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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.137 n.7 Santiago jul. 2009

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872009000700003 

Rev Méd Chile 2009; 137: 881-887

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

 

Proliferación celular en la mucosa de la vesícula biliar no tumoral en colecistitis crónicas litiásicas. Expresión de Ki-67 en matrices de tejidos

Immunohistochemical expression of Ki-67 as a marker of proliferation in gallbladder mucosa samples with or without cancer

 

Iván Roa E1, Xabier Elorza D2, Soledad Lantadilla H1, Gilda Ibacache S1, Xabier de Aretxabala U3.

1Servicio de Anatomía Patológica, Clínica Alemana de Santiago. Facultad de Medicina Universidad del Desarrollo. Santiago de Chile.
2Servicio de Anatomía Patológica, Hospital San Camilo, San Felipe.
3Departamento de Cirugía, Clínica Alemana de Santiago.

Dirección para correspondencia


Background: There is paucity of knowledge on the proliferative features of normal or chronically inflamed gallbladder and the mechanisms of development of gallbladder cancer. Aim: To study the proliferation features of non tumoral gallbladder mucosa through the expression of Ki-67 antigen in tissue micro array analysis. Material and methods: The immunohystochemical expression of Ki-67 in tissue micro array was studied in 96 samples of non tumoral gallbladder mucosa (coming from 74 females aged 45±16 years and 22 males aged 53±16 years) and 102 samples of gallbladder cancer (coming from 84 females aged 62± 14 years and 18 males aged 70± 13 years). Results: The staining index of Ki-67 expression was 19±25% (range 096-8996) in samples of non tumoral mucosa and 46±29% (range 396-9896) in gallbladder cancer (p <0.01). Ki-67 was expressed in less than 10% of epithelial cells in 55% of non tumoral mucosa samples and 6% of gallbladder cancer samples. Seventy five percent of gallbladder cancer samples had a staining index of more than 20%. An expression of Ki-67 over 20% or 50% was observed in 25% and 15% of non tumoral mucosa samples, respectively Conclusions: Non tumoral gallbladder mucosa samples have a high proliferation index, measured using Ki-67 immunohystochemical expression. There is a group of samples with cellular hyper-proliferation that maybe related to the pathogenesis of gallbladder cancer.

(Key words: Gallbladder neoplasms; Ki-67 antigen; Microarray analysis)


El cáncer de la vesícula biliar (CVB) continúa siendo uno de los grandes problemas en la patología tumoral maligna de la población chilena1,2. A nivel mundial nuestro país muestra una de las más altas tasas de incidencia y mortalidad3-5 . A pesar de ello, son escasos los estudios sobre esta neoplasia, por lo cual, el grado de comprensión acerca de su patogenia es menor que en otras neoplasias6. La baja frecuencia con que este tumor se observa en países desarrollados, es sin duda la explicación a esta situación7-9.

Respecto de la histogénesis del CVB son múltiples los aspectos desconocidos, especialmente aquellos relacionados con las lesiones precursoras10. La evidencia morfológica y molecular sugiere que la secuencia displasia-carcinoma sería la vía más importante en el desarrollo del CVB10,11.

El proceso por el cual se produciría la transformación desde la mucosa normal hacia la displasia, probablemente a través de la metaplasia de tipo gástrica o intestinal, ha recibido poca atención. Aun menos son los estudios relacionados con el proceso de proliferación celular del epitelio de la mucosa vesicular, que es en último término el sustrato de las lesiones preneoplásicas y del CVB12-14. Las características proliferativas de la mucosa vesicular no tumoral (MNT) crónicamente inflamada, así como su relación con lesiones premalignas del epitelio de la mucosa vesicular aún no son conocidas13,15-18.

Distintos marcadores han sido utilizados como índices de proliferación celular, entre los cuales se destacan la tlmidina tritiada y la bromodeoxiuridina. Ambas se incorporan al ADN en la fase de síntesis y posteriormente son medidas a través de autorradiografía, citometría de flujo o inmunohistoquímica19,20. También se utilizan antígenos que se expresan durante algunas fases del ciclo celular como el PCNA ("ProliferatingCellularNuclearAntigen') o el Ki67. La ventaja de estos últimos antígenos es que pueden ser medidos in situ en tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina. En la actualidad el antígeno Ki67 se emplea rutinariamente en la evaluación del grado de proliferación celular como factor pronóstico en algunos tumores malignos21,22.

El antígeno Ki67 es una proteína nuclear codificada por un gen en el cromosoma 10, definida por su reactividad con el anticuerpo monoclonal Ki-67. Dos isoformas de 345 y 395 kDa han sido identificadas. Ki-67 es expresado durante todas las fases activas del ciclo celular (fase Gl tardío, S, G2 y mitosis) y está ausente en la Fase GO. Durante la interfase Ki67 es detectado dentro del núcleo, en cambio, en la mitosis la mayoría de estas proteínas son re-localizadas en la superficie de los cromosomas. Ki67 es rápidamente degradado cuando la célula entra a un estado no-proliferativo o durante la reparación del ADN.

El objetivo de este trabajo es estudiar algunas características de proliferación de la MNT, a través de la expresión del antígeno Ki67 como índice de proliferación celular y comparar los hallazgos con los observados en el CVB en matrices de tejidos (TMA).

MATERIAL Y MÉTODO

Casos. Se seleccionaron 96 casos de vesículas biliares con colecistitis crónica, sin evidencias de reagudización inflamatoria, signos de regeneración epitelial, displasia, ni tumor, del Servicio de Anatomía Patológica de Clínica Alemana de Santiago y 102 CVB del Hospital de Temuco, Chile. En todos los casos el diagnóstico se realizó en la pieza de colecistectomía. El nivel de infiltración tumoral fue establecido mediante el estudio seriado de la totalidad de la vesícula biliar (mapeo) de acuerdo a protocolos establecidos desde hace más de una década y previamente publicados23,24.

Confección de matrices de tejidos (TMA). Se seleccionaron 3 áreas representativas de cada una de las vesículas biliares no tumorales y de los CVB. Para la confección de las matrices, se utilizó el "Semiautomatic Tissue MicroArrayer Pathology Devices, Inc." con agujas de 2 mm. Los 3 cilindros de tejidos fueron extraídos del bloque donante previa marcación de las láminas teñidas con HE y puestos en el bloque receptor a una distancia de 3 mm de separación. Las inclusiones fueron puestas en estufa a 55°C por 30 min para obtener la adherencia entre las muestras y el bloque receptor.

Técnica de inmunohistoquímica. Se realizó la técnica estándar para tejidos fijados en formalina e incluidos en parafina. Los cortes histológicos de los TMA de 4 mieras de espesor fueron desparafinados e hidratados en concentraciones decrecientes de alcohol. La recuperación de antígenos se realizó mediante exposición a microondas en buffer citrato pH 6,0 y lavados en PBS pH 7,4. Se utilizó anticuerpo antl Ki67 ("monoclonal antibody clone MIB-1 Dako™") en dilución 1/ 100. El anticuerpo primario fue incubado a temperatura ambiente por 60 min y luego incubado con el complejo "Super Picture Polymer Detection Kit™ Zymed" en equipo Dakoautostainer™.

Formas de medición de la positividad. Se consideró como expresión positiva a la tinción nuclear. La intensidad de la tinción positiva se evaluó en escala visual desde claramente perceptible + o débil, ++ moderada, hasta +++ intensa. Los casos dudosos fueron considerados negativos. Como control interno positivo se empleó la tinción de células epiteliales, estromales o linfoides positivas. El conteo se realizó en las áreas de mayor positividad. La medición de la positividad de los casos fue realizada por dos observadores y fue clasificada en base al porcentaje de positividad de las células epiteliales no tumorales como tumorales.

Estadística. Se realizó mediante test de chi cuadrado y exacto de Fisher para las tablas de contingencia.

RESULTADOS

Características generales del grupo estudiado. La distribución por sexo y edad de los 198 casos en estudio (96 casos de MNT y 102 CVB), se resumen en la Tabla 1. En el grupo de MNT 77% (74 casos) correspondieron a mujeres, con un promedio de edad de 44,6 años (DE ± 15,8 años) y los casos restantes a hombres, con una edad promedio de 53,4 (DE ± 16,2 años). El grupo de CVB constituido por 82% de mujeres con un promedio de edad de 61,7 años (DE ±14,4 años) y los casos restantes por hombres con una edad promedio de 69,8 (DE ±13,2 años). La diferencia de los promedios de edad entre hombres y mujeres fue significativa en ambos grupos (p <0,001).


Resultados estudio inmunohistoquímico. El porcentaje de positividad del Ki67 en MNT y en el CVB se resume en la Tabla 2. En la MNT el índice de marcación fue de 18,8% con límites entre 0% y 89% (DE ± 24,7%) y los CVB tuvieron una positividad significativamente mayor de 46% con límites entre 2,6% y 98% (DE ± 29,4) (p <0,001).


La loralización de la tinción positiva en la MNT se observó sólo en las porciones superficiales, en la mayoría de los casos (Figuras 1 A y B), siendo esta área la de mayor proliferación celular en la mucosa vesicular en comparación a las zonas profundas, en donde se observó expresión de Ki67 en forma ocasional y aislada. La constitución de estructuras glandulares más complejas con grupos glandulares o acinos, se observó sólo en relación a focos de metaplasia gástrica o intestinal. En estos casos la positividad se observó en las zonas más profundas de la mucosa, lo cual fue interpretado como un cambio en la loralización de la zona proliferativa de la MNT (Figuras 1 C y D).


En la MNT 54,7% expresó el antígeno Ki67 entre 0% y 10% de las células epiteliales de la mucosa, en cambio, sólo 5,9% de los CVB estuvieron en ese rango (Tabla 2). En porcentajes mayores a 10% los casos de MNT disminuyeron significativamente con un predominio de CVB.

Al clasificar la positividad en grupos de 10% e incluir tanto a los casos de MNT como a los CVB, se observa que en el grupo de 0% a 10% de positividad, 85% del total de casos corresponden a mucosa no tumoral (52 MNT y 9 CVB). Este porcentaje se invierte en el grupo inmediatamente superior (positividad entre 10% y 20%), en donde 71% de los casos correspondieron a CVB (30 CVB y 12 MNT). A partir de 10% de positividad la expresión de Ki67 fue más frecuentemente observada en los CVB que en lesiones no tumorales (Figura 2).


Por su parte los CVB, tuvieron porcentajes de positividad significativamente mayores que los de MNT, con una distribución más homogénea en todos los grupos porcentuales en comparación a la MNT. Sólo 5,9% de los CVB tuvieron una positividad menor de 10% en las células tumorales; en cambio, 75% de los CVB tuvieron una positividad superior a 20% (Tabla 2).

Es llamativo que casi 15% de las MNT mostraron índices de expresión de Ki67 mayores a 50%, y 25% mayor de 20%, es decir, porcentajes francamente anormales para una mucosa del tubo digestivo (Figura 3). En éstos se observa a la MNT en estado de hiperproliferación del epitelio, con una alta cantidad de células epiteliales en fases activas del ciclo celular.


Si se considera como un porcentaje aceptable para un tejido lábil normal de alrededor de 20% de expresión de Ki67, 33% de las vesículas biliares crónicamente inflamadas de nuestros pacientes estarían por sobre esta cifra.

DISCUSIÓN

La proliferación celular, medida a través de la expresión del antígeno Ki67 ha sido extensamente estudiada y validada tanto en tejidos normales como tumorales. La comparación con otras técnicas capaces de determinar el porcentaje de células en fases activas del ciclo celular ha sido extensamente reportada25-27. Sin embargo, la interpretación de los índices de fijación de Ki67 debe realizarse en comparación con tejidos normales, en consideración a la marcada variación que tienen los distintos histiones. Así, el tejido cerebral28, mama29 y otros tienen porcentajes de Ki67 que rara vez sobrepasan el 5%. Otros tejidos como estómago30, colon31, esófago32 y piel27 presentan índices de proliferación algo mayores.

Los escasos estudios realizados en la mucosa vesicular no tumoral con Ki67, muestran porcentajes de positividad de entre 1% y 10% en series que fluctúan entre 6 y 11 casos, lo cual limita significativamente la validez de las observaciones16,33-35 (Tabla 3). Sin embargo, en todos los trabajos este porcentaje es significativamente menor que el encontrado en nuestros casos, lo cual pudiese significar que las células epiteliales de la mucosa vesicular crónicamente inflamada en nuestros pacientes tendrían mayor actividad proliferatlva, lo que pudiese guardar relación con la alta frecuencia de litiasis, inflamación crónica y cáncer vesicular en nuestra población.


El 85% de las MNT mostraron índices de Ki67 menores de 20% y el 70% de los cánceres mayores de 10%, lo cual demuestra una clara separación entre lesiones tumorales y no tumorales en base a los índices de proliferación medidos a través de la expresión de Ki67. Los CVB presentan índices de proliferación significativamente mayores que las MNT (46,1% v/s 18,7%). Sin embargo, a lo menos 15% de las VB no tumorales presentan índices de proliferación celular dentro del rango propio de los CVB. La existencia de este grupo hace suponer la presencia de pacientes con un alto grado de proliferación celular, alteración que pudiese ser la base a la aparición de lesiones de carácter cualitativo y cuantitativo de la diferenciación celular como son las metaplasias y displasias de la vesícula biliar respectivamente.

No existe aún información respecto de factores y vías a través de las cuales se produciría el estímulo proliferativo36,37. La irritación crónica, el estrés oxidativo producto de la inflamación y la presencia de una bilis mutagénica pudiesen determinar estados de mayor actividad prolifera-tiva con un mayor riesgo de transformación neoplásica.

Se requieren estudios genético-moleculares de la mucosa vesicular normal, crónicamente inflamada, metaplasias y displasias para avanzar en la comprensión de la patogenia de esta importante neoplasia en nuestro país.

 

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Recibido el 6 de enero, 2009. Aceptado el 28 de mayo, 2009.

Trabajo financiado por Proyectos Fondecyt 1060375 y Bicentenario PBCT6

Correspondencia a: Dr. Iván Roa E. Avenida Vitacura 5951, Vitacura. Santiago de Chile. E mail: iroa@alemana.cl

Abreviaciones utilizadas:
MNT =mucosa vesicular no tumoral. CVB =cáncer de la vesícula biliar. TMA =matrices de tejidos. DE =desviación estándar