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Agricultura Técnica

versión impresa ISSN 0365-2807

Agric. Téc. v.60 n.4 Santiago oct. 2000

http://dx.doi.org/10.4067/S0365-28072000000400002 

COMPARACIÓN DE RAPD Y AFLP COMO MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN GENÉTICA DE VID BASADOS EN EL ESTUDIO DE FRAGMENTOS
GENÓMICOS ANÓNIMOS1

Comparison of RAPD and AFLP as methods for genetic identification on Vitis based on the analysis of anonymous genomic sequences.

Claudio Narváez R.2,3, Jorge Valenzuela B.3, Carlos Muñoz Sch.3 y Patricio Hinrichsen R.3

 

1 Recepción de originales: 05 de mayo de 1999.
2 Parte del trabajo de tesis para optar al título de Bioquímico de la Universidad de Chile.
3 Instituto de Investigaciones Agropecuarias, Centro Regional de Investigación La Platina, Casilla 439-3, Santiago, Chile. E-mail: phinrich@platina.inia.cl

ABSTRACT

Until recently grape cultivars were identified based entirely on ampelographic criteria. Currently a number of molecular techniques based on PCR can be applied for exhaustive genetic analysis on plants. These methods proceed through the direct analysis of DNA, in this way avoiding the interference due to environmental interactions. In this paper the application of RAPD and AFLP for the analysis of genetic diversity in a group of more than 50 grape cultivars is presented. Using 18 RAPD primers, 103 information bands were identified, corresponding to 29.9% of polymorphism. In comparison, using only four AFLP primers produced 86 information bands, with a very similar percentage of polymorphism (29.6%). Both methodologies exhibited an adequate degree of reproducibility, evaluated on a collection of 48 Cabernet Sauvignon clones. The dendrograms based on these data sets graphically depicted the ability of both methods to differentiate all the cultivars studied. In the case of Cabernet Sauvignon clones, AFLP permitted the identification of a number of differences that could be related to morphological differences detected among these clones, such as cluster length. The comparison of both methods, principally related to their ability to differentiate cultivars and clones, suggests that AFLP is the more adequate method for both purposes. Nevertheless, both methods could be implemented, given that under controlled conditions appropriate levels of polymorphism and reproducibility are displayed.

Key words: DNA, genome, polymorphism, grapes, Vitis vinifera L., Vitis labrusca.

INTRODUCCIÓN

Chile es uno de los principales exportadores de uva de mesa del hemisferio sur. Además, la producción y exportación de vinos varietales, tanto de las grandes viñas tradicionales como en las denominadas "viñas boutique", ha tenido un aumento sostenido en los últimos años. La conservación y ampliación de estos mercados, así como el de la producción de plantas de vivero, dependerá fundamentalmente de la calidad del producto ofrecido. Un aspecto significativo en este sentido es la capacidad de certificación de origen de los vinos, así como la certificación genética y fitosanitaria de las plantas.

Tradicionalmente, los métodos para identificar genotipos, así como para estimar las relaciones filogenéticas existentes entre ellos, se han basado en el estudio de características morfológicas. En viticultura esta metodología se denomina ampelografía, la que recurre a la observación directa de la planta, sus estructuras y órganos visibles (forma, tamaño y color de planta, hojas y racimos, etc.) y características agronómicas relevantes (Galet, 1979). Sin embargo, estas características pueden ser alteradas por enfermedades, variar en función de la etapa del crecimiento o el ambiente agroclimático. Más aún, estas evaluaciones son subjetivas y están condicionadas al criterio y experiencia individual de cada ampelógrafo.

Esto ha llevado a que en numerosas ocasiones existan genotipos mal indexados, especialmente cuando se trata de cultivares que presentan fenotipos muy similares. Por otra parte, la identidad genética de un cultivar puede modificarse debido a mutaciones somáticas perpetuadas durante su reproducción vegetativa (Vignani et al., 1996), y aunque conserven el nombre original, pueden presentar diferencias tanto fenotípicas como genotípicas (sinonimia). También la sinonimia se aplica a cultivares que aunque genéticamente diferentes, se han manejado como si fueran un único tipo. Alternativamente, la dispersión geográfica de un mismo genotipo o cultivar suele conllevar su redenominación, es decir, varios nombres para un mismo genotipo (homonimia) (Vignani et al., 1996; Cervera et al., 1998).

Los marcadores moleculares superan estas complicaciones, pues con ellos se reconoce directamente las diferencias genéticas entre individuos, obteniéndose un "perfil molecular" o "fingerprinting" característico para cada variedad e independiente de las condiciones de crecimiento de las plantas (Morell et al., 1995). Además, permiten obtener mejores estimaciones de la diversidad genética de una población determinada (Johns et al., 1997), así como información sobre frecuencias alélicas, nivel de heterocigocidad de una población y subdivisión de poblaciones, entre otras, en un período de tiempo menor al ocupado mediante estrategias convencionales (Waugh y Powell, 1992).

Para esto, un marcador molecular debe reunir ciertas características tales como: alto grado de polimorfismo, herencia codominante, distribución frecuente y uniforme en todo el genoma, facilidad de estudio, rapidez en los resultados, y costo de desarrollo bajo o proporcional a la cantidad de información reunida. Además, debe poseer un nivel de reproducibilidad adecuado para comparar resultados entre distintos laboratorios. Desafortunadamente, no existe un único marcador que cumpla con estas características, por lo cual es necesario probar diferentes técnicas para aprovechar sus características específicas.

En el contexto del "fingerprinting" de cultivares, la primera metodología molecular aplicada a plantas fue el análisis de polimorfismos en el largo de fragmentos de restricción (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism) (Helentjaris et al., 1985). En vides, el RFLP se aplicó por primera vez usando sondas heterólogas de minisatélites (Striem et al., 1990). Bowers et al. (1993) desarrollaron un "fingerprinting" de las variedades para vino cultivados en California, EE.UU., probando cinco sondas, pero que revelaban un número reducido de formas alélicas cada una. Por otra parte, Bourquin et al. (1993) identificaron 111 alelos diferentes usando una combinación de dos enzimas de restricción y 38 sondas. Los resultados de este trabajo agruparon a los cultivares franceses estudiados de forma similar a lo determinado por ampelografía.

RFLP, sin embargo, corresponde a una metodología técnicamente compleja y de alto costo, por lo que se han desarrollado nuevos métodos basados en la amplificación de secuencias genómicas mediante una reacción de amplificación en cadena (PCR, Polymerase Chain Reaction). Con esta aproximación, se realiza un análisis con una pequeña cantidad de ADN y con protocolos comparativamente sencillos, de los cuales existen numerosas variantes descritas en forma genérica por Staub et al. (1996). En este trabajo se usaron dos de estos métodos: la amplificación de fragmentos usando partidores de diseño aleatorio (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA) (Williams et al., 1990) y la amplificación de fragmentos genómicos digeridos por enzimas de restricción (AFLP, Amplified Fragment Length Polymorphism) (Vos et al., 1995). Estas metodologías también son conocidas como marcadores "masivos", ya que permiten generar una gran cantidad de información en breve plazo, sin requerir del conocimiento previo de las secuencias genómicas amplificadas. Ambos recurren al uso de partidores de diseño aleatorio, de manera que reconocen secuencias "anónimas", dispersas a lo largo de todo el genoma.

El método de RAPD ha sido descrito en detalle por numerosos autores (Williams et al., 1990; Hinrichsen et al., 1996). RAPD difiere de otros métodos de análisis por PCR en que se usa un único partidor de pequeño tamaño (10 mer) y se hace el apareamiento del PCR a bajas temperaturas. Las ventajas del método son su simplicidad y bajo costo, aunque tiene el inconveniente de ser un marcador de tipo dominante, es decir, no es posible discernir sobre la heterocigocidad de los loci observados. Además, la reacción es muy sensible a las condiciones de amplificación y a la calidad y concentración del ADN, las cuales influirían en la reproducibilidad del método. En cambio, el análisis por AFLP (Vos et al., 1995), que es esencialmente la combinación de una digestión con enzimas de restricción y de amplificación por PCR, presenta un grado de reproducibilidad mucho mayor. AFLP, por su parte, también es un marcador de tipo dominante y su nivel de complejidad técnica es más alto que RAPD, lo que representa una desventaja. De esta manera, en cada especie o grupo de especies en estudio, es necesario hacer un análisis comparativo antes de decidir qué metodología usar para resolver un determinado problema de análisis genético.

En vides existen numerosos ejemplos de aplicación de RAPD, tanto para diferenciar cultivares como para mapeo genético (Ye et al., 1993; Weeden et al., 1994; Lodhi et al., 1995). Aunque algunos autores han mostrado reservas respecto de la utilidad de RAPD para realizar estudios genéticos en vides, básicamente por su escasa reproducibilidad (Büscher et al., 1993; Xu et al., 1995), existen antecedentes que sugieren que esta metodología podría usarse para este fin (Collins y Symons, 1993; Gogorcena et al., 1993; Jean-Jaques et al., 1993; Qu et al., 1996; Stavrakakis et al., 1997; This et al., 1997). Además, estudios recientes han demostrado un alto nivel de reproducibilidad (Vidal et al., 1998). RAPD también ha sido usado para identificar progenitores, como en el caso del cultivar Müller-Thurgau, uno de los más cultivados en Europa central (Büscher et al., 1994).

También ha sido aplicado para diferenciar cultivares genéticamente muy relacionados, como Sultanina vs. Sultanina Seedless, uno derivado del otro por una mutación (Bakalinsky et al., 1993; Striem et al., 1994), o un grupo de 14 cultivares de tipo Moscatel (Stavrakakis y Biniari, 1998). Con AFLP, una técnica de desarrollo más reciente, los estudios en vid son escasos, aunque ya se ha publicado un estudio que demuestra su potencial para diferenciar clones de determinados cultivares (Cervera et al., 1998). Así también, Sensi et al. (1996) compararon los resultados obtenidos con AFLP y otra técnica de análisis genómico, encontrando buena correlación.

El propósito de este trabajo fue comparar el comportamiento de estas dos metodologías, RAPD y AFLP, considerando aspectos como la facilidad para detectar polimorfismos en esta especie y la capacidad de diferenciar cultivares, y clones de un mismo cultivar. Cabe recordar que en las bases de datos de la vid existen entre 5.000 y 8.000 entradas, de las cuales muchas serían homonimias (Alleweldt, 1988). Además, se han establecido las relaciones genéticas (similitud o distancia genética) entre un número de cultivares de un jardín de variedades, muchos de ellos posibles progenitores a usarse en un programa de mejora genética. De este modo, en un esquema concebido a más largo plazo, estos marcadores podrán ser usados para asistir el proceso de selección de segregantes analizando directamente su ADN.

MATERIALES Y MÉTODOS

Variedades analizadas

Se usaron 57 cultivares de vid (55 Vitis vinifera L. y 2 híbridos interespecíficos) que son parte de una colección de genotipos (jardín de variedades) mantenidos en el Centro Experimental La Platina de INIA. En el Cuadro 1 aparecen ordenados de acuerdo a su uso e indicando qué tipo de análisis se hizo en cada caso. Además, se analizó una colección de 48 clones de Cabernet Sauvignon seleccionados por tener diferente largo de racimo (Muñoz et al., 1985). Las hojas se almacenaron a -80°C hasta que se extrajo el ADN. Para este propósito, se ha determinado que el mejor tejido de esta especie leñosa son hojas recién brotadas de plantas en activa proliferación después de la dormancia invernal.

Cuadro 1. Variedades de vid analizadas.

Table 1. Vitis cultivars considered in this study.

Muestra

   

Tipo

   

Concentración

 

Identificación

Variedad

de Vid*

RAPD

AFLP

ADN (m g mL-1)

1

 

PC-57

Pinot Chardonnay

VB

+

+

190

2

 

PC-35

Pinot Chardonnay

VB

+

+

120

3

 

G-36

Gewürztraminer

VB

+

+

380

4

 

G-59

Gewürztraminer

VB

 

+

147

5

 

WR-31

White Riesling

VB

+

+

70

6

 

WR-40

White Riesling

VB

 

+

185

7

 

Ch-16

Chasselas Musqué Vrai

VB

+

+

318

8

 

To-62

Torontel

VB

+

+

92

9

 

S-34

Sauvignon

VB

+

+

201

10

 

SB-55

Sauvignon Blanc

VB

 

+

235

11

 

SB-12

Sauvignon Blanc

VB

+

+

457

12

 

SG-48

Sauvignon Gris

VB

+

+

81

13

 

Sau-8M95

Sauvignonasse

VB

 

+

224

14

 

Se-14

Semillón

VB

+

+

199

15

 

CS-61

Cabernet Sauvignon

VT

+

+

154

16

 

CS-66

Cabernet Sauvignon

VT

 

+

ND

17

 

CS-65

Cabernet Sauvignon

VT

 

+

44

18

 

PN-18

Pinot Noir

VT

+

+

424

19

 

PN-45

Pinot Noir

VT

+

+

123

20

 

C-13

Carmenère

VT

+

+

249

21

 

Z-15

Zinfandel

VT

+

+

377

22

 

PB-17

Portugais Bleu

VT

+

+

435

23

 

RC-42

Ruby Cabernet

VT

+

+

95

24

 

A-19

Aurora

VT

+

+

201

25

 

Si-20

Silvaner

VT

+

+

38

26

 

V-21

Verdot

VT

+

+

111

27

 

SV-28

Sabat Vongie

VT

+

+

149

28

 

PS-22

Petite Siraz

VT

+

+

144

29

 

BS-5

Black Seedless

MN

+

+

266

30

 

R-9

Ribier

MN

+

+

410

31

 

E-10

Emperor

MN

+

+

531

32

 

B-29

Beauty

MN

+

+

66

33

 

Ex-32

Exótica

MN

+

+

62

34

 

SF-54

San Francisco

MN

+

+

70

35

 

MN-51

Moscatel Negra

MN

+

+

123

36

 

Pe-23

Perlón

MN

+

+

243

37

 

RS-4

Red Seedless

MR

+

+

214

38

 

BR-49

Big Red

MR

+

+

100

39

 

Bl-53

Blush

MR

+

+

170

40

 

RS-50

Ruby Seedless

MR

 

+

267

41

 

RS-11

Ruby Seedless

MR

+

+

270

42

 

Q-41

Queen

MR

+

+

93

43

 

F-44

Flora

MR

+

+

272

44

 

MR-37

Moscatel Rosada

MR

+

+

31

45

 

TS-47

Thompson Seedless

MB

+

+

266

46

 

TS-64

Thompson Seedless

MB

 

+

99

47

 

P-60

Perlette

MB

+

+

119

48

 

Su-26

Superior

MB

+

+

143

49

 

Pi-52

Pizutello

MB

+

+

159

50

 

IP-30

Italia Pirovano

MB

+

+

231

51

 

Cal-39

Calmería

MB

+

+

127

52

 

Ce-43

Centenial

MB

+

+

285

53

 

Pa-24

Patagonia

MB

+

+

115

54

 

25

N.N.

NN

+

+

84

55

 

K-38

Kaiji

V. vinifera

+

+

189

56

 

Pl-33

Plima

Híbrido

+

+

409

57

 

FF-27

Fue Fuji

Híbrido

+

+

60

*VB: Vino blanco; VT: Vino tinto; MN: Mesa negra; MR: Mesa roja; MB: Mesa blanca; NN: genotipo identidad desconocida

Extracción de ADN

Las extracciones de ADN se basaron en el método descrito por Lodhi et al. (1994) con algunas modificaciones desarrolladas en el laboratorio. Las muestras de ADN concentrado se centrifugaron para eliminar un sedimento de formación espontánea y luego se determinó la concentración de ADN en un fluorímetro DyNA Quant 200 (Hoefer Pharmacia Biotech) usando el reactivo Hoechst 33258 como tinción específica del ADN (compuesto que emite a 480 nm).

Partidores de PCR y adaptadores

Los partidores de RAPD fueron adquiridos en Operon Technologies, Inc. (Alameda, California, EE.UU.), excepto algunos obtenidos de Wako Corp. (Osaka, Japón). La síntesis de los partidores y adaptadores de AFLP se encargó a IDT (Coralville, Iowa, EE.UU.).

Reacción de RAPD

La mezcla de reacción del PCR contenía entre 5 y 10 ng de DNA, 0,2 mM de cada dNTP, 3 mM MgCl2, 0,4 m M de partidor de Operon Technologies, tampón de PCR 1X (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM KCl y 0,01% de gelatina) y 0,5 U de Taq ADN polimerasa (Gibco-BRL, EE.UU.), en un volumen total de 12,5 m L. Se usó un termociclador Perkin-Elmer con el siguiente programa de amplificación: a) tres ciclos de: desnaturación a 95ºC por 1 min; alineamiento a 37ºC por 1 min; extensión a 72ºC por 80 s; b) 37 ciclos de : denaturación a 94ºC por 35 s; alineamiento a 40ºC por 40 s; extensión a 72ºC por 80 s; c) elongación por 7 min a 72ºC. La separación de los fragmentos de ADN amplificados y su registro fotográfico se hizo como lo describió Hinrichsen et al. (2000).

Reacción de AFLP

El protocolo de AFLP se desarrolló como fue descrito originalmente (Vos et al., 1995), con algunas modificaciones descritas en Protocolos del CIAT (González et al., 1995). Se digirieron 250 ng de ADN con 2,5 U de EcoRI y de MseI, en tampón NEB#2 (New England Biolabs, NEB, Hartford, Connecticut, EE. UU.). Para la ligación de los adaptadores, se usaron 2,5 pmol de adaptador EcoRI, 25 pmoles de adaptador MseI y 100 U de T4 ADN ligasa en tampón de T4 ADN ligasa (NEB). Las mezclas de digestión y ligación se combinaron e incubaron toda la noche en un termociclador con un programa de temperaturas de 30 s a 10°C y 30 s a 30°C (Lund et al., 1996). Esta mezcla se diluyó 10 veces para la reacción de PCR+1, la que se realizó en un volumen de 25 m L y contenía 1,5 ng m L-1 de los partidores PM1 y PE1, 0,8 mM de dNTPs, 2 mM de MgCl2 y 0,5 U de Taq ADN polimerasa en buffer de PCR 1X. Se usó el siguiente programa de temperaturas: a) desnaturación a 94°C por 3 min; b) 35 ciclos de 94°C por 3 min, 55°C por 30 s y 72°C por 60 s; y c) elongación a 72°C por 7 min. Para la amplificación selectiva (PCR+3), el producto del PCR+1 se diluyó 20 veces, usándose una alícuota de 5 m L que se mezcló con 5 ng del partidor EcoRI+3 (excepto cuando se realizó tinción de plata, 30 ng de éste) y 30 ng del partidor MseI+3, además de dNTPs 0,8 mM, MgCl2 2 mM, tampón de PCR (10 mM Tris-HCl pH 8,3, 50 mM de KCl, 0,01% de gelatina) y 0,5 U de Taq polimerasa, en 20 m L de volumen final. El partidor EcoRI+3 se marcó en el extremo 5’ con g -33P-ATP (3000 Cimmol-1, 10 mCi mL-1, de Amersham, Reino Unido) usando 0,4 U de T4-polinucleótido quinasa (Promega, Madison Wisconsin, EE.UU.). La reacción se incubó a 37°C por 2 h y luego se calentó a 70°C por 10 min para inactivar la enzima. Para la reacción de PCR, el perfil térmico fue el siguiente: a) desnaturación por 3 min a 92°C ; b) 1 ciclo de 92°C por 30 s, 65°C por 30 s y 72°C por 1 min; c) los siguientes 11 ciclos se baja en cada uno 0,7 grados durante el alineamiento, hasta llegar a 56°C (efecto "touchdown") ; d) 23 ciclos a 94°C por 30 s, 56°C por 30 s y 72°C por 60 s; y e) elongación por 7 min a 72°C.

Separación electroforética de los productos de la reacción de AFLP.

Los productos del PCR+3 se separaron en un gel del tipo de secuenciación de poliacrilamida (PAA) al 6% y 7,5 M de urea, preparado en TBE 1X. Uno de los vidrios se trató con RepelSilane EC (Pharmacia Biotech), lo que facilita separar el gel del vidrio después de la corrida electroforética. Paralelamente, el otro vidrio fue tratado con BindSilane (Promega), reactivo que favorece la unión del gel sobre el vidrio y permite realizar la tinción de plata sobre éste. La electroforesis se corrió en TBE 1X. Los productos de PCR+3 se diluyeron a la mitad con tampón de carga (95% de formamida, 1 mg mL-1 de xilen cianol, 1 mg mL-1 de azul de bromofenol y 10 mM EDTA) y se calentaron durante 3 min a 95°C. Se colocaron en hielo inmediatamente, y se mantuvieron a 4ºC hasta que se cargaron en el gel. El gel se pre-corrió por 25 min antes de cargar las muestras. La corrida se realizó a 70-80 W (temperatura óptima de 50°C) por 2,5 a 3 h o hasta 5 cm antes de caer el xilen cianol desde el gel. Cuando se usó marcación con 33P, el gel se transfirió a un papel filtro Whatman 3MM, se cubrió con celofán tipo AlusaplasTM y se secó a 65°C por 1 h al vacío. Se expuso sobre una placa autorradiográfica Kodak X-Omat AR en un cassette de exposición por 2 a 4 días, dependiendo de la actividad del radioisótopo. Para la tinción de plata, se siguió el protocolo descrito por Bowers et al. (1996).

Análisis estadístico

Los polimorfismos detectados fueron escrutados como presencia (1) o ausencia (0) de una banda. Con estos datos se prepararon matrices binomiales, las que fueron usadas para calcular valores de similitud genética entre cada par de genotipos usando el coeficiente de Jaccard, incluído en el paquete estadístico NTSYS-pc versión 2.00 (Applied Biostatistics Inc., Setauket, Nueva York, EE. UU.). Este coeficiente asigna un mayor peso estadístico a las bandas presentes, lo que es deseable en marcadores de tipo dominante como RAPD y AFLP (Powell et al., 1996; Johns et al., 1997). Los dendrogramas fueron preparados aplicando el algoritmo UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with Arithmetical Averages) (Rohlf, 1997).

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Para enfrentar el problema de la identificación genética de los numerosos cultivares de vid descritos (Alleweldt, 1988), se ha recurrido en los últimos años al uso de distintos marcadores moleculares. Las metodologías que se usaron en este trabajo (RAPD y AFLP) identifican diferencias entre dos o más genotipos que corresponden en última instancia a cambios en la secuencia del ADN. Estas diferencias se manifiestan como la presencia o ausencia de una determinada banda de ADN, dado por la posibilidad de unión de un partidor al templado de ADN genómico de la vid. Cada una de estas técnicas presenta ciertas ventajas y desventajas comparativas que se evalúan y discuten más adelante.

Análisis mediante RAPD

Dado que RAPD es muy sensible a las condiciones de la reacción, se determinó la concentración óptima de ADN a usar en los análisis. Se ensayó entre 0,3 y 30 ng de ADN por reacción, encontrándose que entre 1,0 y 10 ng los patrones fueron perfectamente reproducibles. Sobre 30 ng por reacción, se perdió la regularidad en los patrones de amplificación; bajo 1 ng la intensidad de las bandas fue muy débil. De esta manera, se hizo todo el estudio usando 5 ng de ADN en cada reacción. Otras condiciones, como la concentración de MgCl2 y otras sales en el buffer, cantidad de enzima, temperatura de alineamiento, etc., fueron las estándares que han sido usadas en otras especies en nuestro laboratorio (e.g., Sagredo et al., 1998). Cabe destacar que es importante optimizar las condiciones de la reacción para evitar que las diferencias en los patrones de bandas se deba a problemas de la reacción, en lugar de reflejar diferencias genéticas.

El análisis de RAPD requiere de una selección de aquellos partidores que entreguen la mayor información posible en la especie o género que se estudie, en este caso, el género Vitis. Para ello se usaron tres cultivares diferentes y se ensayaron 80 partidores comerciales, correspondientes a las series OPA, OPB, OPI y OPF, de los cuales fueron elegidos 18 en base a que presentaban un patrón de varias bandas en un amplio rango de tamaño (200 a 3.000 bp) y de fácil lectura (Cuadro 2). Esta lista de partidores en ningún caso es definitiva, ya que a posteriori se demostró la alta heterocigocidad en esta especie. Esto significa que potencialmente muchos de los 80 partidores podría identificar alguna diferencia en el grupo de 48 cultivares.


Cuadro 2. Partidores de RAPD seleccionados, Nº de bandas totales amplificadas y Nº y fracción de bandas polimórficas.

Table 2. Selected RAPD primers, total number of bands and number and fraction of polymorphic ones

     

Bandas Polimórficas

 

Secuencia

N° de bandas

 

Partidor

nucleotídica (5’-3’)

totales

Fracción

OPA-13

CAGCACCCAC

19

6

0,316

OPB-04

GGACTGGAGT

26

8

0,301

OPB-07

GGTGACGCAG

21

5

0,238

OPB-12

CCTTGACGCA

21

5

0,238

OPB-17

AGGGAACGAG

20

5

0,25

OPF-04

GGTGATCAGG

21

10

0,476

OPF-06

GGGAATTCGG

12

5

0,417

OPF-08

GGGATATCGG

12

4

0,333

OPF-09

CCAAGCTTCC

19

5

0,263

OPF-12

ACGGTACCAG

10

5

0,5

OPF-18

TTCCCGGGTT

13

2

0,154

OPF-14

TGCTGCAGGT

19

4

0,21

OPI-04

CCGCCTAGTC

14

6

0,423

OPI-07

CAGCGACAAG

29

7

0,241

OPI-10

ACAACGCGAG

28

10

0,357

OPI-13

CTGGGGCTGA

17

4

0,235

OPI-14

TGACGGCGGT

22

5

0,227

OPI-20

AAAGTGCGGG

21

7

0,333

 

Total

344

103

 

Promedio bandas

19,1

5,7

 
 

Polimorfismo (%)

   

29,9

 

Un ejemplo de las reacciones de RAPD se muestra en la Figura 1, correspondiente al análisis con el partidor OPB-04; destacan en la figura 8 bandas polimórficas de un total de ±26 amplificadas. Sobre un total de 344 bandas amplificadas por los 18 partidores seleccionados, 103 fueron polimórficas, es decir, RAPD reveló un 29,9% de polimorfismo entre los cultivares analizados, lo que es muy alto comparado a otras especies.

Figura 1. Patrones electroforéticos de genotipos de vid analizados por RAPD con el partidor OPB-04. Las flechas indican las bandas polimórficas.

Figure 1. Electrophoretic patterns of Vitis genotypes analyzed by RAPD using OPB-04 primer. Arrows indicate polymorphic bands.


La reproducibilidad de los patrones de amplificación de RAPD se verificó en un estudio adicional. Para ello, se analizaron 48 clones de Cabernet Sauvignon, correspondientes a plantas individuales provenientes de Talca, Cauquenes y dos grupos del valle de Santiago (colección de clones mantenido en INIA, Centro Regional de Investigación La Platina); originalmente estos clones fueron seleccionados por tener diferente longitud del racimo (Muñoz et al., 1985). Este estudio, realizado con siete partidores informativos en vides, indicó que los patrones de RAPD tienen una adecuada reproducibilidad para una misma variedad, aún cuando se usen diferentes extracciones de ADN (Figura 2). Además, el patrón genético de cualquier clon analizado es representativo del conjunto de individuos de la misma variedad, existiendo sólo variaciones menores que probablemente corresponden a mutaciones somaclonales, ya que las plantas de vid son propagadas vegetativamente.

Figura 2. Reproducibilidad de RAPD revelada por la homogeneidad genética de clones de Cabernet Sauvignon. Se muestran los resultados con cinco partidores de RAPD diferentes sobre cuatro genotipos.

Figure 2. RAPD reproducibility revealed by the genetic homogeneity of Cabernet Sauvignon clones. Results for five RAPD primers over a total of four genotypes are shown.



Excepcionalmente, se encontraron partidores que mostraron algunas diferencias entre los clones analizados, como E-41 (Figura 2). En este caso, los fragmentos polimórficos podrían corresponder a (i) el locus genético correspondiente al gene o genes responsables de las diferencias observadas entre los clones de Cabernet, lo que es poco probable dado que no hay una correlación entre largo de racimo y un determinado alelo, o más bién (ii) secuencias hipervariables (como mini- o microsatélites) que darían cuenta de bandas de tamaño variable. Si las diferencias encontradas a nivel genético están o no relacionadas con las diferencias morfológicas identificadas originalmente en los clones de Cabernet Sauvignon (largo de racimo), es materia de un estudio posterior, que comenzaría con la caracterización de los fragmentos de tamaño variable, amplificados en forma reproducible.

Las bandas polimórficas de RAPD permitieron diferenciar todos los cultivares estudiados, lo que se verificó haciendo un dendrograma (Figura 3). Esta representación gráfica permite estimar las relaciones genéticas entre los genotipos, los que formaron grupos escasamente relacionados entre sí, con un porcentaje de similitud entre 28 y 90%. En los agrupamientos obtenidos se observó que algunas variedades genéticamente cercanas, como Sauvignon Gris y Sauvignon Blanc, quedaron asociadas directamente, con un índice de similitud superior al 95%. Este resultado tiene sentido, dado que se sabe que estos dos cultivares se diferencian sólo en los genes que participan en la síntesis de antocianinas. Una situación diferente sucedió con dos muestras de Pinot Chardonnay (PC-57 y PC-46) que mostraron un nivel de similitud de sólo 57,4%, quedando además en grupos genéticos diferentes. Esto demuestra que se trataría de material indexado incorrectamente, es decir, uno de los dos genotipos (o ambos) no correspondería al cultivar (verificado posteriormente mediante polimorfismo de los respectivos alelos de microsatélites; manuscrito en preparación).

Figura 3. Dendrograma basado en polimorfismos de RAPD que ilustra la similitud genética entre los cultivares analizados.

Figure 3. Dendrogram based on RAPD data showing the genetic similarity among the cultivars considered in this study.

El porcentaje de similitud más alto encontrado en este análisis de RAPD (aparte de los clones de Cabernet Sauvignon, no incluídos en el dendrograma) fue entre PC-57 y un clon de Gewürstraminer (G-36) con 90,2%, rango considerado propio de diferencias entre clones de una misma variedad (Cervera et al., 1998). Los cultivares Patagonia (Pa-24) y Perlette (Per-23) presentaron también un coeficiente de similitud alto (78,8%), lo que indica una alta similitud genética entre ellos.

De los tres cultivares japoneses incluídos en este estudio, Plima (Pl-33) fue el más divergente (Figura 3), mientras que Kaiji (K-38) y Fue Fuiki (FF-27) se incluyeron en el gran grupo constituído por todos los demás cultivares de V. vinifera. Esto coincide con sus pedigríes, ya que Kaiji –uva de mesa- es 100% V. vinifera (Flame Tokay x Neo Muscat), mientras que Fue Fuiki -cepa de vino- tiene tres de cuatro ancestros de esta especie y sólo uno, Creveling, es V. labrusca; sus ancestros son (Mills [Muscat Hamburg x Creveling] x Angelo Pirovano [Chasselas Rose x M. Hamburg]). Plima, en cambio, fue obtenida por el cruzamiento de Steuben x Himrod, dos cultivares pertenecientes al complejo Vitis labruscana (híbridos de V. vinifera, V. labrusca y otras especies americanas) (Akihiko Sato, National Institute of Fruit Trees Science (NIFTS), Akitsu, Japón, comunicación personal). Este resultado es destacable, dado que se verifica una correspondencia entre la genealogía y la información que entrega el análisis molecular.

Análisis mediante AFLP

Los productos de una reacción de AFLP en la que se usó la combinación PE 1C/PM 1D se presentan en la Figura 4. La calidad del ADN usado en esta serie de reacciones de AFLP fue apropiada, observándose un patrón general de bandas amplificadas comparable entre cultivares. Este aspecto es relevante si se considera que se deben cumplir exitosamente varias etapas (digestión, ligación, amplificaciones), las que podrían verse afectadas por la presencia de compuestos fenólicos propios de especies leñosas como la vid (Pandey et al., 1996). En forma reiterada, algunas muestras no presentaron productos de amplificación. Estas muestras no fueron incluídas en los análisis posteriores. El uso de cuatro combinaciones de partidores EcoRI y MseI generó 86 bandas polimórficas, que representan aproximadamente un 30% de los fragmentos amplificados (Cuadro 3), porcentaje muy similar al determinado para RAPD. Para AFLP, de manera similar que para RAPD, es necesario determinar las condiciones óptimas para cada especie, incluída la selección de partidores más informativos. De esta manera, este 30% de informatividad del método podría ser bastante mayor si se seleccionaran partidores como PE1A/PM1C, que por sí solo reportó 32 polimorfismos (53%).

Figura 4. Patrones de AFLP de cultivares de vid usando la combinación de partidores descrita en el texto. Las flechas del lado izquierdo señalan la posición de 16 bandas informativas.

Figure 4. AFLP patterns for Vitis cultivars generated with the primer combination mentioned on the text. Arrows at the left label 16 polymorphic bands.


Cuadro 3. Partidores de AFLP usados, número y fracción de bandas polimórficas detectadas.

Table 3. AFLP primer characteristics and number and fraction of polymorphisms.

     

Bandas polimórficas

Combinación
de partidores

Secuencia
adicional (Eco/Mse)

Nº total de
bandas

Fracción

PE1C/PM1B

AGT/GCG

60

18

0,30

PE1A/PM1C

AAC/GAC

60

32

0,53

PE1C/PM1D

AGT/GGT

65

16

0,25

PE1H/PM1B

AGA/GCG

105

20

0,19

Total

 

290

86

 

Promedio de bandas por gel

 

72,5

21,5
 

Bandas polimórficas (total) (%)

     

29,6

Los productos de AFLP fueron visualizados por marcación radiactiva del partidor con g -33P. También se probó la tinción con plata, sin embargo el contenido de información se reduce por la menor sensibilidad del método. Por ejemplo, usando la misma combinación de partidores (PE1A/PM1C, ver Cuadro 3), la tinción de plata reveló 22 bandas, de las cuales sólo 8 fueron polimórficas (36%); por el contrario, la marcación con g -33P reveló 60 bandas totales, 32 de ellas informativas (más del 50%). Esto pudiera ser de importancia en el estudio de clones de una variedad, en donde las diferencias entre genotipos son usualmente de difícil detección. Este resultado no es concluyente, pues otros autores no han encontrado diferencias en términos de la eficiencia de la identificación de bandas (Chalhoub et al., 1997) comparando el uso de isótopos radiactivos con tinción argéntica.

Cervera et al. (1998) han demostrado recientemente que en AFLP es posible enriquecer patrones de bandeo mediante la combinación de dos partidores EcoRI en una misma reacción, obteniéndose la suma de ambos. Este resultado se ha reproducido bajo nuestras condiciones, combinando los partidores PE1C y PE1I con PM1B (Figura 5). En general, se verificó la sumatoria de ambos patrones, correspondientes a las reacciones por separado, aunque en algunos casos se observó la pérdida de polimorfismos, probablemente por comigración de bandas informativas de un patrón con bandas no discriminatorias del otro.

Figura 5. Efecto de la combinación de dos partidores EcoRI sobre el número total de bandas de amplificación de AFLP. En este caso, se muestra una porción del gel correspondiente a la combinación de partidores PE1C y PE1I con PM1B.

Figure 5 Effect of the combination of two EcoRI primers on the total number of AFLP amplified fragments. In this case, an area of the PE1C and PE1I plus PM1B primer combination is shown.


Basados en los polimorfismos de AFLP se preparó un dendrograma (Figura 6) que presenta el resultado del agrupamiento de acuerdo a los índices de similitud obtenidos para cada par de cultivares. Los agrupamientos obtenidos destacaron la escasa diferencia propia de clones de un determinado cultivar. Por ejemplo, los clones de Cabernet Sauvignon (Figura 7) mencionados previamente mostraron mínimas diferencias, no cuantificadas, uno de los cuales es CS-61, incluido en el dendrograma. El otro "clon" incluído (CS-66), que tiene algo menos de 80% de similitud, no corresponde a un auténtico Cabernet Sauvignon, de acuerdo a resultados de microsatélites (manuscrito en preparación). Otros pares de clones, como Ruby Seedless (RuS-50 y RuS-11) o Sauvignon Blanc (SB-12 y SB-55) exhibieron similitudes genética superiores o próximas al 90% (Figura 6).

Figura 6. Dendrograma basado en polimorfismos de AFLP.

Figure 6. Dendrogram based on AFLP polymorphisms.



Figura 7. Diferencias entre clones de Cabernet Sauvignon de racimo largo y corto. Los carriles corresponden a: 1, Talca; 2, Peumo; 3, Pt-78; 4, Pt-79; 5, clon de EE.UU. Las fotos corresponden a fragmentos de dos reacciones de AFLP, según se indica. Las flechas destacan las bandas polimórficas.

Figure 7. Clonal differences revealed by AFLP among long and short cluster in C. Sauvignon. Lanes are: 1, Talca; 2, Peumo; 3, Pt-78; 4, Pt-79; 5, USA clone. Images correspond to fragments of larger gels for two AFLP reactions, as it is indicated. Arrows show polymorphic bands.

Estos resultados coinciden con lo informado por Cervera et al., (1998). Un valor menor que 90% sugeriría que se trata de variedades diferentes como ocurre para el caso de los genotipos Thompson Seedless (TS-47 y TS-64) y Gewürztraminer (G-59 y G-36), que presentaron índices de similitud de 46,51% y 25,93%, respectivamente. Estos resultados también concuerdan con lo detectado por otros sistemas de marcadores, e.g., RAPD y microsatélites, y demostrarían que se trata de plantas erróneamente indexadas debido probablemente a su gran similitud ampelográfica. De forma similar a RAPD, AFLP no agrupó ningun conjunto de cultivares en un cluster en particular. Esto tiene relación con el origen muy diverso de los cultivares, o en otras palabras, que esta especie tiene una base genética muy amplia. Por otra parte, haciendo un análisis por tipo de variedades separadas en aquellas de vino y de mesa, no se reconocieron bandas polimórficas asociadas con alguno de estos dos grupos.

Los cultivares Perlón y Patagonia, Exótica y Moscatel Negro, y Sauvignon (S-34) y Semillón (Se-14), mostraron coeficientes de similitud de 80,6; 82,9 y 78,9%, respectivamente, y por tanto están muy cerca del rango de las variaciones genéticas propias de clones. Cabe mencionar que dichos pares de cultivares presentan características morfológicas muy similares entre sí, lo que sugeriría una posible situación de sinonimia. Además, se debe destacar que las agrupaciones entre Patagonia y Perlón, Sauvignon (S-34) y Semillón, Exótica y Moscatel negro, así como el de Gewürztraminer (G-36) y Pinot Chardonnay (PC-57), coinciden con las agrupaciones basadas en datos de RAPD. Esto es especialmente relevante porque se confirma el resultado obtenido mediante RAPD.

De los cultivares de origen japonés, Plima (Pl-33) se aleja del resto del grupo, lo cual es consistente con la mayor diferencia genética que se asocia a diferentes especies. En esto hay coincidencia entre AFLP y RAPD, al igual que para el cultivar Kaiji (K-38), que se mantiene consistentemente agrupado con cultivares de V. vinifera (Fue Fuji no fue analizada por AFLP). Estos resultados se reflejan en haber encontrado siete bandas polimórficas que sólo aparecieron en Pl-33, mientras que en K-38 sólo se observaron dos bandas exclusivas.

Diferenciación de clones de Cabernet Sauvignon

Utilizando mezclas de ADN de cinco clones de Cabernet Sauvignon de cuatro poblaciones provenientes de Talca, Peumo y dos cuarteles de INIA, Centro Regional de Investigación La Platina (Pt-78 y Pt-79), se hicieron reacciones de AFLP con 23 combinaciones de partidores. Con 11 de ellas se reconocieron diferencias entre los clones de Pt-78 y Peumo respecto de los clones de Talca y Pt-79. También se usó ADN de un clon de Cabernet Sauvignon proveniente de EE.UU., que no presentó diferencias con las mezclas de ADN de clones de Talca y Pt-79.

En la Figura 7 se muestran las diferencias obtenidas con dos combinaciones de partidores. A pesar que las diferencias son evidentes, se requiere hacer un estudio que sea más representativo de las poblaciones de clones comparadas, de manera de eliminar la posibilidad de que tales diferencias entre poblaciones sólo sean diferencias obtenidas para los clones incluídos en este análisis ("apertura de los grupos"). Actualmente se trabaja en la caracterización de estas bandas (clonamiento y secuenciación) para verificar si se trata de marcos de lectura abiertos, señales de regulación génica, o secuencias no codificantes. Si se detectara un gen de función conocida, quedaría abierta la posibilidad de utilizarlo para mejoramiento genético del cultivo vía transformación genética. Sin embargo, esto implicaría la identificación y caracterización del gen, determinación de su carácter dominante o recesivo, aislamiento del gen y clonamiento en vectores de transformación apropiados, etc., todas etapas de alta dificultad técnica que se justificarían sólo si el carácter codificado fuera de alto interés.

Comparación entre los métodos de análisis molecular en vides

Un aspecto de gran interés es determinar cuál sería la mejor herramienta para "fingerprinting". Desde este punto de vista, es necesario realizar estudios comparativos entre las diferentes técnicas disponibles. Sin embargo, este aspecto está escasamente cubierto en la literatura. Incluso en cultivos anuales, que han recibido tradicionalmente una mayor atención, existen pocos antecedentes. Una excepción es el trabajo realizado por el grupo de Rafalski en soya (Powell et al., 1996), donde se demuestra la importancia de realizar estos estudios para elegir un marcador apropiado para cada propósito. En especies de propagación agámica no existen estudios de esta naturaleza, y este trabajo constituye un importante aporte en este sentido. A diferencia de lo descrito por Powell et al. (1996), donde se demostró que AFLP tiene una mayor capacidad que RAPD para detectar diferencias entre genotipos, en este trabajo se ha encontrado valores equivalentes (en torno al 30%) de bandas polimórficas para ambas metodologías, lo que puede explicarse porque en el caso de RAPD se realizó una selección de los partidores más informativos, aumentando así la eficiencia del método de una forma arbitraria. Esta elevada heterogeneidad genética entre cultivares podría explicarse, en parte, por los orígenes muy diversos de los progenitores (en muchos casos desconocidos, especialmente en el caso de los cultivares de vino), aunque la gran heterocigocidad detectada parece ser condición propia de la especie (Vitis vinifera L.) o del propio género Vitis.

Un método alternativo a los presentados en este trabajo para hacer diferenciación genética son los microsatélites (SSR), que son secuencias repetidas dispersas en el genoma en muy alto número de copias, compuestas de 1-6 nucleótidos repetidos en tandem hasta 60 veces (Tautz 1989). Su análisis se basa también en PCR, usando partidores complementarios a secuencias vecinas al microsatélite. Dado que es usual observar loci de SSR con más de 10 alelos y frecuencia de heterocigocidad esperada superior a 0,6 (Morgante y Olivieri, 1993), ellos son excelentes candidatos para ser usados en la tipificación genética de cultivares de vid. Actualmente se trabaja paralelamente en vid con los tres tipos de marcadores, de tal manera de generar un volumen de información apropiado para poder justificar plenamente el uso de una u otra metodología, según si se quiera diferenciar cultivares o clones en esta importante especie (Hinrichsen et al., 2000).

CONCLUSIONES

  • Se ha optimizado el uso de marcadores moleculares de tipo RAPD y AFLP para el análisis genético de vides.
  • Ambos métodos permitieron diferenciar todos los cultivares analizados.
  • Para algunos cultivares se analizó más de una planta o clon, demostrándose que ambas técnicas tienen un alto grado de reproducibilidad. Sin embargo, en una serie de casos se encontraron diferencias genéticas sustanciales entre plantas supuestamente de la misma variedad, lo que se explicaría por errores de indexación derivado de una alta similitud ampelográfica.
  • AFLP sería una buena alternativa para diferenciar clones, dado que tiene una alta reproducibilidad y entrega mayor información por cada reacción que RAPD.
  • No se evidenció la existencia de "grupos genéticos" discretos. En cambio se revelaron profundas diferencias entre cultivares, lo que coincide con la alta heterocigocidad descrita en esta especie.

RESUMEN

Hasta hace un tiempo, los cultivares de vid sólo podían ser diferenciados en base a observaciones ampelográficas. Actualmente se dispone de numerosos métodos moleculares basados en PCR que permiten un exhaustivo análisis genético de las plantas analizando directamente su genoma y evitando de esta manera la interferencia de efectos ambientales. En este trabajo se presentan los resultados de la aplicación de dos de estos métodos, RAPD y AFLP, para estudiar la diversidad genética existente en un grupo de más de 50 cultivares de vid. Usando 18 partidores de RAPD se identificaron 103 bandas informativas, correspondiente a un 29,9% de polimorfismo. Por su parte, usando cuatro combinaciones de partidores de AFLP se obtuvieron 86 bandas informativas (29,6% de polimorfismo). Ambos métodos mostraron un adecuado grado de reproducibilidad, evaluada sobre una colección de clones de Cabernet Sauvignon. Los dendrogramas preparados en base a estos datos graficaron la capacidad de ambos métodos para diferenciar todos los cultivares estudiados. En el caso de los clones de Cabernet Sauvignon, AFLP permitió identificar una serie de diferencias que podrían estar asociadas a diferencias en el largo de los racimos que presentan estos clones. La comparación de ambos métodos, principalmente en cuanto a su capacidad para diferenciar cultivares y clones, sugiere que AFLP es el método más adecuado para ambos propósitos. Sin embargo, ambos métodos podrían ser implementados, dado que bajo condiciones controladas muestran apropiados niveles de polimorfismo y reproducibilidad.

Palabras claves: ADN, genoma, polimorfismo, vides, Vitis vinifera, Vitis labrusca.

AGRADECIMIENTOS

Especiales agradecimientos a María Herminia Castro por el apoyo técnico y a Margarita Barticevic por los antecedentes sobre filogenia de cultivares japoneses.

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