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Revista médica de Chile

versão impressa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.137 n.10 Santiago out. 2009

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872009001000005 

Rev Méd Chile 2009; 137: 1309-1314

Artículo de Investigación

 

Resistencia a metronidazol y claritromicina en aislamientos de Helicobacter pylori de pacientes dispépticos en Colombia

Antimicrobial susceptibility of Helicobacter pylori strains isolated in Colombia

 

Adalucy Álvarez1a, José Ignacio Moncayo1 b, Jorge Javier Santacruz1b, Luisa Fernanda Corredor1c, Elizabeth Reinosa1d, José William Martínez2, Leonardo Beltrán3e.

1Laboratorio de Microbiología y Parasitología, Centro de Biología Molecular y Biotecnología, Departamento de Ciencias Básicas, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Tecnológica de Pereira, Pereira, Colombia. 2Departamento de Medicina Comunitaria y
3Laboratorio de Genética Médica, Facultad de Ciencias de la Salud, Universidad Tecnológica de Pereira, Pereira, Colombia.

aBacterióloga, MSc en Biología Molecular y Biotecnología
bLicenciado en Biología, MSc en Microbiología
cTicenciada en Biología y Química, MSc en Biología Molecular y Biotecnología
dEstudiante X semestre de Medicina
e
Químico Industrial

Dirección para correspondencia


Background: Helicobacter pylori antimicrobial resistance rates differ among countries and even between different areas of a country. In Colombia, the most commonly used antimicrobials for the treatment of H pylori infection are amoxicillin, clarithromycin and metronidazole. Aim: To determine antimicrobial susceptibility of H pylori strains isolated in Colombia. Materials and methods: Eighty eight strains of H pylori were isolated and identified by microbiological methods and confirmed with polymerase chain reaction (PCR). The detection of antimicrobial resistance to amoxicillin, clarithromycin, metronidazole and tetraclycline, was conducted by the Etest method. Mutations in the 23S rDNA, involved in resistance to clarithromycin, were detected using PCR and restriction fragment lenght polymorphism. Results: Eighty eight and 2.2% of the strains were resistant to metronidazole and clarithromycin, respectively. No isolate was simultaneously resistant to amoxicillin or tetracycline. The two clarithromycin resistant strains were homozygous for the A2143G mutation. No mutations were found in the remaining 86 susceptible strains. Conclusions: The high rate of metronidazole resistance in our population precludes the use of this drug for the empirical treatment of Hpylori infection.

(Key words: Antibacterial agents; Helicobacter pylori; Metronidazole).


 

La infección por Heiicobacter pylori es una de las más comunes en el mundo, causa gastritis y enfermedad úlcero-péptica y se asocia con carcinoma gástrico y linfoma gástrico tipo MALT1. La prevalencia de la infección en pacientes dispépticos en Colombia es mayor a 80%2.

Diversos estudios han demostrado que la resistencia antimicrobiana perjudica significativamente la eficacia de la terapia anti H pylor3. La utilización de regímenes terapéuticos basados en pruebas de sensibilidad antimicrobiana no es lo habitual4. Esto puede atribuirse a la dificultad y al costo del aislamiento del microorganismo y de las pruebas de sensibilidad5, por lo que la mayoría de las guías publicadas para el manejo de la infección por Hpylori recomiendan tratamiento empírico6.

A nivel mundial, la terapia más utilizada es triple y consiste en un inhibidor de la bomba de protones (IBP), más dos antibióticos7. En Colombia, los antibióticos más prescritos para el tratamiento de H pylori son amoxicilina (73%), claritromicina (57%) y metronidazol (37%)8.

El aumento en la prevalencia de la resistencia complica seriamente la enadicación de la infección y esta prevalencia varía geográficamente, aun dentro de un mismo país3. En Colombia, la resistencia reportada para el metronidazol es de 86%, mientras que para otros antimicrobianos no ha sido publicada8.

Los métodos fenotípicos reportados para la detección de la resistencia en H pylori son: dilución en agar, dilución en caldo, breakpoint en agar, difusión con disco y Etest9. El método de dilución en agar es considerado el método de referencia por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). El método de Etest es una de las mejores alternativas disponibles al de dilución en agar y ha demostrado correlaciones que van desde 86% a 99,5% con el método de referencia10,11. Tiene la ventaja de ser un método comercial cuantitativo, fácil de ejecutar e interpretar.

Numerosos métodos genotípicos se han desarrollado para detectar resistencia a claritromicina, debido al impacto de esta resistencia y al bajo número de mutaciones involucradas3. La resistencia a la claritromicina se fundamenta en mutaciones puntuales situadas en el ARNr 23S. La mayoría de los aislamientos resistentes contienen la mutación A2143G (69,8%) o A2142G (11,7%). Mientras que la mutación A2142C sólo representa de 0% a 7% y existen otras menos frecuentes como la T2717C y la T2182C3,9,12.

El presente estudio se realizó para detectar: (a) La prevalencia de la resistencia a los antimicrobianos metronidazol, claritromicina, amoxicilina y tetraciclina en aislamientos de Hpylori, obtenidos de pacientes dispépticos de Pereira y Armenia, (b) la distribución de la concentración inhibitoria mínima (CIM) en las cepas de Hpylori con estos antimicrobianos, y (c) las dos mutaciones más frecuentes involucradas en la resistencia a claritromicina.

Material y método

Población de estudio. Un total de 88 cepas de H pylori obtenidas de pacientes con síntomas dispépticos que asistieron a consulta a unidades de endoscopia en las ciudades de Pereira y Armenia, y aceptaron participar por escrito firmando el consentimiento informado, durante los años 2000, 2003 y 2006. Esta investigación obtuvo aprobación del Comité de Bioética de la Facultad de Ciencias de la Salud, de la Universidad Tecnológica de Pereira.

Cultivos de Hpylori. Las cepas de Hpylori fueron identificadas usando métodos convencionales (morfología de la colonia, coloración de Gram y pruebas bioquímicas como oxidasa, catalasa y ureasa) y uno no convencional (PCR)2. Los aislamientos fueron almacenados en caldo tripticasa soya con glicerol al 20% a -80°C hasta el momento de ser utilizados y en amortiguador TE a -20°C para la extracción del ADN.

Detección de resistencia en las cepas de Hpylori.

1. Método fenotípico por Etest para la detección de la resistencia a metronidazol, claritromicina, amoxicilina y tetraciclina:

Cada una de las cepas de H pylori se cultivaron durante 2 días en TSA-sangre. Los cultivos fueron suspendidos en caldo Bruceiia hasta lograr una turbidez de McFarland 3- La suspensión fue inoculada en cinco placas de agar Mueller Hinton con sangre, una placa por cada tirilla del antimicrobiano a tamizar y la quinta placa fue el control de viabilidad del aislamiento. Las placas se incubaron durante 3 días a 37°C en una atmósfera microaerofílica (5% de 02, el 10% de C02 y 85% N2) (Water Jacketed Incubator, TS Autoflow C02/02, NUAIRE). La actividad antimicrobiana se observó como un halo de inhibición de crecimiento que permite visualizar directamente la CIM, por la escala numérica presente en la tirilla, en el punto donde la elipse cruza con la escala (AB Biodisk, EAS 013). En el presente estudio, el punto de corte para establecer la resistencia a metronidazol, claritromicina, amoxicilina y tetraciclina, se definió como >4,0, ≥1, >1 y >2 mg/L, respectivamente (AB Biodisk, EAS 013). La cepa de Hpylori NCTC 11637 fue utilizada como cepa control.

2. Método genotípico por PCR-RFLP para la detección de resistencia a la claritromicina: A partir del ADN genómico extraído con el kit Wizard® Genomic DNA purification (Promega, Cat Al 120), se realizaron PCRs de las 88 cepas con la pareja de iniciadores (HPYS 5'- AGG TTA AGA GGA TGC GTC AGT C -3' y HPYA 5'- CGC ATG ATA TTC CCA TTA GCA GT -3') (número de acceso Gen Bank 881379)13, para amplificar un fragmento de 267 pb del ARN ribosomal 23S. La reacción de amplificación se efectuó en un volumen final de 50 μl, conteniendo buffer IX, MgCl2 1,5 mM, dNTPs 200 µM, iniciadores 10 pmoles de cada uno, Taq polimerasa (Promega, buffer A) 1.25 U y ADN bacteriano 2 μl. En un termociclador Perkin Elmer Gene Amp 9700, se utilizaron 35 ciclos de 95°C por 45 s, 60°C por 30 s y 72°C por un minuto. Como controles positivos se utilizaron dos cepas de nuestro laboratorio con mutaciones A2143G y A2142G, y como control negativo agua destilada estéril. Los 50 μl del producto de PCR, tanto de las muestras como de los controles, fueron corridos en agarosa de bajo punto de fusión (Fisher, BP1360-100) al 3% teñida con bromuro de etidio (0,01 mg), con buffer TAE IX a 100 voltios durante 50 min. Las bandas de 267 pb fueron cortadas y purificadas con el kit comercial de Promega (Wizard® PCR Preps Cat A7170) o de Amershan Biosciences (GFX PCR DNA and Gel Band Purification), siguiendo las instrucciones del fabricante.

La reacción de RFLP fue llevada a cabo con las enzimas de restricción BbsI(75Ü) y BsaI(15Ü) (New England Biolabs), utilizando 5 μL del producto de PCR purificado, en un volumen final de 15 μL a la temperatura sugerida por el fabricante, durante toda la noche. Los fragmentos de restricción, se comprobaron corriendo en gel de acrilamida al 12%, teñido con bromuro de etidio, con buffer TBE IX a 230 voltios.

Todos los aislamientos con mutación por PCR-RFLP se secuenciaron con el kit BigDye Terminador V3.1. La reacción de secuencia se preparó utilizando por cada muestra 4 μL de Terminator Ready Reaction Mix, 12 pmoles del iniciador HPY-S o HPY-A y 4 μL del producto de PCR HPY-S y HPY-A purificado por los kits comerciales descritos anteriormente. La amplificación se realizó en un termociclador Perkin Elmer GeneAmp 9700 con las siguientes condiciones: 35 ciclos a 96°C por 10 s, 50°C por 5 s y 60°C por 4 min. Este producto de amplificación fue purificado por el método de precipitación con Etanol/EDTA/Acetato, siguiendo las instrucciones del fabricante (kit BigDye Terminator V3.1). El botón se resuspendió en 10μL de formamida y fue corrido en el ABI Prism 3100 Avant (Applied Biosystems), utilizando un capilar de 36 cm y el polímero POP4 (Performance Optimized Polymer, Applied Biosystems). Los datos fueron analizados en el software Sequencing Analysis 5.1. Como control se sometieron a secuencia dos aislamientos que no presentaron mutaciones por el método PCR-RFLP.

Resultados

Detección de resistencia en las cepas de Hpylori:

1. Método fenotípico por Etest para la detección de la resistencia a metronidazol, claritromicina, amoxicilina y tetraciclina:

De las 88 cepas ninguna fue resistente a tetraciclina y amoxicilina, 2,2% (2/88) fueron resistentes a claritromicina y 88% (68/88) fueron resistentes a metronidazol. Las dos cepas resistentes a claritromicina fueron simultáneamente resistentes a metronidazol. En la Tabla 1, se observan los datos de la distribución de las CIMs para metronidazol, claritromicina, amoxicilina y tetraciclina. Las dos cepas resistentes a claritromicina presentaron CIMs de 16 y 32 mg/L. La distribución de las CIMs en las cepas resistentes a metronidazol fue variable, pero la mayoría presentaban CIMs ≥256 mg/L.


2. Método genotípico por PCR-RFLP para la detección de resistencia a claritromicina:

Todos los ADN extraídos de las 88 cepas de H pylori que se sometieron a PCR utilizando los iniciadores (HPY-S y HPY-A) amplificaron un fragmento de 267 pb. De estas 88 cepas sometidas a restricción, en dos (2,2%) se produjeron cortes del producto amplificado, con la enzima de restricción ¿>5a_í originando fragmentos de 208 y 59 pb, indicando la mutación A2143G. Mientras que con la enzima Bbsl no se presentaron cortes, por lo que la mutación A2142G no fue detectada en ninguna de las cepas (Figura 1). Los resultados obtenidos por PCR-RFLP fueron confirmados con la secuenciación del producto de PCR de 267 pb, en las dos cepas que presentaron la mutación A2143G y en las dos cepas controles que no presentaron mutación.


Discusión

Los reportes sobre tasas de resistencia de H pylori en Colombia son escasos, excepto por un estudio publicado en 19988, que mostró una tasa de resistencia a metronidazol de 86%. Nuestros resultados (88%) confirman el anterior informe, y es similar a lo reportado para países en vías de desarrollo3,14,15. En dichas poblaciones, la resistencia a metronidazol se asocia con el uso frecuente de este fármaco para el tratamiento de parasitosis e infecciones ginecológicas3,15,16, y esa situación puede ser la que contribuye a la alta tasa de resistencia en nuestro país. Además, en Colombia, el metronidazol es parte del régimen terapéutico de H pylorP, sugiriendo que su uso también contribuiría a la resistencia. De los aislamientos resistentes a metronidazol, 76% presentaron un CIM ≥256 mg/L, este alto nivel de CIM ya ha sido reportado, pero rara vez en la mayoría de las cepas resistentes17.

La tasa de resistencia a la claritromicina detectada en este estudio (2,2%), se asemeja a los datos de Paraguay (2%) y la VIII región de Chile (2,2%), pero difieren de los datos de Ecuador (9,5%), Brasil (9,8%), México (25%) y de la región metropolitana de Chile (20%)14,15,18,21. Lo que confirma que existe una alta variabilidad geográfica con respecto a las tasas de resistencia, aun en países latinoamericanos. La baja tasa de resistencia encontrada para la claritromicina podría ser explicada por un bajo consumo, debido a que este antimicrobiano no se encuentra dentro de los medicamentos del Plan Obligatorio de Salud. Aunque se ha descrito que luego de las primeras cepas resistentes a macrólidos, esta resistencia se disemina rápidamente en la población expuesta22,23. La tasa de resistencia dual a claritromicina y metronidazol en este estudio fue baja (2,2%), similar a la descrita en Europa (0,8%-9,l%), en Asia (2%-3%) y en algunos países de Latinoamérica como Ecuador (7,1%), Paraguay (2,1%); pero mucho menor a la descrita en México (18%) y Chile (13,2%)3,15,18,21. Cuando existe resistencia a ambos antimicrobianos, los ensayos clínicos han descrito que la infección no se erradica, reforzando la preocupación del uso de esta combinación como primera línea de tratamiento, ya que alrededor de 50% de las cepas pueden adquirir la doble resistencia en pacientes en donde falla la terapia de erradicación3.

No se encontraron aislamientos con resistencia a amoxicilina y tetraciclina, similar a lo descrito por otros autores en otras partes del mundo, donde las tasas de resistencia son ≤1% para la amoxicilina y ≤5,3% para la tetraciclina20,24,25. Sin embargo, existen casos excepcionales en donde se han reportado tasas de resistencia a amoxicilina de 72% y tetraciclina de 59%.

Los resultados de resistencia a claritromicina por PCR-RFLP y Etest confirman la excelente conelación que existe entre la determinación del CIM usando Etest y la detección de mutaciones en el ARNr 23S por PCR-RFLP. Adicionalmente, el método de PCR-RFLP tiene la ventaja de poderse aplicar directamente en muestras de biopsia gástrica y materia fecal, sin necesidad de aislar previamente el microorganismo13,27.

En el ADN genómico de H pylori existen dos copias del ARNr 23S, la mutación en una copia es suficiente para conferir resistencia a claritromicina28,29. La secuenciación mostró que las mutaciones encontradas por PCR-RFLP estuvieron presentes en ambas copias de las dos cepas resistentes a claritromicina.

Se ha comunicado que el nivel del CIM varía de acuerdo con el tipo de mutación, la mutación A2142G se asocia con CIMs ≥64 mg/L y la mutación A2143G con CIMs ≤64 mg/L30-31. Nuestros resultados para la mutación A2143G (CIMs de 16 y 32 mg/L), son similares a lo descrito. En este estudio, fue más frecuente la mutación A2143G al igual como se reporta a nivel mundial31,33.

En conclusión, este es el primer estudio de resistencia antimicrobiana que se realiza en cepas de H pylori obtenidas de pacientes dispépticos de las ciudades de Pereira y Armenia. Igualmente, es la primera vez que se hace un reporte de cepas resistentes en estas ciudades. La alta tasa de resistencia a metronidazol encontrada en este estudio, precluye el uso de este antimicrobiano en el tratamiento empírico de la infección por Hpylori en esta población. Los otros tres antimicrobianos tamizados no presentan inconvenientes para su utilización debido a su baja o nula resistencia.

Es necesario que en todo el país se realice una vigilancia epidemiológica de la evolución de la resistencia en esta especie, ya que es necesario conocer qué ocurre en este aspecto en cada lugar geográfico del país, para orientar los esquemas de tratamiento. Nuestro grupo de investigación ya se encuentra estudiando aislamientos de la ciudad de Manizales, para completar un perfil de la resistencia en la región del Eje Cafetero. Además, los datos de un país en desarrollo como Colombia, contribuyen al conocimiento de las estadísticas epidemiológicas mundiales de la resistencia del Hpylori.

Agradecimientos

Los autores expresan su agradecimiento a la Universidad Tecnológica de Pereira, al Centro de Biología Molecular y Biotecnología y al Laboratorio de Genética Médica. Igualmente, al señor Arcángel de Jesús Mesa.

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Correspondencia a: Adalucy Alvarez Aldana. Universidad Tecnológica de Pereira, Facultad de Medicina, Laboratorio de Microbiología y Parasitología. Vereda La Julita. Pereira, Colombia. E mail: adalucy@yahoo.es /adalucyalvarez@utp.edu.co

Recibido el 29 de enero, 2009- Aceptado el 8 de septiembre, 2009.

Trabajo financiado por la Vicerrectoría de Investigaciones, Innovación y Extensión de la Universidad Tecnológica de Pereira, Colombia.