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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.137 n.7 Santiago jul. 2009

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872009000700014 

Rev Méd Chile 2009; 137: 946-956

ARTÍCULOS DE REVISIÓN

 

La electroforesis capilar como una nueva estrategia en la medicina y el diagnóstico clínico

Capillary electrophoresis, a new diagnostic tool

 

Jonathan J Magaña1,2,a, María de la Luz Arenas-Sordo1,b, Rocío Gómez1,3,c.

1Departamento de Genética, Instituto Nacional de Rehabilitación, México D.F.
2Departamento de Genética y Biología Molecular, Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional (CINVESTAV-IPN), México D.F.
3 Departamento de Variación Genética y Evolución, Escuela Nacional de Ciencias Biológicas, Instituto Politécnico Nacional, México D.F.
a Químico Farmacéutico Biólogo, Doctor en Ciencias con especialidad en Genética y Biología Molecular
b Médico especialista en Genética, Maestra en Ciencias con especialidad en Genética
c
Química Farmacéutica Bióloga, Doctora en Ciencias con especialidad en Biología Celular

Dirección para correspondencia


Capillary electrophoresis (CE) may replace many conventional clinical laboratory methods, such as electrophoresis, Southern blotting, sequencing and HPLC (High-performance liquid chromatography). It is an ideal technique due to analytical speed, the possibility of handling great amount of samples, its capacity to separate small molecules according to their size, charge, hydrophobic and stereo-specificity its good reproducibility the use of small amounts of sample and reagents, its low costs and easy handling. The diagnosis of hereditary diseases or the predisposition to polygenic diseases related to specific mutations or polymorphisms can be carried out with this method. In clinical laboratories, this technique is being used for the analysis of several substrates present in urine or serum and for the diagnosis of some infectious agents. It is also a firsthand tool in forensic medicine for human identification and anthropology.

(Key words: Electrophoresis, capillary; Forensic medicine; Molecular diagnostic tecniques)


La electroforesis capilar (EC) es una herramienta de separación de biomoléculas, que en los últimos años ha tenido gran importancia en medicina; presenta la versatilidad de poder separar aminoácidos, ácidos orgánicos, iones inorgánicos, carbohidratos, esteroides, tioles, contaminantes alimenticios, material genético y algunos fármacos importantes en el estudio de diferentes ramas en el área de la salud (diagnósticos molecular y de laboratorio clínico)1,2. Usualmente el análisis de los diferentes analitos puede realizarse en unos minutos; se requiere de pequeñas cantidades de muestra, en el rango de nanolitros, con una alta reproducibilidad, y con un error estándar relativo de tiempo de migración menor a 0,5%.

En los últimos años, a través de los avances en las técnicas de biología molecular y genética humana, se han desarrollado métodos diagnósticos más sencillos, rápidos y sensibles en el análisis del ADN (ácido desoxirribonucleico). La EC ha contribuido al fortalecimiento de la ciencia y la medicina moderna, permitiendo conocer la secuencia completa del genoma humano3. Debido a las ventajas de la EC, la secuenciación del ADN ha podido automatizarse, lo que permite en la actualidad el conocimiento de las secuencias genómicas del hombre y otras especies con una mayor velocidad y especificidad (15 mil millones de nucleótidos de secuencia en menos de un año)3. En la presente era postgenómica, la velocidad para mejorar el conocimiento de las enfermedades humanas (especialmente las enfermedades multifactoriales), ha aumentado en forma considerable. La información acumulada gracias a la EC comienza a vislumbrar las causas genéticas de muchas enfermedades, fortaleciendo el diagnóstico y reemplazando muchas de las metodologías clásicas para el estudio de la medicina genómica4.

FUNDAMENTO

La EC constituye una técnica de separación basada en la migración diferencial de moléculas (ADN, proteínas, iones inorgánicos, carbohidratos, este-roides, fármacos, etc.) sujetas a un campo eléctrico (de 100 a 500 V/cm) a través de un capilar de menos de 50 µm de diámetro. El interior del capilar se encuentra formado por grupos silanol (Si-OH), los cuales al ser desprotonados (Si-O), elevan considerablemente el potencial de hidrógeno (pH) y favorecen la presencia de analitos específicos5. Como en toda electroforesis, los cationes fluyen hacia la terminal negativa, mientras que los aniones fluyen hacia la positiva, pero la inducción del alto potencial eléctrico permite que: 1) la separación sea más sensible entre las diferentes moléculas (resolución) y 2) el tiempo de análisis sea más corto. Para el caso del ADN, los fragmentos de análisis se encuentran unidos a marcas fluorescentes que son detectadas por un láser de argón (Ar), que las excita a diferentes longitudes de onda (λ) , permitiendo el análisis de múltiples fragmentos al mismo tiempo, que se mueven por la aplicación del campo eléctrico hacia el polo positivo y se separan de acuerdo con la longitud del mismo, de tal forma que los de menor peso molecular viajan más rápido a través del capilar, mientras que los de mayor peso lo hacen más lentamente. Estas características hacen de la EC un método eficiente y económico con capacidad de separar cientos de componentes de forma simultánea, empleando mínimas cantidades de muestras y reactivos, razones suficientes para ser la herramienta de elección en el análisis bioquímico6.

EC EN EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES GENÉTICAS

Con la secuencia completa de nuestro genoma, la medicina tiene en sus manos una compleja tarea, diversificada en varias áreas con el fin de entender la complejidad de los millones de bases que conforman la genética humana. Una de estas áreas tiene el fin de explorar las causas genéticas de las enfermedades y la susceptibilidad de los individuos a padecerlas7. Aunado a este punto, las pruebas diagnósticas genéticas emplean el uso de un gran número de marcadores polimórficos (variaciones específicas en la secuencia del genoma) como son los «microsatélites o STR» (del inglés Short Tandem Repeat), los «minisatélites o VNTR» (del inglés Variable Number of Tandem Repeat), y los SNP (por sus siglas en inglés Single Nucleotide Polymorphism), además de la determinación de mutaciones las cuales están asociadas al desarrollo de muchas enfermedades (Figura 1). Los seres humanos presentan una similitud de 99,9% del genoma, por lo que sólo 0,1% del genoma es altamente variable y hace la diferencia entre un individuo y otro, confiriéndole identidad dentro de la misma especie3. Estas diferencias no son sólo para rasgos físicos, sino también para características genéticas particulares, por las que un individuo puede ser susceptible a desarrollar una enfermedad.


El uso habitual de marcadores polimórficos y mutacionales para el diagnóstico requiere de tecnología automatizada, ya que las técnicas como la electroforesis en geles de agarosa y poliacrila-mida consumen más tiempo y recursos, son menos específicas y reproducibles, y generalmente requieren mayor cantidad de muestra, por lo que actualmente se encuentran casi en desuso. La EC de forma automatizada contribuye principalmente en dos áreas del diagnóstico genético, una de ellas es a través de la secuenciación y la otra es por medio del análisis de fragmentos en los cuales es posible determinar la dosis génica de forma cuantitativa, limitación presente en los geles de agarosa y poliacrilamida3.

ANÁLISIS DE ENFERMEDADES HEREDITARIAS

Aumento en la longitud por número de repeticiones. La EC permite el análisis de la expansión de repeticiones de nucleótidos en el genoma (STRs), constituyéndose como la herramienta ideal para el diagnóstico de algunas enfermedades hereditarias (Tabla 1), en las que la diferencia de una sola repetición puede jugar un papel fundamental en el diagnóstico y transmisión de la enfermedad8. La EC determina el número de repeticiones que identifica a los individuos normales y a los que portan la premutación o la mutación9. Por otro lado, permite la realización de pruebas prenatales diagnósticas (duplicaciones, inserciones, deleciones, trisomías y monosomías), en las que resulta imprescindible acortar el tiempo de los resultados10,11 (Tabla 2), a través de la determinación de la dosis génica, manteniendo constante la concentración de material genético en la amplificación por PCR, determinando de forma cuantitativa la intensidad de fluorescencia (IF) y el área bajo la curva, sin embargo las pruebas citogenéticas continúan siendo el estándar de oro12.




Variación de secuencia. El cambio de un nucleótido en el genoma puede ser indicativo de alguna patología. Se sabe que existen muchas mutaciones puntuales implicadas en el desarrollo de enfermedades (Tabla 3); y una forma de identificarlas es a través de la secuenciación del ADN mediante el método de Sanger, el cual ha sido adaptado a la EC, usando dideoxinucleótidos marcados fluorescentemente, de tal manera que, una secuencia aproximadamente de 300 bases puede ser descifrada en 30 a 45 min, reduciendo hasta 10 veces el tiempo para obtener el resultado3,24.


ESTUDIO DE ENFERMEDADES POLIGÉNICAS

En la actualidad, la mayoría de las enfermedades que se consideran como problemas de salud pública a nivel mundial, están catalogadas como enfermedades multifactoriales y poligénicas; entre éstas podemos mencionar a la mayoría de los cánceres, la diabetes mellitus, la hipertensión, la osteoporosis, la degeneración discal intervertebral, la artritis, la obesidad, la demencia y algunas enfermedades cardiovasculares y psiquiátricas, entre otras26. En este tipo de enfermedades, numerosos genes están implicados en la presencia de la patología, por lo que mutaciones o polimorfismos en estos genes pueden asociarse de manera directa o indirecta con la enfermedad .

Entre las aplicaciones más frecuentes en el diagnóstico clínico molecular se encuentra la determinación de mutaciones puntuales (por secuenciación) en genes de predisposición a cáncer, como sucede en el desarrollo de cáncer de mama, próstata y ovario, relacionados con los genes BRCA1 y BRCA2, p53, Rb, y Bcr-Abl, entre otros30,31. Así como la pérdida de heterocigocidad (LOH) por marcadores STR cercanos a un gen o región cromosómica de interés, característico de numerosos tipos de cáncer32. Las pruebas de hemato-oncología molecular para la identificación de poblaciones clónales de células B y T son importantes para la detección de cáncer; en estos casos, la EC además de su alta resolución, proporciona datos numéricos usando la altura y el área bajo la curva, facilitando con ello la interpretación y proporcionando un tamaño específico de pares de bases para el rearreglo monoclonal .

En la actualidad, se encuentran disponibles kits comerciales que usan un ensayo múltiple, para la determinación de duplicaciones o deleciones con los que se pueden caracterizar diversos tipos de cáncer a través de la EC34.

La EC puede también ayudar a la diferenciación de varios tipos de linfomas y leucemias a través del uso de ensayos de translocación, como en los linfomas no Hodgkin35 (de las células del manto) asociados con la traslocación (t) 11:14 del linfoma de células B (Bclt (11:14)), los foliculares con Bcl2t (14:18) y la leucemia mieloide crónica con Bcr/Abl t (9:22).

DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES INFECCIOSAS

Generalmente, la identificación de muchos microorganismos como bacterias1, virus37 y hongos es complicada debido al riesgo de infección y a la dificultad de desarrollar el crecimiento de cultivos permisibles. La respuesta a estas dificultades puede ser sustentada por medio del análisis a través de métodos de biología molecular, principalmente por EC (Tabla 4).


HERRAMIENTAS EN MEDICINA FORENSE

El ADN genómico nuclear es una entidad extremadamente variable, lo que nos permite nacer con un código genético único e híbrido transmitido de los padres a los hijos, ya que 50% de nuestra información genética proviene de nuestra madre (25% abuela materna y 25% abuelo materno), mientras que el otro 50% proviene del padre (25% abuela paterna y 25% abuelo paterno). La elevada cantidad de locí polimórficos que se encuentran en el ADN no codificante junto con la falta de trascendencia funcional de sus alteraciones (que permite que se perpetúe libremente en sucesivas generaciones), hace que este material altamente variable sea el que más difiera entre los individuos y por ello confiere exclusividad del perfil genético individual, cuyo análisis permite detectar a un individuo en billones de individuos (porque, a excepción de los gemelos idénticos, no hay nadie genéticamente igual) con una confiabi-lidad de 99,99%. Por lo anterior, el perfil genético constituye la herramienta de elección en la identificación humana, siendo el único método aceptado legalmente43. Estas pruebas de ADN permiten establecer relaciones biológicas con elevada precisión empleando para ello cálculos de probabilidad de coincidencia al azar (PCA), lo que nos permite conocer la probabilidad de que dos personas tomadas al azar de una población presenten genotipos exactamente iguales44. La EC puede llevar a cabo el análisis de 15 marcadores genéticos tipo microsatélite marcados con fluorescencia, garantizando la máxima precisión y fiabilidad en pruebas de identificación humana (Figura 2), aun a partir de muestras degradadas o con poco ADN45. Estos marcadores, según las pautas de la Agencia de Investigación Federal de los Estados Unidos de Norteamérica (FBI), constituye el conjunto de secuencias de ADN denominado CODIS (del inglés, Combined DNA índex System) que permite identificar singularmente a una persona de otra en aproximadamente 5 h, requiriendo una cantidad mínima de material genético (0,125 ng)46.


Estas pruebas son empleadas en medicina forense para la identificación de agresores sexuales, asesinos, restos humanos encontrados en accidentes como incendios, desastres naturales y guerras47; la identificación de la relación biológica entre personas perdidas con el fin de demostrar parentesco (empleo que actualmente ha tomado auge entre los migrantes latinos en Estados Unidos de Norteamérica) y pruebas de paternidad, la demostración de linajes reales, así como en los análisis antropológicos y de migraciones48.

Más aún, la EC tiene otras aplicaciones relacionadas a la toxicología forense, dejando de lado técnicas como los inmunoensayos, HPLC y cromatografía que presentaban baja especificidad y sensibilidad, así como la incapacidad de detección49. Entre estas utilidades destacan, el análisis de la orina para la identificación de sustancias ilícitas (opiáceos, barbitúricos, benzodiazepinas, anfetaminas y morfina)50, y en acoplamiento con la quimioluminiscencia (ECL) para la detección de fármacos psicotrópicos (amltriptilina, doxepin, clorpromacina) en los tratamientos psiquiátricos, además de la detección de venenos y toxinas en fluidos y tejidos humanos45,51. Asimismo, se han desarrollado otros protocolos para el análisis de la psilocibina, cocaína, canabinoides (marihuana y hashish), y diferentes isómeros de la metanfetami-na; y la separación de 16 drogas básicas de interés forense en 15 min52.

No obstante, las aplicaciones de la EC en la medicina forense no cesan, pues en combinación con la espectrometría de masas (EC-SM) y la EC de zona (ECZ), se han desarrollado protocolos para la detección de residuos de explosivos orgánicos e inorgánicos (aun parcialmente quemados), así como de trazas de pólvora por el empleo de armas de fuego, sin el factor limitante del tiempo53.

ANÁLISIS CLÍNICO

Debido a la versatilidad de la EC, diferentes biomoléculas se pueden monitorear desde su identificación hasta su cuantificación en el análisis del laboratorio clínico54. La EC permite la separación de proteínas con polímeros de diverso tamaño de partícula, muy parecido a los geles de duodecil sulfato de sodio (SDS), logrando separaciones más rápidas y reproducibles y mejorando los ensayos de immunoblot. Estas ventajas son consecuencia del análisis de algunas proteínas por EC, tales como las proteínas séricas cuyos cambios presentan un interés clínico para la evaluación de pacientes con enfermedades linfoproliferativas, como mieloma múltiple, enfermedad de Waldenström, leucemia, linfoma, amiloidosis, gammopatía de significancia indeterminada54,55.

La proteinuria es una de las anomalías más comunes observadas en el laboratorio clínico, causada por una variedad de problemas patológicos que afectan al riñon y al tracto urinario. Recientemente, se han logrado pequeñas modificaciones de la EC con el fin de realizar este estudio por medio de esta técnica, constituyendo la herramienta de elección, por su sensibilidad, especificidad y rapidez además de que mediante amortiguadores de elevada fuerza iónica y alto pH se logra la disociación de las cadenas proteicas55-57. El empleo de la ECZ ha permitido realizar análisis no invasivos determinando gran cantidad de marcadores biológicos de interés clínico53.

Otra aplicación de la EC es la asociada a la detección de las isoformas de transferrina (Tf), asociadas con variantes atípicas del desorden congénito de glucosilación (DCG), enfermedad autosómica recesiva caracterizada por desarrollo tardío, anormalidades clínicas y neurológlcas, cuyo diagnóstico es difícil, por la carencia de efectividad de otras técnicas58.

Tiene utilidad en la determinación de testoste-rona en fluidos corporales para aplicaciones clínicas, así como para control de dopaje; más aún la EC a través de la técnica de SSCP (análisis de la conformación polimórfica en ADN de cadena sencilla) ha sido empleada en la detección de LOH, fenómeno asociado al cáncer59,60.

OTROS TIPOS DE EC Y SUS APLICACIONES MÉDICAS

En esta era postgenómica, los métodos diagnósticos exigen la búsqueda de mutaciones específicas, niveles de expresión, además del monltoreo farmacéutico de alta sensibilidad que permita efectuar análisis de los pacientes, y de sus características individuales de forma rápida, precisa y con mínima invasión. Las técnicas analíticas convencionales y la nanotecnología se han fusionado para crear un análisis miniaturizado que emplea poca muestra (mlcrofluidos), permitiendo realizar en poco tiempo el diagnóstico de varios padecimientos de forma precisa, simultánea y automatizada45,59. Entre los principales se encuentran:

La electroforesis capilar de afinidad (ECA). Estudia las interacciones biomoleculares no covalentes y determina constantes de asociación y de disociación (entre fármacos y proteínas) permitiendo aislar compuestos de mezclas complejas, cuantificar y caracterizar simultáneamente varios analitos, y detectar biomarcadores de baja abundancia45. Una variante de la ECA, es la EC de inmunoafinidad (ECIA) que contribuye notablemente al diagnóstico clínico y biomédlco colocándose por encima de técnicas como el RÍA (radio inmuno análisis) y ELISA (ensayo inmuno enzimático)45,49. Entre sus aplicaciones se encuentran la detección de enfermedades infecciosas (enfermedad de Chagas, tuberculosis, lepra, el virus del Nilo y el virus de inmunodeficiencia humana (VIH), entre otras)61, así como la determinación de metabolitos farmacéuticos (que pueden inducir daño orgánico, por ejemplo en riñon), de fármacos (metanfetaminas) y esteroides (testosterona) en orina a través de anticuerpos, elevando la sensibilidad, además de permitir un diagnóstico fino y un monitoreo eficaz de los agentes terapéuticos4,59.

La electroforesis capilar en microchip (µEC). Determina en forma precisa el diámetro y concentración de cada fragmento a través de la fluorescencia inducida por láser (LIF), lo que además le permite detectar fragmentos muy débiles superpuestos a otros muy gruesos, consumiendo 1 µL de muestra. Para ello emplea un chip de 4 cm que permite analizar con elevada resolución y reproducibilidad muestras de suero así como productos de PCR62,63.

Entre sus principales aplicaciones en el área clínica se encuentran: a) La determinación de electrolitos en suero, consumiendo un tiempo máximo de 20 s64. b) La detección de mediadores de la inflamación, invirtlendo cerca de 2 min para detectar 12 marcadores diferentes61, c) El monitoreo de bilirrubina libre en neonatos65, d) La detección de interacciones entre proteínas y fármacos (en una fusión entre la liEC con la espectrometría de masas).

Su principal empleo en el diagnóstico molecular tiene que ver con la detección de mutaciones en individuos heterocigotos de los genes p53 y BRCA1 y 2 (relacionados con cáncer), interpretación que resultaba difícil por métodos convencionales de EC60,62. La rapidez del análisis, conjugada con la automatización, la coloca como una herramienta indispensable en el área diagnóstica.

En conclusión, la EC es una técnica sensible y altamente versátil que se encuentra involucrada en investigación genómica y farmacéutica, pero que además se expande constantemente en el diagnóstico molecular y clínico con resultados asombrosos sin contar con las aplicaciones forenses que de alguna forma la hicieron saltar a la fama en sus inicios. Sin embargo su aceptación no ha sido la que se esperaba, pero lentamente y de forma contundente se encuentra siendo utilizada en el análisis clínico de Europa y Japón como una vía alternativa de la electroforesis convencional, ya que la aparición reciente de kits de diagnóstico ha hecho que la industria clínica comience a tener mayor interés en las pruebas que ofrece, en la sensibilidad de las mismas, en el ahorro en el consumo de tiempo y más aún, en el bajo costo por prueba que ofrece esta metodología.

 

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Recibido el 16 de junio, 2008. Aceptado el 6 de octubre, 2008.

Correspondencia a: D. en C. María del Rocío Gómez Ortega. Departamento de Genética. Calzada México Xochimilco. N° 289, Colonia Arenal Guadalupe. C.P 14389 México D.F. Teléfono: (52-55) 59 99 1000 ext. 19403 Fax: (5255) 5645 5603. E mail: ro712005@gmail.com