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Archivos de medicina veterinaria

versión impresa ISSN 0301-732X

Arch. med. vet. v.31 n.1 Valdivia  1999

http://dx.doi.org/10.4067/S0301-732X1999000100006 

"Comparación antigénica y de la respuesta inmune en
ratones desafiados con virus CVS y aislados «calle» y
«fijo»presumiblemente atípicos del virus rábico

Antigenic comparison and immune response in challenges
mice with virus CVS and "street" and "fixed" isolates
presumably atipics of rabies virus

P. MARTINEZ1, M.V.; M. FAVI2, M.V.; G. HERNANDEZ2, M.V.; L. RODRIGUEZ2, M.V. M.Sc.

1 Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, Universidad de Chile, Peatones Veinte N° 4577, Código Postal 6853024, Ñuñoa, Santiago.
2 Instituto de Salud Pública de Chile, Ministerio de Salud de Chile, Avda. Marathon 1000, Santiago, Chile.

SUMMARY

Rabies is a disease caused by neurotropic virus which has the capability to infect a wide range of animals and humans.

Antigenic analysis of a wide variety of fixed (vaccine strains) and street viruses with monoclonal antibodies has revealed considerable antigenic variation among the samples of viruses isolated from different host species, or geographical locations. These marked antigenic variations have potentially serious implications for rabies control strategies.

We studied the patterns of "street" and "fixed" rabies virus isolates compared with the prototype Challenge Virus Standard (CVS), using the Fuenzalida-Palacios rabies vaccine and anti-rabies serum standard. Six street rabies virus were used. These were detected and isolated in 1985, at the Public Health Institute of Chile.

First, suckling mice were inoculated with street rabies virus 85/423, 85/433, 85/684, 85/882, 85/1068, 85/1091. The detection of rabies virus antigen in CNS tissues was performed with the direct immunofluorescence technique. These positive samples were used for the viral passage in mice. Next, brain tissues from mice experimentally infected with street virus were used for the next intracerebral inoculation.  This street rabies virus was fixed.

We analysed role of Fuenzalidad-Palacios vaccine in induction of protective immune response against a lethal infection in suckling mice with six street rabies virus ( 85/423, 85/433, 85/684, 85/882, 85/1068 and 85/1091), challenge virus standard (CVS) and fixed rabies virus (85/423, 85/433, 85/684, 85/882, 85/1068 and 85/1091).

To study the protection of anti-rabies serum, mice were inoculated intracerebrally with preincubated mixtures of anti-rabies serum with virus CVS and anti-rabies serum with fixed rabies virus.

The results indicated that the Fuenzalida-Palacios vaccine, experimentally produced only partial protection against a lethal intracerebral challenge with rabies virus. We demostrate that, administration of anti-rabies serum resulted in insufficient protection.

Therefore, these results are suggestive to us that exist an heterogenecity in street rabies virus.

Palabras claves: rabias, virus rábico.

Key words: Rabies, street rabies virus.

INTRODUCCION

La rabia es una zoonosis que afecta al sistema nervioso central (SNC) generalmente de carácter letal. Es producida por el virus rábico que pertenece al género Lyssavirus y familia Rhabdoviridae.

Sus huéspedes son diferentes animales domésticos y silvestres incluyendo al hombre. Su distribución es mundial, existiendo muy pocos países en los cuales ha sido erradicada (INPPAZ, 1994; Muller y Blancou, 1992; Rodríguez-Torres, 1992).

En nuestro país gracias a una fuerte campaña que se realizó en la década del 60, en que se consideró la incorporación de la vacuna de cerebro de ratón lactante (CRL), mayor diagnóstico y mejor observación de los animales sospechosos, junto a otras medidas, permitieron disminuir en forma significativa los casos animales y humanos. Registrándose en 1972 un caso de rabia humana, lográndose un período comprendido entre 1972-1996 en el cual no se presentaron casos en el hombre, sin embargo en el primer semestre de 1996 se produjo el fallecimiento de un niño, de Doñihue-VI región, como consecuencia de la infección transmitida por la mordedura de un murciélago enfermo.

En 1985, en nuestro país, se aísla por primera vez el virus desde murciélagos insectívoros y comienza con ello el ciclo silvestre de la enfermedad. Desde esa fecha comienzan a ser diagnosticados casos positivos a rabia en diferentes especies de murciélagos y también en diferentes regiones.

El virus esta formado por un ARN simple negativo el cual junto a las proteínas de la cápside (N, NS y L) forman el complejo ribonucleoproteico. Lo envuelve una membrana lipídica en la cual se distinguen la proteína de transmembrana o glicoproteína G y la proteína de la matriz o M.

En diferentes regiones del mundo se han encontrado diferencias fundamentalmente a nivel de la glicoproteína, lo cual da origen a distintas cepas del virus (Smith y col., 1992). Con respecto a las proteínas de la nucleocápside se cree que están más conservadas genéticamente. Siendo el virus rábico uno solo, algunos autores señalan que han hallado algunas variantes con lo cual se trata de explicar las fallas que se han producido en algunas personas vacunadas correctamente (Acha y Szyfres, 1986; Germano, 1994; Wilde y col., 1996), según estos antecedentes la OPS/OMS recomienda evaluar la protección conferida por vacunas antirrábicas utilizadas en una determinada área geográfica y los virus aislados desde animales o seres humanos que han muerto por rabia (Belotto, 1992; CEPANZO, 1980). Gracias a la incorporación de la técnica de anticuerpos monoclonales, con capacidad para reconocer diferentes determinantes antigénicos, ha sido posible verificar la existencia de diferencias inmunológicas entre cepas de virus rábico "fijo" y "calle" (CEPANZO, 1980; Díaz, 1992; Germano, 1994; Mebatsion y col., 1992; Smith y col., 1986). En el Instituto Pasteur de Algeria, a una preparación del virus rábico, aislado desde el cerebro de un perro rabioso, se le determinó la secuencia del gen de la glicoproteína del virus "calle", la cual, comparada con la secuencia del virus Challenge Virus Standar (CVS) mostró un 10% de diferencia en la posterior composición aminoacídica. También fueron encontradas diferencias entre virus, aislados en cultivos celulares, provenientes de saliva de un paciente humano rabioso, con el virus CVS, el autor indica que estas variaciones son muestras de la evolución genética del virus "calle" en donde han aparecido nuevos aminoácidos en la glicoproteína (Benmansour y col., 1991; Holland y col., 1982).

En nuestro país, en un trabajo preliminar realizado en el Instituto de Salud Pública (ISP), los resultados demostraron que la vacuna antirrábica tipo Fuenzalida-Palacios, usada de rutina para controlar la infección, no protegió eficazmente a animales de laboratorio desafiados con aislados de virus "calle". La prueba de identificación viral arrojó resultados dudosos en 3 aislados que no fueron satisfactoriamente neutralizados, planteando la posible existencia de cepas atípicas del virus rábico (Sepúlveda y col., 1985).

Por este motivo ha parecido de interés realizar un estudio de algunos aislados vírales, con la finalidad de tener un mayor conocimiento de ellos y con ello contribuir a un mejor control de la enfermedad en el país.

Como hipótesis de trabajo nos planteamos, que la existencia de diferencias antigénicas entre aislados de virus rabia en sus estados "calle", "fijo" y la cepa CVS del virus rábico, determinarían un comportamiento atípico de estos aislados vírales.

MATERIAL Y METODOS

Fueron utilizados 6 aislados de virus rabia, recibidos en 1985 en la sección Diagnóstico de rabia, del ISP y corresponden a : 85/423; 85/433; 85/882; 85/1068; 85/1091, procedentes de murciélagos insectívoros Tadarida brasiliensis y 85/684 obtenido de un gato doméstico Felis catus.

Fijación de los aislados. Al iniciar este trabajo fueron tomados los aislados, que eran mantenidos a -70º C, correspondiendo al primer pasaje en CRL. Con los encéfalos de ratón conteniendo el virus (encéfalos positivos a la presencia de antígenos de virus rabia por la prueba de inmunofluorescencia directa - IFD -), se procedió a la fijación de cada aislado vale decir, disminución del período de incubación entre 4-7 días, y un cambio en la distribución y tamaño de los corpúsculos fluorescentes en las células que, se hicieron más homogéneos y de menor tamaño.

Dentro del virus rábico se establece el concepto de virus "calle" que se refiere al de reciente aislamiento de animales o humanos y que no ha sufrido modificaciones en el laboratorio y el "fijo" a aquel que siendo aislado de iguales fuentes sufre una adaptación a animales de laboratorio mediante pasajes intracerebrales secuenciales.

Este proceso de fijación consistió básicamente en inoculaciones intracerebrales de 0.03 ml., de una suspensión homogénea al 10% p/v del virus rabia, a ratones blancos, hembras, tipo albino suizo, de 11-14 g de peso, procedentes del Bioterio del ISP. Posteriormente fueron observados y se registraron los animales normales, con síntomas y muertos. Luego con los encéfalos de los animales muertos por rabia se procedió a realizar un nuevo pasaje y así sucesivamente, hasta lograr la fijación para cada aislado.

Tanto los aislados "calle" como "fijo" fueron titulados en su capacidad infectante por el método de dilución punto final (Kaplan y Koprowski, 1976). El título viral se calculó según el método de Spearman-Kärber y corresponde a la dilución de virus que produce efecto de muerte en el 50% de los ratones inoculados y se expresó en DL50 (dosis letal 50%).

Determinación de protección conferida por vacunas antirrábicas veterinaria y de referencia nacional. Vacuna antirrábica veterinaria Fuenzalida-Palacios (VAV): es preparada en CRL, contiene en 2 ml, virus inactivado con luz ultraviolenta, a una concentración de 2.5 % p/v de CRL, adicionado con fenol y timerosal en una concentración de 1:1000 y 1:10000 respectivamente. En la preparación de ella, se utilizan 3 cepas de virus rábico fijo. De ellas 2 corresponden a cepas aisladas en Chile (cepa 51 y 91, aisladas en 1943 de un canino y un humano respectivamente) y una a la cepa CVS (que procede originariamente de la cepa Pasteur) (Fuenzalida, 1976).

Vacuna antirrábica de referencia nacional (VAR): contiene iguales cepas que la vacuna VAV, pero se diferencia en que la concentración de tejido cerebral es al 10% p/v y su presentación es liofilizada (Díaz, 1991).

Para conocer la protección que confieren las vacunas VAV y VAR frente a los aislados, se vacunó a dos grupos de 280 ratones con la vacuna VAV (dilución 1:5) y a otros dos grupos de 280 con la vacuna VAR (dilución 1:10), cada uno de los grupos fue subdividido en 7 grupos menores de 40 ratones, los cuales fueron sometidos a desafío con cada uno de los aislados vírales en sus estados "calle" y "fijo" y con la cepa de referencia CVS. Las diluciones fueron determinadas considerando la prueba estándar del National Institutes of Health (NIH).

La aplicación de ambas vacunas se realizó por vía intraperitoneal, inoculando un volumen de 0.5 ml., de cada una de ellas, en dos aplicaciones con un intervalo de 7 días (días 0 y 7).

Para realizar el desafío los ratones fueron inoculados 7 días post-segunda vacunación (día 14) intracerebralmente con 0.03 ml., de una suspensión viral que contenía teóricamente 100 DL50 de los aislados "calle" y "fijo" en estudio y virus CVS.

Paralelamente se emplearon dos grupos de 140 ratones cada uno, que no recibieron vacunas, pero que fueron sometidos a desafío con cada aislado viral en su forma "calle", "fijo" y CVS. Estos ratones constituyeron grupos controles, los cuales recibieron virus rábico en la misma forma que los grupos vacunados. En estos controles se espero producir la muerte en un nivel mínimo de 80% para que la prueba fuera considerada válida.

Al momento de desafiar a los ratones con virus rabia, se controlaron las cantidades de dosis letales realmente utilizadas en la inoculación, las cuales debían estar entre 5 y 50 DL50 , para lo cual fueron preparadas diluciones de cada aislado viral "calle" y "fijo" l igual que el virus CVS. Cada dilución se inoculó un grupo de 10 ratones, los títulos fueron calculados según el método de Spearman-Kärber (Colton y col., 1973).

Todos los ratones fueron observados durante 14 días, a contar del momento de desafío, siendo registrados en el protocolo todos los animales sacrificados (con parálisis sobre el 4º día), muertos por la enfermedad (se consideraron muertes específicas las posteriores al 4º día de inoculación y antecedida por sintomatología característica) y las muertes o eliminaciones inespecíficas y los sobrevivientes.

Diseño de grupos:

Vacunados con:  Subdivididos y desafiados con: Vacunados con: Subdivididos y desafiados con:
280 ratones con 
VAV 
40 ratones con 85/423«calle»
280 ratones con 
VAV 
40 ratones con 85/423 «fijo»
40 ratones con 85/433 «calle» 40 ratones con 85/433 «fijo»
40 ratones con 85/684 «calle» 40 ratones con 85/684 «fijo»
40 ratones con 85/882 «calle» 40 ratones con 85/882 «fijo»
40 ratones con 85/1068 «calle» 40 ratones con 85/1068 «fijo»
40 ratones con 85/1091 «calle» 40 ratones con 85/1091 «fijo»
40 ratones con CVS 40 ratones con CVS
Vacunados con: Subdivididos y desafiados con: Vacunados con: Subdivididos y desafiados con:
280 ratones con 
VAR 
40 ratones con 85/423 «calle»
280 ratones con 
VAR 
40 ratones con 85/423 «fijo»
40 ratones con 85/433 «calle» 40 ratones con 85/433 «fijo»
40 ratones con 85/684 «calle» 40 ratones con 85/684 «fijo»
40 ratones con 85/882 «calle» 40 ratones con 85/882 «fijo»
40 ratones con 85/1068 «calle» 40 ratones con 85/1068 «fijo»
40 ratones con 85/1091 «calle» 40 ratones con 85/1091 «fijo»
40 ratones con CVS 40 ratones con CVS
Grupos controles (ratones sin vacunas y desafiados):
No vacunados: Desafío con aislados «calle» No vacunados: Desafío con aislados «fijo»
140 ratones sin vacunas 
20 ratones con 85/423 «calle»
140 ratones sin vacunas 
20 ratones con 85/423 «fijo»
20 ratones con 85/433 «calle» 20 ratones con 85/433 «fijo»
20 ratones con 85/684 «calle» 20 ratones con 85/684 «fijo»
20 ratones con 85/882 «calle» 20 ratones con 85/882 «fijo»
20 ratones con 85/1068 «calle» 20 ratones con 85/1068 «fijo»
20 ratones con 85/1091 «calle» 20 ratones con 85/1091 «fijo»

Para analizar los resultados se empleó la "Prueba de la hipótesis de independencia", en donde nuestra hipótesis nula (H0 ) postula la no existencia de relación entre desafíos con aislados vírales "calle" vs. CVS y "fijo" vs. CVS. Esto quiere decir, que se afirma que enferman de rabia una proporción s imilar de animales independientemente del tipo de desafío. La hipótesis alterna (Ha ) plantea la existencia de relación entre las variables. Por lo tanto, la probabilidad de enfermar de rabia no es la misma en los animales desafiados con los aislados en estudio que en los desafiados con CVS.

Los resultados fueron expresados en una tabla 2X2, de manera de valorar las diferencias con CVS y el virus "calle" y "fijo" mediante el método de "Ji cuadrado" con el fin de docimar la diferencia entre las proporciones de sobrevivientes en cada grupo.

Los tamaños de muestra fueron estimados según Fleiss (Morales y Mansilla, 1989). Se utilizó un a de 0.05% (González, 1989) sin embargo, debido a la comparación múltiple con un testigo (85/423 vs. CVS; 85/433 vs. CVS; 85/684 vs. CVS; 85/882 vs. CVS; 85/1068 vs. CVS y 85/1091 vs. CVS) se aplicó la modificación propuesta por Brunden (Navarro, 1988) en donde al considerar un grupo como referencia para evaluar el resto de los grupos en prueba se debe ajustar el a , quedando en 0.00416. La potencia de la prueba fue estimada según Cohen en 0.8 (Navarro, 1988). Los grados de libertad para una tabla 2X2 corresponden a 1.

Por lo tanto el valor de X2t *8.21, es decir, cualquier valor sobre este se debe considerar como significativo y por lo tanto las variables no son independientes. Si el valor es menor a 8.21 se considera que las diferencias son producto del azar y en consecuencia no indican una relación significativa entre las variables.

Determinación de la capacidad de neutralización por el suero hiperinmune. Se efectuó una prueba de seroneutralización para determinar la capacidad de neutralización de un suero antirrábico de referencia nacional, elaborado en equino, frente a los aislados "fijo" en estudio y CVS. Se determinó someter a esta prueba sólo los aislados "fijo" primero por razones prácticas ya que, se disponía de una escasa cantidad de CRL (g) infectados con los aislados "calle" y un bajo número de ratones disponibles. Frente a esta realidad se optó por los aislados "fijo" por su gran reproductibilidad y por ser esta la forma que se emplea en la elaboración de vacunas antirrábicas.

Para ello se diluyó el suero patrón equino que contiene 120 UI/ml., de manera de obtener 24.00 - 12.00 - 4.00 - 1.33 - 0.444 - 0.148 - 0.0493 - 0.0164 UI/ 0.5 ml. Estas diluciones se enfrentaron con 150 DL50 de cada aislado viral "fijo" y CVS. Luego las mezclas se incubaron a 37ºC por 1 hora 30 minutos. Posteriormente se inocularon 0.03 ml., intracerebralmente a 10 ratones por cada mezcla. Los ratones fueron observados durante 21 días registrándose los animales con y sin sintomatología.

Las dosis efectivas 50% del suero (DE50 es la dosis efectiva de suero que protege al 50% de los ratones), fueron calculadas según Spearman-Kärber y a la vez se determinaron los limites de confianza para cada DL50. Luego se realizaron comparaciones múltiples entre los límites de confianza de los aislados "fijo" y CVS, de manera de ver si existen diferencias estadísticamente significativas y por lo tanto no son producto del azar, en el comportamiento de cada aislado "fijo" y CVS frente al suero patrón.

RESULTADOS

Fijación de los aislados. El procedimiento de inoculaciones sucesivas fue repetido hasta lograr la fijación de cada aislado, lo cual se logró en el pasaje Nº 16 para los aislados 85/423; 85/433; 85/684; 85/882 y 85/1091 y en el pasaje Nº 14 para el aislado 85/1068, donde efectivamente se produjo una disminución del período que comprende desde el momento de la inoculación a la muerte, expresándose como una reducción en el período de observación y un cambio en la distribución y tamaño de los corpúsculos fluorescentes haciéndose más homogéneos y de menor tamaño junto a un aumento en la infecciosidad viral, mostrada claramente en las diferencias de título viral entre aislados "calle" y "fijo" (cuadro 1).

Cuadro 1

Fijación de aislados "calle" de virus rabia según número de pasajes, período de observación e infecciosidad.

Fixation of street rabies virus isolates according to a passage of number, obsrvation period and infectiously.

Identificación 
del aislado 
Número del 
pasaje de 
fijación 
Período de observación 
(días)
Títulos 
virales* 
aislados en
de los 

DL50

«calle» «fijo»
«calle»
«fijo» 
85/423
16 
7 9 4 6
102.80
105.10
85/433
16 
9 10 4 6
102.90
104.30
85/684
16 
9 10 4 6
103.40
104.51
85/882
16 
7 9 4 6
103.90
104.80
85/1068
14 
8 9 3 6
105.10
103.60
85/1091
16 
7 9 4 6
103.90
104.80
*Los títulos vírales están referidos a volúmenes de 0,03 ml.

Determinación de protección conferida por vacunas antirrábicas veterinaria y de referencia nacional. La protección conferida por las vacunas clásicas VAV y VAR en ratones, fue medida por el efecto de muerte que ocurrió después de desafiarlos con los aislados "calle" y "fijo", comparándolos con los resultados obtenidos post-desafío con la cepa de referencia CVS.

La vacuna VAV no fue suficiente para proteger a los ratones desafiados con aislados "calle" 85/423, 85/882 y 85/1091. El número de sobrevivientes para el aislado "calle" 85/423 sólo fue 7 de un total de 31 desafiados (7/31), para el desafío con 85/882 "calle" se obtuvieron 4/30 y en el caso del aislado 85/1091 "calle" 0/37 y para CVS 21/35, es decir, se produjo un nivel de muerte -en los ratones vacunados y desafiados con los aislados señalados anteriormente- por sobre lo esperado, por lo tanto, estos valores no son producto del azar y serían consecuencia de una protección insatisfactoria de la vacuna antirrábica veterinaria Fuenzalida-Palacios frente al posterior desafío con este tipo de aislados (cuadro 2).

Cuadro 2

Protección conferida por VAV* frente a aislados "calle"**

Confered protection by VAV in opposition to "street" isolates.

Aislado 
viral 
ratones
vacunados
Nº ratones con
muertes 
específicas
Número 
ratones 
desafiados
Nº ratones con
muertes
específicas
Porcentaje 
de muertes 
específicas
Nº ratones 
Vivos
85/423 40  9 31 24
77.42
7
85/433
40 
10 30 8 26.67 22
85/684
40 
33 
21.21 
26 
85/882
40 
10 
30 
26 
86.67 
85/1068
40 
31 
17 
54.84 
14 
85/1091
40 
37 
37 
100.00 
CVS
40 
35 
14 
40.00 
21 
*Vacuna antirrábica veterinaria dilución 1:5, en dos dosis de 0.5 ml., a intervalo de una semana cada una, vía intraperitoneal.
**Aislados "calle" 85/423, 85/433, 85/684, 85/882, 85/1068 y 85/1091 con dosis entre 5 y 50 DL50 en 0.03 ml., vía intracerebral.

En los ratones vacunados con vacuna VAV y desafiados con aislados "fijo" 85/684, 85/882 y 85/1068 se produjo un elevado número de muertes, siendo el número de sobrevivientes para cada uno de 0/36, 6/35 y 7/36 respectivamente (cuadro 3).

Cuadro 3

Protección conferida por VAV* frente a aislados "fijo"**

Confered protection by VAV in opposition to "fixed" isolates.

Aislado 
viral 
Nº ratones 
vacunados 
Nº ratones con 
muertes 
específicas 
Número 
ratones 
desafiados 
Nº ratones con 
muertes 
específicas 
Porcentaje 
de muertes 
específicas 
Nº ratones 
vivos 
85/423
40 
39 
24 
61.53 
15 
85/433
40 
37 
23 
62.16 
14 
85/684
40 
36 
36 
100.00 
85/882
40 
35 
29 
82.86 
85/1068
40 
36 
29 
80.55 
85/1091
40 
33 
12 
36.36 
21 
CVS
40 
33 
14 
42.42 
19 
*Vacuna antirrábica veterinaria dilución 1:5, en dosis de 0.5 ml., a intervalo de una semana cada una, vía intraperitoneal.
**Aislados "fijo" 85/423, 85/433, 85/684, 85/882, 85/1068 y 85/1091 con dosis entre 5 y 50 DL50 en 0.03 ml., vía intracerebral.

En el caso de la vacuna VAR ésta no fue capaz de proteger satisfactoriamente en el desafío con los aislados <<calle>> 85/882 y 85/1091, donde el número de vivos post-desafío fue 6/24 y 14/36 respectivamente (cuadro 4).

Cuadro 4

Protección conferida por VAR* frente a aislados "calle"**

Confered protection by VAV in opposition to "street" isolates.

Aislado 
viral 
Nº ratones 
vacunados 
Nº ratones con 
muertes
específicas 
Número 
ratones 
desafiados 
Nº ratones con 
muertes 
específicas 
Porcentaje 
de muertes 
específicas 
Nº ratones 
vivos 
85/423 40
32 
28.12 
23 
85/433
40 
36 
25.00 
27 
85/684
40 
33 
24.24 
25 
85/882
40 
16 
24 
18 
75.00 
85/1068
40 
11 
29 
11 
37.93 
18 
85/1091
40 
36 
22 
61.11 
14 
CVS
40 
37 
16.22 
37 
*Vacuna antirrábica de referencia nacional en dilución 1:10, en dos dosis de 0.5 ml., a un intervalo de una semana cada una, vía intraperitoneal.
**Aislados "calle" 85/423, 85/433, 85/684, 85/882, 85/1068 y 85/1091 con dosis entre 5 y 50 DL50 en 0.03 ml., vía intracerebral.

El desafío con aislados "fijo" a ratones vacunados con VAR fue suficientemente cubierto por la capacidad protectora inducida por la vacuna y por lo tanto no se obtuvieron muertes por sobre lo esperado (cuadro 5).

Cuadro 5

Protección conferida por VAR* frente a aislados "fijo"**

Confered protection by VAR in opposition to "fixed" isolates.

Aislado 
viral 
Nº ratones 
vacunados 
Nº ratones con 
muertes 
específicas 
Número 
ratones 
desafiados 
Nº ratones con 
muertes 
específicas 
Porcentaje 
de muertes 
específicas 
Nº ratones 
vivos 
85/423 40
32 
10 
31.25 
22 
85/433
40 
32 
15.62 
27 
85/684
40 
10 
30 
16 
53.33 
14 
85/882
40 
37 
18 
48.65 
19 
85/1068
40 
38 
15.79 
32 
85/1091
40 
36 
14 
38.89 
22 
CVS
40 
11 
29 
11 
37.93 
18 

*Vacuna antirrábica de referencia nacional en dilución 1:10, en dosis de 0,5 ml., a un intervalo de una semana cada una, vía intraperitoneal.
**Aislados "fijo" 85/423, 85/433, 85/684, 85/882, 85/1068 y 85/1091 con dosis entre 5 y 50 DL50 en 0,03 ml., vía intracerebral.

La mortalidad en ratones no vacunados y desafiados con aislados "calle", "fijo" y CVS del virus rabia se mantuvo en un rango de 85.7 a 100%, por lo tanto, es válida la prueba (cuadro 6).

Cuadro 6

Mortalidad en ratones no vacunados y desafiados con aislados "calle", "fijo" y CVS del virus rabia.

Mortality in not vaccinated mice and challenged with "street", "fixed" isolates and rabies virus CVS.


Aislado
viral
AISLADO «CALLE»
NUMERO DE RATONES 
AISLADO «FIJO»
NUMERO DE RATONES 
Desafiados 
Muertos 
Porcentaje 
Desafiados 
Muertos 
Porcentaje 
85/423
20 
20 
100.00 
19 
19 
100.00 
85/433
20 
20 
100.00 
20 
19 
95.00 
85/684
19 
18 
94.70 
20 
20
100.00 
85/882
16 
16 
100.00 
19 
19 
100.00 
85/1068
85.70 
19 
19 
100.00 
85/1091
19 
19 
100.00 
19 
19 
100.00 
CVS
20 
19 
95.00 
20 
19 
95.00 

Al expresar los resultados obtenidos como X2 encontramos valores significativos para:

Vacunas 
Aislados 
«Calle»
Aislados 
«Fijo»
VAV 
85/423 9.42* 85/684 28.60**
85/882 14.86** 85/882 11.94**
85/1091 31.34** 85/1068 10.66**
VAR 
85/882 21.08**
85/109 19.99**
* Significativo
** Muy significativo.

Cuadro 7

Valores de X2 y significancia en la comparación entre ratones vacunados con VAV, VAR y desafiados con
aislados "calle", "fijo" y con la cepa CVS del virus rabia.

X2 values and significance in the comparasion between vaccinated mice with VAV, VAR and challenged with "street",
"fixed" isolates and CVS rabies virus .

Aislado 
viral 
DESAFIO CON AISLADO «CALLE» 
DESAFIO CON AISLADO «FIJO»
VAV 
X2
VAV 
VAR 
X2
VAR 
VAV 
X2
VAV 
VAR 
X2
VAR 
85/423
9.42 
1.43 
NS 
2.62 
NS 
0.30 
NS 
85/433
1.28 
NS 
0.86 
NS 
2.73 
NS 
3.91 
NS 
85/684
2.81 
NS 
0.70 
NS 
28.60 
MS 
1.41 
NS 
85/882
14.86 
MS 
21.08 
MS 
11.94 
MS 
0.76 
NS 
85/1068
1.45 
NS 
4.01 
NS 
10.66 
MS 
4.26 
NS 
85/1091
31.34 
MS 
19.99 
MS 
0.25 
NS 
0.0062 
NS 
S significativo
MS muy significativo
NS no significativo

Determinación de la capacidad de neutralización por el suero hiperinmune. Los resultados de la seroneutralización nos muestran que fue requerida mayor cantidad de suero antirrábico para neutralizar igual cantidad de virus cuando se enfrento con los aislados "fijo" vs. CVS. El aislado 85/433 "fijo" es el más cercano al virus CVS en relación a DE50 sin embargo difieren estadísticamente (cuadro 9).

En el cuadro 9 se muestran las diferencias de DE50 entre los aislados "fijo" y CVS que en forma creciente son: 85/433; 85/1068; 85/1091; 85/684; 85/423 y 85/882.

El aislado 85/882 "fijo" y "calle" fue el que presentó las mayores diferencias estadísticamente significativas tanto en las pruebas de protección con las vacunas VAV y VAR como en la seroneutralización.

El aislado "fijo" 85/882 fue el que requirió mayor cantidad de suero y el que necesito menor cantidad fue el 85/433 "fijo".

Los resultados en dosis efectivas, límites de confianza y comparaciones múltiples están expresados en los cuadros 8 y 9.

Cuadro 8

Neutralización de aislados "fijo" del virus rabia
con un suero antirrábico de referencia nacional.

Neutralization of "fixed" rabies virus isolates with
antirabies serum of national reference.

Aislado 
viral
DE50 en 
0.5 ml.
Límites de Confianza 
Superior Inferior
85/423
0.38820 
0.6200 
0.24200 
85/433
0.05506 
0.0837 
0.03620 
85/684
0.25660 
0.4390 
0.15000 
85/882
0.49560 
0.7340 
0.33400 
85/1068
0.22410 
0.4060 
0.12380 
85/1091
0.25350 
0.3980 
0.16000 
CVS
0.01212 
0.0166 
0.00883 
*DE50 es la dosis efectiva de suero que protege al 50% de los ratones.

Cuadro 9

Comparaciones de límites de confianza obtenidos por seroneutralización de aislados "fijo" del virus con un
suero de referencia nacional.

Comparisons of confidence limit obtained by sero neutralization test of "fixed" virus isolates with a national serum of
reference.

Aislados 
vírales 
85/423 
85/433 
85/684 
85/882 
85/1068 
85/1091 
CVS 
85/423   MS
NS 
NS 
NS 
NS 
MS 
85/433
MS 
MS 
MS 
MS 
MS 
MS 
85/684
NS 
MS 
NS 
NS 
NS 
MS 
85/882
NS 
MS 
NS 
NS 
NS 
MS 
85/1068
NS 
MS 
NS 
NS 
NS 
MS 
85/1091
NS 
MS 
NS 
NS 
NS 
MS 
CVS
MS 
MS 
MS 
MS 
MS 
S significativo
MS muy significativo
NS no significativo

DISCUSION

Los aislados "fijo" del virus rabia, tienen su origen a partir de aislados naturales pero, luego de sucesivos pasajes en animales de laboratorio sufren modificaciones en sus propiedades biológicas presentando un comportamiento bien definido y de gran reproductibilidad. Estos aislados "fijo" adquieren importancia por ser empleados en la elaboración de vacunas antirrábicas.

Al finalizar nuestro proceso de fijación se logró disminuir el tiempo de muerte post-inoculación, el cual se hizo constante a la vez que aumentó la infectividad viral mostrada claramente en las diferencias de título viral entre aislados "calle" y "fijo" (cuadro 1). La fijación de los aislados "calle" se obtuvo en un número relativamente bajo de pasajes seriados en ratones.

Este último hecho llama la atención en relación al número de pases sucesivos requeridos para la fijación. Es así, que las cepas 51 aislada de un canino y la 91 aislada de un humano, ambas utilizadas en la producción de vacunas antirrábicas nacionales, requiriendo de 50 y 60 pases, respectivamente, para tomar las características de un virus "fijo". Probablemente estas cepas presentaron al inicio de la fijación un período de incubación muy largo y gran capacidad de infectar a especies diferentes al ratón, lo cual, llevó a que el proceso de adaptación al animal de laboratorio fuera prolongado.

Se han podido detectar diferencias de composición en un determinado epitope de la glicoproteína o de la nucleocápside del virus rábico, esto se traduce en distintas cepas con propiedades biológicas e inmunológicas diferentes.

El elevado número de muertes inespecíficas en el período vacunación-desafío es considerado como normal por los profesionales del ISP. En este grupo se incluyeron como muertes inespecíficas a ratones muertos por traumatismos y desnutrición. También fueron adicionados a este grupo ratones eliminados en el momento del desafío, para dejar un grupo homogéneo en tamaño, peso y estado general de salud (cuadros 2, 3, 4, 5).

En el cuadro 6, se muestran los resultados de ratones no vacunados y desafiados con los aislados "calle", "fijo" y CVS, donde claramente se observa el elevado número de muertes específicas (85.7 a 100%), lo cual válida la prueba en términos de infecciosidad y virulencia de cada aislado viral en estudio y CVS.

Las diferencias en protección conferida por las vacunas antirrábicas veterinaria -VAV- frente a los aislados "calle" y CVS arrojaron un valor estadísticamente significativo para el aislado 85/423 y muy significativo para los aislados 85/882 y 85/1091. En cuanto a las diferencias entre los grupos vacunados con VAV y desafiados con CVS y los seis aislados "fijo" fueron estadísticamente muy significativas para 85/684, 85/882 y 85/1068, vale decir, la vacuna nuevamente indujo un nivel de protección insuficiente para poder pasar el desafío satisfactoriamente.

Al utilizar la vacuna VAR las diferencias fueron muy significativas en los aislados "calle" 85/882 y 85/1091, por lo tanto, la vacuna no confirió una protección adecuada y como consecuencia de ello se observaron muertes de ratones sobre lo normal. Los aislados restantes no presentaron diferencias estadísticamente significativas.

Tampoco fueron significativas las diferencias con los seis aislados "fijo" y CVS con la vacuna VAR, lo cual posiblemente se deba a la alta concentración que presenta la vacuna de referencia nacional y a la adaptación de los aislados en animales de laboratorio, lo cual lo acerca al comportamiento del virus estándar o CVS. Por lo tanto, podemos rechazar nuestra hipótesis nula (H0 = las variables son independientes) y aceptar la alterna (Ha = las variables están asociadas) para los aislados "calle" 85/423, 85/433, 85/882, 85/1091 y "fijo" 85/684, 85/882 y 85/1068 vacunados con VAV. Para los grupos inoculados con vacuna VAR rechazamos la hipótesis nula sólo en los aislados "calle" 85/882 y 85/1091.

Diferentes autores (Germano y col., 1988a, b, c; 1990a, b; Cordeiro y col., 1990) han confirmado diferencias antigénicas en distintos aislados vírales, lo cual hace que se comporte de modo diferente frente a las vacunas clásicas (Dellepiane y Díaz, 1986).

Estudios con anticuerpos monoclonales anti-proteína G, han revelado variaciones antigénicas importantes entre las proteínas G de aislados vírales de diferentes especies animales y de distintas localidades geográficas (Díaz, 1994). También a través de la técnica de anticuerpos monoclonales y de la reacción en cadena de la polimerasa (Kamolvarin y col., 1993) se han podido identificar patrones característicos según la especie.

Sin embargo, para el caso de los murciélagos no hematófagos, algunos autores han demostrado que no existe homogeneidad en los patrones de reactividad ya sea dentro de la misma especie o en una zona geográfica determinada. No obstante, otros han identificado patrones muy estables (Díaz, 1994).

Existe la posibilidad que murciélagos insectívoros transmitan el virus rábico a otras especies silvestres, domésticas e incluso el hombre, sin embargo sólo son episodios esporádicos. A nivel mundial se han registrado sólo 29 casos de rabia en humanos con origen en murciélagos insectívoros (Díaz, 1994).

Benmansour y col., (1991) secuenciaron el gen de la glicoproteína del virus rabia de un perro y la compararon con la secuencia del virus CVS, encontrando un 10% de divergencia en la composición aminoacídica. También compararon aislados vírales de humanos muertos por rabia con aislados de perros enfermos, encontrando diferencias que podrían deberse a la transmisión de perro a perro o de perro a humano, sugiriendo la evolución genética del virus rábico.

En nuestro país la vacuna antirrábica clásica llamada de CRL incluye para su preparación tres cepas vírales fijas que probablemente difieren antigénicamente de los aislados en estudio y por lo tanto no protegen satisfactoriamente al momento del desafío.

La nucleocápside se mantendría más conservada a lo largo del tiempo, permaneciendo este antígeno común a los diferentes virus rábico. A diferencia de la glicoproteína en donde se han encontrado diferentes porcentajes de variación aminoacídica, y sería esta la responsable de la falta de complementariedad entre vacuna y aislados vírales. Por ello, quizás sea conveniente realizar ensayos donde se incluyan vacunas antirrábicas preparadas a partir de la nucleocápside del virus rábico. De esta manera, se podría determinar el nivel de protección inducida por la nucleocápside frente a cepas de virus homologas y heterologas.

El nivel de protección de un suero frente a un desafío viral está dado por la capacidad neutralizante de sus anticuerpos (Flamand y col., 1993). Considerando este principio se utilizó un suero de referencia nacional para verificar el comportamiento en relación a la cantidad de suero necesario para neutralizar una cantidad fija de virus "fijo" y CVS.

Los resultados nos indican, que para neutralizar el virus CVS se requirió una cantidad muy pequeña de suero, es decir, con menor cantidad de anticuerpos o bien mayor efectividad de ellos, se neutralizó el virus de forma satisfactoria. En el caso opuesto se encuentra el virus "fijo" 85/882, el cual necesitó de una mayor concentración del suero para poder neutralizar igual dosis viral, por lo tanto, sería este aislado el que posiblemente presente mayores diferencias con respecto a los virus rábicos 51, 91 y CVS que se emplean en la elaboración del suero y de las vacunas en nuestro país (DE50 del virus CVS = 0.01212 vs. DE50 del aislado 85/882 = 0.4956).

Existen diferencias significativas en la neutralización entre los aislados "fijo" 85/423; 85/433; 85/684; 85/882; 85/1068; 85/1091 y CVS, por lo cual probablemente existan diferencias a nivel de antígenos de la superficie viral, encargados estos de inducir la formación de anticuerpos neutralizantes.

En la actualidad la mayoría de los casos positivos a rabia en nuestro país se están registrando en murciélagos insectívoros de la especie Tadarida brasiliensis. Como consecuencia de lo anterior pensamos que existe una potencial fuente de infección del virus rabia, fundamentalmente de murciélagos, para veterinarios, auxiliar veterinario (municipalidades, escuelas de veterinaria, etc.) y personal de laboratorios relacionados con rabia (diagnóstico, producción de vacunas y sueros). La falta, por parte de las vacunas tradicionales, de la capacidad de inducir anticuerpos protectores frente a posteriores desafíos con aislados principalmente "calle", que es la forma como se manipula por el personal auxiliar para el diagnóstico de rabia, hace riesgoso cualquier tipo de contacto con animales y/o materiales presuntamente infectados. Por lo tanto, sugerimos a las autoridades correspondientes, que se continúe en la investigación de estos y otros aislados de manera de determinar si efectivamente existen diferencias entre ellos y con las cepas 51.91 y CVS y a que nivel se presentan. Recordando que no se pueden planificar campañas de prevención y control, sin estudios adecuados que las respalden.

La sugerencia anterior ha adquirido una real importancia al presentarse en el transcurso del primer semestre de 1996, la muerte de un menor a consecuencia, de la mordedura de un murciélago enfermo de rabia.

Resumiendo podemos concluir que:

1.- Los aislados del virus rábico "calle" 85/423, 85/882, 85/1091 y "fijo" 85/684, 85/882 y 85/1068, demostraron diferencias antigénicas con la cepa de referencia internacional CVS, en las pruebas de protección en ratones de laboratorio.

2.- Los aislados del virus rábico "fijo" 85/433, 85/1068, 85/1091, 85/684, 85/423 y 85/882 demostraron -en forma creciente-, diferencias antigénicas con la cepa de referencia internacional en pruebas de seroneutralización.

3.- En el proceso de fijación de los aislados "calle" se requirió un número relativamente bajo de pasajes sucesivos, en cerebro de ratón, para obtener tal fijación.

RESUMEN

El virus de la rabia presenta diferencias antigénicas que han sido detectadas en diferentes regiones y países, lo que podría acarrear un serio problema en relación a las vacunas antirrábicas empleadas en terreno que no se corresponden con las cepas actuantes pudiendo provocar fracaso del tratamiento vacunal preventivo o post-exposición.

Ante la sospecha de la existencia de virus rabia presuntamente atípicos en nuestro país, nos planteamos como objetivo estudiar el comportamiento antigénico de aislados vírales "calle" y "fijo" en relación a la cepa estándar, Challenge Virus Standar, frente a las vacunas antirrábicas veterinaria y de referencia nacional, y el suero antirrábico hiperinmune de referencia nacional.

Se estudiaron 6 aislados de virus rábico presuntamente atípicos (5 de murciélagos y 1 de gato) obtenidos en 1985 en el Instituto de Salud Pública y mantenidos a -70ºC en cerebro de ratón lactante. Para ello, primeramente, con la finalidad de lograr la fijación de los aislados a los animales de laboratorio, se procedió a realizar pasajes sucesivos en CRL, confirmando en cada pasaje la causa de muerte a través de la prueba de inmunofluorescencia directa.

Para determinar la protección conferida en ratones, por las vacunas tradicionales frente a los aislados presuntamente atípicos, se compararon las respuestas de ratones vacunados y desafiados con los 6 aislados en su forma "calle" y "fija", con las respuestas de los ratones vacunados y desafiados con la cepa de referencia del virus estándar de desafío CVS.

Para conocer la capacidad de neutralización del suero de referencia nacional frente a los aislados vírales "fijo", se compararon los resultados de neutralización en ratones, de cada uno de los aislados enfrentados al suero de referencia nacional, con la neutralización de la cepa CVS enfrentada al mismo suero.

La fijación se logró en el pasaje Nº 16, para los aislados 85/423, 85/433, 85/684, 85/882, 85/1091, y en el pasaje Nº 14 para el aislado 85/1068.

En la protección conferida por las vacunas hubo diferencias significativas (p < 0.00416) entre los ratones vacunados con la vacuna veterinaria para los aislados "calle" 85/423, 85/882, 85/1091 y para los aislados "fijo" 85/684, 85/882 y 85/1068. Con la vacuna antirrábica de referencia nacional sólo hubo diferencias significativas diferentes, en forma decreciente, para los aislado 85/882, 85/423, 85/684, 85/1091, 85/1068 y 85/433.

De los 6 aislados nacionales estudiados, en 5 se encuentra un comportamiento antigénico diferente a la cepa CVS, expresado como diferencias en el grado de protección por algunas de las vacunas probadas y/o la neutralización de aislados "fijo" por un suero de referencia, con lo que se podría afirmar que existen aislados atípicos actuando en nuestro país, los cuales, no se comportan en forma semejante a la cepa CVS de referencia.

AGRADECIMIENTOS

Al personal del Instituto de Salud Pública que gentilmente colaboró especialmente, a mi amigo Luis Sepúlveda de Control Interno.

Muy especialmente al Laboratorio de Virología de la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias, de la Universidad de Chile, y a todas aquellas personas que de una u otra manera ayudaron en el desarrollo de este trabajo.
_________________________________
Aceptado: 04.06.99.

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