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Archivos de medicina veterinaria

versión impresa ISSN 0301-732X

Arch. med. vet. v.31 n.1 Valdivia  1999

http://dx.doi.org/10.4067/S0301-732X1999000100011 

Aislamiento y sobrevivencia de Leptospiras en tejido renal
de roedores silvestres

Isolation and survival of Leptospira in kidney tissue
of wild rodents

J. ZAMORA, M. V. y S. RIEDEMANN T. M.; M. V.

Instituto de Microbiología, Facultad de Ciencias, Universidad Austral de Chile, Casilla 167, Valdivia, Chile.

SUMMARY

By means of dark field microscopy and culture in EMJH medium, 198 kidneys from rodents of 7 murine species were tested in order to check leptospira infection. The spirochaetal survival was also tested in a kidney tissue suspension.

Thirty six (18,2%9 rodents were positive and 31 (15,7%)out then were positive to leptospira by microscopic detection, being possible the spirochet isolation in 7 (3,5%) cases. The concordance between both tests was 82,82%.

Most of the Leptospira strains survived in the renal suspension in the first 48 hh. The loss of motility or the dissapearance was associated to de pH decrease and increase in bacterial contamination.

Palabras claves: Leptospira. Sobrevivencia. Aislamiento. Roedores silvestres.

Key words: Leptospira. Survival. Isolation. wild rodents.

INTRODUCCION

Numerosas investigaciones destacan la gran importancia que les cabe a los animales silvestres, en particular a los pequeños roedores, como reservorios de leptospiras, los que juegan un importante rol en la transmisión de la infección al hombre y a los animales domésticos (Stoener 1975; Hathaway y Blakemore, 1981; Torten y Marshall, 1994; Zamora, 1998;), dado que eliminan las espiroqueta por la orina que sobrevive extracorpóreamente, en especial en ambientes húmedos que se transforman en peligrosas fuentes de infección (Zaitsev y col, 1989; Corwin y col, 1990; Faine, 1994).

En atención que la leptospira coloniza preferentemente los riñones, se consideró interesante detectar la espiroqueta en esa víscera en ratones y ratas naturalmente infectados, mediante cultivo y también determinar su viabilidad en una suspensión tisular renal en roedores capturados en la provincia de Valdivia.

MATERIAL Y METODOS

En la provincia de Valdivia se capturaron 198 roedores mediante trampas Sherman que fueron identificados en el Instituto de Ecología y Evolución de nuestra Universidad, correspondiendo a las siguientes especies: Mus musculus 31, Akodon olivaceus 53, Akodon longipilis 9, Oligoryzomis longicaudatus 76, Rattus rattus 15 y Rattus norvegicus 14.

Una vez en el laboratorio se anestesiaron con éter y se les extrajeron asépticamente los riñones por laparotomía. Esta víscera se procesó de inmediato haciéndola pasar por una jeringa de 3 ml, obteniendo tejido renal desmenuzado el que se suspendió en medio de cultivo EMJH líquido (Difco) para obtener diluciones 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4. De las 3 últimas diluciones se sembró 0,5 ml en 8 ml de medio EMJH semisólido enriquecido con suero de conejo, adicionado de 100 mg/ml de 5 fluorouracil (5-Fu) y 10 mg/ml de ácido nalidíxico con el objeto de minimizar la contaminación bacteriana; se incubó a 28º C por 16 semanas, revisando los cultivos semanalmente. La dilución 10-1 se dejó en reposo por aproximadamente 3 - 4 h a temperatura ambiente y del sobrenadante se realizó examen microscópico de campo oscuro con un aumento de 80x, considerando la característica motilidad de la leptospira como indicación de viabilidad y, así, diferenciarlas de seudoespiroquetas (Michna, 1959; Alexander, 1991). Las muestras que resultaron positivas, se controlaron cada 24 h para constatar la sobrevivencia de la espiroqueta, midiendo el pH de la suspensión cuando desaparecieron las leptospiras.

Las cepas de leptospiras aisladas se enviaron al "National Animal Diseases Center, Iowa, USA" *) (NADC) para su identificación definitiva por la técnica de endonucleasa de restricción.

Para determinar si existían diferencias estadísticamente significativas en ambos exámenes se utilizó la dócima x2 de asociación.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Los resultados fueron diferentes según la técnica empleada, detectándose un total de 36 (18,2%) roedores positivos por alguno de los métodos utilizados (cuadro 1), porcentaje inferior al detectado en otras oportunidades pero de fácil explicación, ya que esos estudios anteriores se hicieron empleando técnicas de tinción inmunoquímicas, serológicas y de cultivo las que en conjunto detectaron una positividad de 37,8% (Zamora y col, 1994; Zamora y col, 1995; Zamora, 1998).

Cuadro 1

Resultados en el diagnóstico de leptospirosis en los 198 roedores examinados.

Comparison of positive results in 198 rodents examined for leptospira infection.

EXAMEN
SOLO MICROSCOPIA
SOLO CULTIVO
MICROSCOPIA
Y CULTIVO
TOTAL
POSITIVO
29 (14,7%)
5 (2,5%)
2 (1,0%)
36 (18,2%)

Con todo, el porcentaje de infección es alto en estos pequeños mamíferos porque las condiciones ambientales de la zona favorecen la sobrevivencia de leptospiras facilitando la transmisión del agente, dado que los brotes epidémicos de leptospirosis son consecuencia de la sobrevivencia de la espiroqueta fuera del cuerpo animal y la endemicidad de una región depende de ciertos estratos del suelo y de su pH, temperatura ambiente, vegetación y existencia de nutrientes, factores que permiten incluso el crecimiento y desarrollo de la leptospira (Ellinghausen y McCullough, 1965; Hathaway, 1981; Bahaman, 1991; Faine, 1994; Torten y Marshall, 1994; Zamora y col, 1994).

La positividad de O. longicaudatus y A. olivaceus, ratones más propios del área rural, es de indudable importancia como reservorios porque pueden mantener la infección intraespecie en forma natural y transmitirla a los animales domésticos e incluso al hombre (cuadro 2). En cambio, la positividad en M. musculus y R. norvegicus adquiere mayor relevancia para la especie humana, ya que estos roedores viven en las cercanías de los lugares que habita el hombre, lo que en ningún caso disminuye la preponderancia de la infección para los animales domésticos, en particular los de compañía (cuadro 2) (Hathaway, 1981; Faine, 1994). El no haber detectado leptospiras en A. longipilis y R. rattus como en trabajo anteriores (Zamora y col, 1995), se puede deber al escaso número de ejemplares capturados pertenecientes a estas especies de roedores.

Cuadro 2

Viabilidad de Leptospira en la suspensión de tejido renal.

Leptospira viability suspended in kidney tissue.

ESPECIE
3- 4 h
24 h
48 h
72 h
96 h
120 h 
144 h
pH
Mus musculus
3
2
2
+
+
+++
+
+
+++
-
+
-

-
     
6.6
6.6
6.6
 
Acodon olivaceus
1
2
1
1
1
+
+
++
++
+++
+/-
+
++
++
+++
-
-
-
++
+++
 

+
++


+/-
-



-
 
6.7
6.6
7.0
6.3
6.3
Rattus norvegicus
1
1
+
+
+
+
-
+

-
     
6.6
6.4
 
 
Oligoryzomis longicaudatus
4
5
1
3
1
1
1
+
++
+
++
++
++
++
+, c
++
+
++
++
++
++
-
+
+
+
+
++
++

-, c
+
-, c
+, c
-, c
+

+
-
-, c
-,c
+
+






+







-

6.7
6.2
6.2
6.4
6.7
6.4
6.2
TOTAL
31
31
31
17
5
3
1
0
 
- = leptospira inmóviles o ausentes; +/- = 0 — 2 leptospiras móviles por campo; + = 3 —10 leptospiras móviles por campo; ++ = 10 — 20 leptospiras móviles por campo; +++ = más de 20 leptospiras móviles por campo; c= contaminada.

La viabilidad de las cepas de leptospiras en la suspensión renal se constató hasta por 5 días en un caso y la mayoría lo hizo por 1 - 2 días (Cuadro 2), comprobándose que el pH fue levemente ácido fluctuando generalmente entre 6.2 y 6.6, coincidiendo la inmovilidad o desaparición de la espiroqueta con un aumento de la contaminación bacteriana, lo que además de influir en el descenso del pH contribuye a enrarecer el medio con el producto de su metabolismo. Estos resultados concuerdan con Michna (1959), quien informa que la inmovilidad de la espiroqueta estaba asociada con la contaminación bacteriana y el descenso del pH con un punto crítico alrededor de 6.0. Cabe señalar que este autor trabajó con una suspensión renal de cerdo naturalmente infectado con el serovar canicola, informando que la leptospira sobrevivió hasta 7 días mantenida en refrigeración y por 1 - 3 días a temperatura ambiente, como también aconteció mayoritariamente en el presente trabajo, ya que una cepa sobrevivió por 5 días, lo que posiblemente sea consecuencia de la existencia de serovares más resistentes. También menciona Michna (1959) que en la orina de perro naturalmente infectada por el serovar canicola, es posible pesquisar microscópicamente al microorganismo hasta por 7 días, pero si la orina alcanza una acidez de pH 5.6 o bien incrementa su alcalinidad a pH 7.8 o más, las leptospiras pierden rápidamente su motilidad y desaparecen.

La sobrevivencia de la leptospiras en el tejido renal murino por varios días, hace suponer que perros y gatos que cazan ratones estarían expuestos a contraer la infección aunque los gatos enferman raramente, situación que también sufrirían los animales depredadores y carroñeros susceptibles, no sólo por el consumo inmediato de una caza, sino también por comer cadáveres de ratones infectados, aunque es posible que la viabilidad de las espiroquetas en estas últimas condiciones sea menor, por autólisis de los tejidos y contaminación post-morten (Fairbrother, 1985).

El examen microscópico en campo oscuro permitió pesquisar el mayor número de muestras positivas, ya que en 31 (15,7%) casos se detectó la presencia de espiroquetas (cuadro 1), coincidiendo con los cultivos en sólo 2 muestras renales, a pesar que se aislaron 5 cepas más lo que da un total de 7 cepas de leptospiras aisladas (cuadros 1 y 3). Cabe mencionar que una cepa se aisló de la dilución 10-2 (también de 10-3), y 6 de 10-3, dos de las cuales además crecieron en la dilución 10-4. De estas 7 cepas cultivadas 4 de ellas se aislaron de A. olivaceus, 1 de O. longicaudatus y 2 de M. musculus.

Las leptospiras tienen desarrollo lento en los medios artificiales, son muy exigentes en sus requerimientos nutricionales y se cultivan difícilmente, de ahí que la escasa cantidad de aislamientos no cause extrañeza dado que algunos serovares — preferentemente los patógenos - tienen gran dificultad de adaptación a los medios de cultivo, problema más frecuente en los aislamientos primarios y en especial si las muestras son de roedores (Ellinghausen y McCullough, 1965; Faine, 1994). Más aún, el tejido renal inoculado en los medios de cultivo puede afectar el desarrollo in vitro de la espiroqueta por enrarecimiento o reducción creando, eventualmente, disminución de la aerobiosis u otros posibles efectos tóxicos. Esto explicaría que los mejores resultados se obtuvieron con el inoculo de diluciones de 10-3 y no con una concentración mayor de suspensión celular del riñón. No obstante, se obtuvo un alto grado de concordancia sin diferencia estadística entre ambas técnicas de diagnóstico, dada la gran coincidencia en las muestras negativas (cuadro 3).

Cuadro 3

Concordancia entre microscopía y cultivo en el diagnóstico de leptospirosis.

Concordance between isolation and microscopic examination for the diagnosis of leptospira infection.

EXAMEN
CULTIVO (+)
CULTIVO (-)
TOTAL
MICROSCOPIA (+)
2
29
31 (15,7%)
MICROSCOPIA (-)
5
162
167 (84,3%)
TOTAL
7 (3,5%)
191 (96,5%)
198 (100,0%)
Relación concordante 164/198 = 82,82% ; (P > 0.05).

Lamentablemente, las cepas aisladas no se lograron identificar definitivamente por no coincidir con los serovares de referencia. Al respecto, el NADC informó que la prueba de endonucleasa de restricción no correspondió con ninguno de los serovares conocidos, perteneciendo 5 cepas a un tipo y las restantes a otro, lo que se estudia porque corresponderían a nuevos genotipos que sería interesante confirmar por su innegable valor etiológico y epidemiológico.

RESUMEN

Se examinaron, mediante microscopía de campo oscuro y cultivo en medio EMJH, los riñones de 198 roedores pertenecientes a 7 especies de múridos, con la finalidad de pesquisar la infección por leptospiras y, a la vez, determinar la sobrevivencia de la espiroqueta en una suspensión de tejido renal.

Treinta y seis (18,2%) roedores resultaron positivos y a 31 (15,7%) de ellos se les detectó la leptospira microscópicamente, lográndose aislar la espiroqueta en 7 (3,5%) casos, con un grado de concordancia entre ambas pruebas de 82,82%.

La mayoría de las cepas de leptospiras sobrevivió en la suspensión renal por las primeras 48 h, y las pérdida de motilidad o su desaparición se asoció con el descenso del pH y el aumento de la contaminación bacteriana.
__________________________
Aceptado: 12.01.99.  

* Leptospirosis/Mycobacteriosis Research Unit. USDA, ARS, Ames, IOWA, USA.  

AGRADECIMIENTOS

Los autores desean dejar especial constancia de sus sinceros agradecimientos a la Dra. Carole Bolin del Nactional Disesases Center de Iowa, USA, por los trabajos de identificación de las cepas aisladas mediante la técnica de endonucleasa de restricción.

BIBLIOGRAFIA

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