis molecular (AFLP)

Para el análisis de AFLP, se aisló ADN de 61 accesiones de Fragaria chiloensis (Cuadro 1), usando hojas jóvenes y sanas, de acuerdo al protocolo descrito por Becerra y Gepts (1994). La metodología de AFLP se realizó mediante al protocolo de Vos et al. (1995), adaptado para trabajo no radioactivo. Se utilizaron seis combinaciones de partidores de AFLP: EcoRI-AGC/MseI-CTG; EcoRI-ACA/MseI-CAG; EcoRI-ACC/MseI-CAA; EcoRI-ACC/MseI-CAT; EcoRI-ACT/MseI-CAC y EcoRI-AGG/MseI-CTT.

Digestión de ADN genómico. La digestión de ADN se realizó en un volumen de reacción de 25 µL con una concentración de ADN de 250 h g), 5x de tampón de reacción; 1 unidad (u) de cada enzima de restricción (EcoRI y MseI) y agua destilada. La reacción fue mezclada e incubada a 37ºC por 2 h.

Ligación de los adaptadores. La reacción de ligación de adaptadores se realizó con los 25 µL de ADN digerido, 24 µL de solución de ligamiento de adaptadores y 1 µL de ADN ligasa T4, incubándose a 20 ºC por 2 h.

Reacción de Pre-amplificación (ADN+1). Se diluyó la mezcla digerida con los adaptadores ligados en una proporción de 1:10 con el tampón TE pH 8,0. La reacción de pre-amplificación se realizó con 5 µL (ADN 1:10), 40 µL de partidores de pre-amplificación, 5x de tampón de PCR para AFLPs y 1 u de Taq ADN polimerasa. Esta reacción fue amplificada bajo las siguientes condiciones: 20 ciclos de 94ºC por 30 s, 56ºC por 60 s y 72ºC por 60 s. El producto de la amplificación fue verificado en un gel de agarosa. El ADN+1 amplificado se diluyó en una proporción 1:50 en el tampón TE pH 8,0 (Vos et al., 1995).

Amplificación selectiva. Se prepararon dos mezclas, la primera de ellas contuvo 0,5 µL del partidor EcoRI (+3) y 4,5 µL del partidor MseI (+3), lo que dio un volumen de 5 µL. La segunda mezcla incluyó 1x tampón de PCR, 1 u de Taq ADN polimerasa y se completó un volumen de 10 µL con agua estéril. Ambas se mezclaron con 5 µL de ADN+1 (diluído). Esta reacción se amplificó bajo las siguientes condiciones: 1 ciclo de 94ºC por 30 s, 65ºC por 30 s y 72ºC por 60 s, y 25 ciclos a 94ºC por 30 s, 56ºC por 60 s y 72ºC por 60 s. Al producto amplificado se le agregó tampón de carga y desnaturalizó a 90ºC por 3 min, manteniéndose las muestras en hielo hasta cargar el gel (Vos et al., 1995).

Electroforesis. La separación de los productos amplificados se realizó en un gel de acrilamida al 6% (Acrilamida, Urea, 10xTBE), temed y persulfato de amonio 10%. El gel se dejó polimerizar 2 h y la electroforesis se realizó con el tampón 1xTBE a 1800 V y 50ºC. La tinción del gel se realizó con nitrato de plata y se secó para la evaluación y registro de las bandas mediante el uso de un escáner (Vos et al., 1995).

Análisis de los datos

Los fenotipos isoenzimáticos fueron evaluados por la distancia de migración de las bandas desde el origen.

Los loci observados en AFLPs fueron analizados cualitativamente, por presencia o ausencia de las bandas, mediante el programa de computación NTSYS-pc (Numerical Taxonomy and Multivariate System), versión 1.70 (Rohlf, 1992). La matriz de similitud genética calculada fue utilizada para el análisis de agrupamiento, mediante el uso del método "no balanceado de pares con media aritmética" (UPGMA) (Rohlf, 1992).

RESULTADOS

Sistemas enzimáticos evaluados

Los sistemas DIAP, 6PGD, MDH, SKDH, AAT, EST, ME y PER a pesar de diversos ensayos de optimización, presentaron una zona de tinción poco consistente por lo cual se eliminaron del estudio. Por el contrario, los sistemas enzimáticos GPI, LAP y PGM presentaron bandas nítidas y consistentes. Por lo tanto, sólo estos tres sistemas fueron incluidos en la evaluación de los clones seleccionados.

La fosfoglucomutasa isomerasa (GPI) generó dos patrones, con tres zonas de actividad. La accesión LH4, F. virginiana presentó las cinco plantas con tres bandas, la primera a 2,9 cm desde el origen, la segunda a 3,5 cm y la tercera a 5 cm. El resto de las accesiones (F. chiloensis y F. ananassa) presentaron la primera banda a 3,1 cm, la segunda a 3,5 cm y la tercera a 5 cm desde el origen (Figura 1a).



Figura 1
. Zimogramas para a) fosfoglucosa isomerasa (GPI), b) leucina aminopeptidasa (LAP), y c) fosfoglucomutasa (PGM).
Figure 1. Zymograms for a) phosphoglucomutase isomerase (GPI), b) leucine aminopeptidase (LAP), and c) phosphoglucomutase (PGM).

La leucina aminopeptidasa (LAP) también presentó dos patrones con una banda única a 6,7 ó 7,0 cm de migración desde el origen (Figura 1b). La accesión 96AMB 1A presentó el primer patrón de la banda ubicada a 6,7 cm, el resto de las accesiones fueron monomórficas para el segundo patrón.

En contraste, la fosfoglucomutasa (PGM) fue monomórfica y presentó un patrón con dos zonas de actividad. La primera se ubicó a 3 cm y la segunda una doble banda a 3,9 y 4,1 cm desde el origen (Figura 1c).

Niveles de polimorfismo detectado por AFLP.

Las combinaciones de partidores de AFLP usados en este estudio detectaron un total de 127 bandas, de las cuales 71% fueron monomórficas y sólo 29% fueron polimórficas (Cuadro 2).

Cuadro 2. Número de bandas y polimorfismo detectados por seis combinaciones de partidores de amplificación de fragmentos polimórficos (AFLP) en 61 accesiones de Fragaria chiloensis L. Duch.
Table2. Number of bands and polymorphism detected by six amplified fragment length polymorphism (AFLP) primer combinations on 61 Fragaria chiloensis L. Duch.

Combinación de partidores

N° total de bandas

N° bandas monomórficas

N° bandas polimórficas

N° patrones

EcoRI-AGC/MseI-CTG

23

18

5

6

EcoRI-ACA/MseI-CAG

16

12

4

5

EcoRI-ACC/MseI-CAA

27

23

4

4

EcoRI-ACC/MseI-CAT

15

12

3

5

EcoRI-ACT/MseI-CAC

27

10

17

25

EcoRI-AGG/MseI-CTT

19

15

4

6

 

127

90

37

 

Las combinaciones de partidores utilizados presentaron diferentes grados de eficiencia en la detección de polimorfísmo. Es así como la combinación EcoRI-ACC/MseI-CAT presentó la menor eficiencia ya que sólo detectó tres loci polimórficos (8%), en cambio, la combinación EcoRI-ACT/MseI-CAC fue la más eficiente al detectar el 46% del total de loci polimórficos (Cuadro 2, Figura 2). Las combinaciones EcoRI-ACA/MseI-CAG, EcoRI-ACC/MseI-CAA y EcoRI-AGG/MseI-CTT fueron menos eficientes que las antes mencionadas, ya que cada una detectó sólo un 11% de loci polimórficos (Cuadro 2).


Figura 2. Patrones de AFLP generados por la combinación de partidores EcoRI-ACT/ MseI-CAC.
Figure 2. AFLP banding pattern for EcoRI-ACT/ MseI-CAC primer combination.

Análisis de similitud genética mediante AFLP.

El análisis genético de las seis combinaciones de partidores de AFLP detectó un rango de similitud genética que varió entre un 45 y un 100% entre las accesiones evaluadas (Datos no mostrados).

Estos datos agruparon a las 61 accesiones en cuatro grupos (Figura 3). El primero de ellos incluyó a 51 accesiones (84%), con un nivel de similitud de 100% de acuerdo a los partidores evaluados; estas accesiones fueron colectadas en una amplia distribución geográfica, desde la provincia de Talca (VII Región) hasta General Carrera (XI Región). El segundo grupo está constituido por 6 genotipos (10%) con una similitud de alrededor del 86%, distribuidas desde la provincia de Malleco (IX Región) hasta Valdivia (X Región). El tercer grupo formado sólo por 2 genotipos (3%), con un nivel de similitud aproximado de 83%, procedentes de Cautín (IX Región) y Chiloé (X Región). El cuarto grupo de 2 accesiones (3%) con una similitud del 78%, procedentes de Cautín (IX Región) y Valdivia (X Región).




Figura 3.
Relaciones genéticas entre genotipos de Fragaria chiloensis L. Duch. mediante seis combinaciones de partidores de amplificación de fragmentos polimórficos (AFLP).
Figure 3. Genetic relationships among Fragaria chiloensis L. Duch. genotypes using six primers combinations of amplified fragment lenght polymorphism (AFLP).

En general, no se observó una tendencia a agrupar genotipos de una misma región geográfica. Por ejemplo, los ecotipos 2BRA1A y 3LON6A provenientes de las provincias de Chiloé, X Región y Cautín, IX Región respectivamente, al igual que las accesiones 3LLA1A y 3NIE1A provenientes de las provincias de Cautín, IX Región, y Valdivia, de la X Región. Este efecto se observa también con la accesión 96AMB1A proveniente de Ecuador, que se agrupó con las 50 accesiones de Fragaria chiloensis colectadas en Chile que presentaron un nivel de similitud de 100%.

DISCUSIÓN

Los niveles de diversidad genética detectados en las accesiones analizadas en este estudio mediante isoenzimas y AFLP son bajos, considerando que estos genotipos fueron seleccionados por diferentes características morfo-agronómicas, y que además provienen de diferentes hábitats y regiones geográficas. Esta baja diversidad genética concuerda con lo obtenido previamente en los mismos genotipos mediante RAPD (Becerra et al., 2001) y con otro estudio de RAPD que incluyó accesiones de Fragaria chiloensis provenientes de América del Norte y Sur (Porebski y Catling, 1993).

El uso de diferentes sistemas enzimáticos en frutilla indicó que sólo tres sistemas funcionaron adecuadamente. Estos sistemas proporcionaron resultados claros y consistentes a través de todo el estudio. Esta situación concuerda con resultados previos donde se utilizaron los sistemas GPI, PGM y LAP para describir o identificar variedades por su nitidez y estabilidad (Bringhurst et al., 1981; Arulsekar et al., 1981; Nehra et al., 1991; Greco y Martelli, 1993; Bell y Simpson, 1994). Por otra parte, Bell y Simpson (1994) mencionaron un buen número de otros sistemas enzimáticos que no se pueden usar en forma adecuada en la caracterización de germoplasma, ya que no se pueden detectar sus productos o éstos son muy inestables.

La evaluación de las isoenzimas se basó en las observaciones de los alelos presentes en los genotipos analizados. Los resultados obtenidos indicaron una escasa variación isoenzimática con los sistemas utilizados. Hasta ahora no existían datos de variabilidad genética isoenzimática de F. chiloensis presente en Chile. La baja diversidad genética observada en la frutilla chilena en relación a la obtenida en otros estudios de frutilla comercial, puede deberse a que esta última es altamente heterocigota (Hancock y Luby, 1993) como producto del cruzamiento de F. chiloensis y F. virginiana, por lo tanto es factible esperar una mayor diversidad genética a nivel bioquímico que en relación a uno de los padres. Otra posible explicación es que exista una baja diversidad enzimática per se en el material de frutilla chilena. En este sentido se postula que el origen de la frutilla chilena podría haber sido producto de la migración de las aves de Norte América (Hancock et al., 1999), lo cual podría corresponder a sólo una proporción de la diversidad genética de las poblaciones norteamericanas en la frutilla chilena. Esto es apoyado por ocho patrones de bandas obtenidos con GPI en F. chiloensis de Norte América (Arulsekar et al., 1981), comparado con un único patrón obtenido en este estudio.

La menor diversidad genética de la frutilla chilena, comparada con la norteamericana también puede deberse a que esta última tiene mayores posibilidades de cruzarse con otras especies silvestres presentes en algunos sectores de esa zona, ya que en su distribución geográfica F. virginiana y F. chiloensis están bastante cercanas (Bringhurst y Ahman, 1963; Luby et al., 1992). En este aspecto, es posible encontrar poblaciones híbridas de F. chiloensis y F. virginiana desde las islas de Vancouver hasta California, proceso que disminuye a medida que se avanza hacia el sur, y donde la presencia de las características de F. chiloensis decrecen paulatinamente (Staudt, 1989).

Un estudio en que se comparó la diversidad genética de una muestra de germoplasma de frutillas de Norte América y Sur América (Chile) a través de RAPDs, confirmó la mayor diversidad genética del germoplasma norteamericano de frutilla, en comparación con el germoplasma chileno, representado en sus coeficientes de similitud de 65 y 92%, respectivamente (Porebski y Catling, 1993).

Un análisis de RAPD con 60 partidores, realizado en las 61 accesiones utilizadas en este estudio, indicó una diversidad genética baja. El 90% de las accesiones estudiadas tuvo un nivel de similitud promedio de 90%. En este estudio tampoco se observó una agrupación directa entre las accesiones y su lugar de colecta o zona agroecológica (Becerra et al., 2001). Estos datos moleculares contrastan con los obtenidos por Hinrichsen et al. (1999), quienes detectaron un valor promedio de similitud genética cercano a 50%, utilizando 16 partidores informativos, además de una cierta correlación entre marcadores y la distribución geográfica.

Los bajos niveles de diversidad genética detectados por los tres sistemas enzimáticos (GPI; PGM y LAP), RAPD y AFLP, contrastan con la gran diversidad de características morfológicas del mismo germoplasma, en forma, tamaño, y color de la hoja; largo de los pecíolos; densidad de tricomas; tamaño de los pétalos; grosor y longitud de los estolones; características del fruto, como forma (desde redondos hasta cónicos), color (desde rojos a blancos) y peso (superior a 4 g). También el grado de sabor y aroma, tolerancia a insectos y enfermedades, producto de su adaptación a una gran cantidad de ambientes (Hancock, 1990; Cameron et al.; 1993, Domínguez, 1995). Una diversidad morfológica y agronómica similar fue detectada en un estudio realizado en poblaciones diploides de F. vesca (Hankock y Bringhurst, 1978) y octoploides de F. chiloensis y F. virginiana (Hankock y Bringhurst, 1979) colectadas en California.

Para maximizar el progreso genético de un programa de mejoramiento genético de frutilla, en el corto y largo plazo, es importante contar con una población de cruzamiento inicial que posea una amplia base genética, para lo cual es indispensable usar padres con características adecuadas (morfológicas, agronómicas y moleculares), provenientes de diversos origenes. De esta manera se puede reducir la consanguinidad y la pérdida de genes favorables por deriva genética (Sjulin y Dale, 1987)

En este sentido ha sido documentada la estrecha base genética de los cultivares comerciales de frutilla norteamericanos. Por ejemplo, sólo un escaso número de clones (Sjulin y Dale, 1987) y citoplasmas diferentes (Dale y Sjulin, 1990; Harrinson et al., 1997) han participado en la producción de los 134 cultivares norteamericanos durante los últimos 30 años. Por otra parte, los 20 cultivares más importantes de Norte América provienen de 38 clones fundadores, de los cuales sólo siete son responsables por aproximadamente el 50% de la contribución genética (Galleta y Maas, 1990).

Para evitar el problema mencionado anteriormente, un programa de mejoramiento genético de frutilla debe considerar la mantención de una diversidad genética alta. Este objetivo podría lograrse usando algunas de las siguientes estrategias: a) desarrollo de frutillas sintéticas octoploides; b) selección e incorporación de clones de las colecciones de F. chiloensis; c) selección e incorporación de F. virginiana (Dale et al., 1993); d) aumentar el número de padres por generación, con un sistema de control parental en las hibridaciones, e) introducción de material parcialmente o no relacionado con F. x ananassa; y f) introducir germoplasma no mejorado mediante el uso de especies silvestre (Sjulin y Dale, 1987). El material evaluado en este trabajo cumple con varias características deseadas, por lo que podría servir de base para iniciar este programa.

Los métodos utilizados para lograr los objetivos del mejoramiento pueden ser varios dependiendo del factor limitante (carácter cualitativo o cuantitativo) que se desea mejorar: Por ejemplo, retrocruzas (Dale et al., 1993), reconstitución de F. x ananassa usando F. chiloensis y F. virginiana (Dale et al., 1993; Hancock et al., 1993), y uso de selección recurrente (Hancock et al., 1993).

La reconstitución de la especie tiene algunas limitaciones: a) un efecto maternal de F. virginiana, el que inactiva los genes que controlan el desarrollo de los órganos masculinos de F. chiloensis, efecto que dura aún después de cuatro retrocruzas, y b) el uso de clones de F. chiloensis de fruto grande (Staudt, 1997) para no perder el tamaño del fruto. Frente a este problema se recomienda seleccionar clones con características hortícolas adecuadas de ambos padres e incorporar estas características directamente en los stocks genéticos de F. x ananassa (Staudt, 1997).

Debido a que muchas de las características a mejorar en frutilla son controladas cuantitativamente (Bringhurst, 1990), el uso de un método de selección recurrente podría ayudar a incrementar la frecuencia de alelos favorables introducidos desde las especies silvestres (Hancock et al., 1999). Este sistema es más lento y requiere un mayor número de generaciones de selección, comparado con el de retrocruzas, pero puede proveer un continuo mejoramiento de las características deseadas por muchas generaciones (Sjulin y Dale, 1987).

El incremento del número de padres por generación reduce la tasa de consanguinidad y minimiza la pérdida de diversidad por la deriva genética. La diversidad genética se puede aumentar incorporando materiales escasamente emparentados, por ejemplo, de otras zonas o regiones y/o mediante la introducción de material silvestre, incluyendo material diploide y tetraploide. Algunos de los clones utilizados hasta ahora en los programas de mejoramiento son: Ambato (F. chiloensis de Ecuador), Reedsport y 2nd Pacific Northwest (F. chiloensis norteamericano), y cuatro clones de F. virginiana glauca (Alaska 292, PI 36979, un clon de Utah y otro de Oregon). Todos estos clones, con excepción de Alaska 292, han sido usados en programas de retrocruzas, usando el material cultivado como padre recurrente, por lo tanto, la contribución del material silvestre al cultivado ha sido muy reducida (Sjulin y Dale, 1987).

A pesar del éxito de la transferencia de genes de material silvestre en cruzas recurrentes, por ejemplo tolerancia a frío e insensibilidad al fotoperíodo desde F. virginiana, el uso de F. chiloensis podría ser más extensivo, pero usando material diverso de otras regiones geográficas (Crock et al., 1982).

CONCLUSIONES

El número de bandas generadas en AFLP en la amplificación +3 de los partidores seleccionados generaron un número de loci considerado bajo ya que una de las mayores ventajas de esta técnica es el gran número de loci por combinación de partidores. Probablemente el diseño de partidores +2 contribuiría a aumentar la detección de un mayor número de loci en Fragaria chiloensis.

Al comparar la similitud genética máxima de 80%, detectada por 60 partidores de RAPD (352 bandas) y la generada por seis combinaciones de partidores de AFLP de 78% (127 bandas), se corroboró la baja diversidad genética de los genotipos analizados. Se verificó además la mayor efectividad de la técnica de AFLP comparada con los RAPD.

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