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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.137 n.2 Santiago feb. 2009

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872009000200001 

Rev Méd Chile 2009; 137: 185-192

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

 

Polimorfismo del gen de la tiopurina S-metiltransferasa en donantes de sangre de un hospital universitario

Thiopurine S-methyltransferase gene polymorphism in Chilean blood donors

 

Luis Álvarez L1, Mauricio Venegas S1a, Milton Larrondo L2, Natalia Becerra B1b, Ariel Castro L3c, Rodrigo Quera P1,4.

1Sección de Gastroenterología. Departamento de Medicina Interna, 2Banco de Sangre, 3Unidad de Epidemiología. Hospital Clínico Universidad de Chile. 4Servicio de Gastroenterología Clínica Las Condes.
aBioquímico
bTecnólogo Médico
cQuímico Farmacéutico

Dirección para correspondencia


Background: Thiopurine S-methyltransferase (TPMT) is a cytosolic enzyme that catalyzes the S-methylation of 6-mercaptopurine and azathioprine. Low-activity phenotypes are correlated with polymorphism in the TPMT gene. Patients with low or undetectable TMPT activity could develop severe myelosuppression when they are treated with standard doses of thiopurine drugs. Since ethnic differences in the TPMT gen polymorphism have been demonstrated worldwide, its assessment in the Chilean population is worthwhile. Aim: To investigate the TMPT gene polymorphism in a Chilean blood donor individuals. Subjects and Methods: The frequency of four allelic variants of the TPMT gene, *2 (G238C), *3A (G460A andA719G), *3B (G460A) and *3C (A719G) were analyzedin 210 Chilean blood donors, using polymerase chain reaction (PCR), restriction fragment length polymorphism (RFLP) and allele-specific PCR-based assays. Results: TPMT variants associated to low enzymatic activity, were detected in 16 subjects (8%), who had a heterozygous genotype (*3A in 12; *3C in three and *2 in one subject). No TPMT*3B allelic variant was found. The normal allele (wild-type) was found in 92% ofstudied individuals. Conclusions: The allele TPMT*3A, is the most prevalent in this group of Chilean blood donors, as in Caucasian populations.

(Key words: Blood donors; Genetic polymorphism; Methyltransferases)


La tiopurina S-metiltransferasa (TMPT) representa uno de los ejemplos más notables de cómo la farmacogenética puede contribuir a individualizar un fármaco1. En este sentido, la respuesta al tratamiento con tiopurinas, ya sea azatioprina (AZA) o 6-mercaptopurina (6-MP), que corresponden a fármacos inmunomoduladores que se utilizan en el tratamiento de enfermedades autoinmunes2-5, leucemias6 y en trasplante de órganos7, se podría predecir genéticamente. La AZA es una prodroga que es convertida a 6-MP in vivo, siendo ésta también una prodroga que sufre una serie de reacciones enzimáticas para formar nucleótidos de tioguaninas (6-TGNs), metabolitos activos que pueden ser incorporados al ADN. Dos importantes reacciones inactivan a las drogas tiopurínicas in vivo, la oxidación catalizada por la xantinooxidasa y la S-metilación catalizada por TMPT (Figura 1). Debido a la ausencia de xantinooxidasa a nivel hematopoyético, la metilación por la TMPT tiene un rol preferencial en la metaboli-zación de las drogas tiopurínicas8.


La existencia de polimorfismo en el gen de la TMPT genera variantes alélicas, cuyo fenotipo muestra una capacidad disminuida en la S-metilación de AZA/6-MP, determinando un aumento de los metabolitos activos (6-TGNs), lo que produce una mayor actividad farmacológica, pero también un mayor riesgo de efectos adversos. El gen que codifica para la TPMT se encuentra en el cromosoma 6p22.3, siendo sus alelos heredados de manera codominante y presenta variaciones genéticas que controlan la actividad enzimática9,10. Esta actividad enzimática variable influye en la biodisponibilidad de las drogas tiopurínicas, determinando su nivel de actividad clínica y el riesgo de efectos adversos dependientes de la dosis, dentro de las cuales destaca la mielosupresión. Se han publicado 21 variantes alélicas para el gen de la TPMT, siendo el alelo TPMT*1 el correspondiente al alelo wild type11,13, el cual es el más frecuente y cuyo fenotipo es de alta actividad enzimática. El resto corresponden a alelos asociados con menor actividad de TPMT, de los cuales los alelos TPMT2, *3A y *3C dan cuenta de casos publicados de la disminución de actividad de la TPMT y se generan como productos de polimorfismos de nucleótido único no sinónimos (SNOs)14 La variante TPMT*2 corresponde a una transverssión, G238→ C que causa la sustitución Ala80Pro, G460 → A y A719 → G, que resultan en las sustituciones Alal54Thr y Tyr240Cys, respectivamente. Para el alelo TPMT*3B se observa sólo la transición G460 → A (Alal54Thr) y en el caso del alelo TPMT*3C existe sólo la transición A719 → G (Tyr240Cys).

Estudios epidemiológicos han demostrado diferencias en las frecuencias alélicas de las distintas variantes del gen de la TPMT según el origen étnico de las poblaciones. Estudios realizados en Latinoamérica muestran una mayor frecuencia de alelo TPMT*3A en sujetos de Argentina15, Colombia16 y Bolivia17, mientras que en la población de Brasil el alelo más frecuente corresponde al TPMT*218. Hasta la fecha no existen estudios sobre el polimorfismo del gen de la TPMT en población chilena. El objetivo de este trabajo es determinar la presencia y prevalencia de los alelos de la TPMT en una población de dadores de sangre.

Material y método

Muestras. Se estudiaron, previo consentimiento informado, 210 muestras de sangre de donantes del Hospital Clínico de la Universidad de Chile. La edad promedio fue de 34 años, rango 19-68 años, 84 mujeres y 126 hombres. Todos los individuos incluidos en este estudio provienen de familias nacidas en Chile en sus dos últimas generaciones. Las muestras fueron recibidas en tubos con EDTA como anticoagulante y congeladas a -20oC hasta su procesamiento.

Detección de polimorfismos. Se trabajó con ADN genómico obtenido a partir de las muestras de sangre. Para el aislamiento del ADN se utilizó el kit comercial Wizard® Genomic DNA purification (Promega, Madison WI, USA). Los genotipos de TPMT fueron determinados mediante metodologías de PCR descritas previamente19,20. Estos análisis utilizan pares de partidores que incluyen secuencias intrónicas y exónicas para asegurar la amplificación del gen de TPMT y no de un pseudogen existente en el cromosoma 18q21.1.

Detección de G238C. Se realizó PCR alelo específico. En una reacción se utilizaron los partidores P2W (5'-GTATGATTTTAT GCAGGTTTG-3') y P2C (5'-TAAATAGGAACCATCGGACAC-3') para amplificar un segmento de 256 pares de bases (pb) del exón V del gen normal de la TPMT y en otra reacción se utilizaron los partidores P2M (5'-GTATGATTTTATGCAGGTTTC-3') y P2C, los cuales amplifican un segmento de igual tamaño de la variante que lleva la transversión. Para un volumen de reacción de 30 µL, se utilizaron 10 µL de ADN genómico aislado y las concentraciones finales de los reactivos fueron las siguientes: Tris-HCl 10 mM (pH 9), KCl 50 mM, Tritón® X-100 0,1%, MgCl2 1,5 mM, dNTP's 0,2 mM, partidores 0,5 ^M y 1 unidad de Taq ADN polimerasa (Promega, Madison WI, USA).

La reacción de amplificación se llevó a cabo en el Termociclador PTC-100 (MJ Research) programado con 40 ciclos a 94oC por 40 s, 55oC por 40 s y 72oC por 1 min, con una extensión final de 10 min a 72oC.

Detección de G460A. Se realizó PCR y RFLP En el PCR se amplificó un segmento de 365 pb del exón VII del gen de la TPMT. Para ello, se utilizaron los partidores P460F (5'-ATAACAGAGTGGGGAGGCTGC-3') y P460R (5'-CTAGAACCCAGAAAAAGTATAG-3')- Para el RFLP, 20 µL del amplicón se incubaron por 1 h a 60^ en presencia de 5 U de la enzima de restricción Mwo I (New England Biolabs, Inc. Beverly. MA, USA). Si no existe la mutación, la enzima corta en un sitio el ADN, generando 2 fragmentos, uno de 267 y otro de 98 pb. La presencia de la sustitución G460A elimina el sitio de corte, por lo tanto el amplificado queda del tamaño original.

Detección de A719G. Se realizó PCR-RFLP. En el PCR se amplificó un segmento de 236 pb del exón X del gen de TPMT. Para ello se utilizó los partidores P719F (5'- AATCCCTGATGTCATTCTT-CATAGTATTT-3') y P719R (5'-CAGGCTTTAGCA-TAATTTTCAATTCCTC-3')- Para el RFLP, 20 µL del amplicón se incubaron por 2 h a 37oC en presencia de 5 U de la enzima de restricción Acc I (New England Biolabs, Inc. Beverly, MA, USA). Si no existe la mutación, la enzima no corta el ADN amplificado, quedando del tamaño original. La presencia de la sustitución A719G genera un sitio de restricción, lo que da origen a 2 fragmentos, uno de 150 y otro de 86 pb.

Para todas las reacciones antes señaladas, las detecciones de los productos amplificados y de los fragmentos de restricción fueron detectados en gel de agarosa teñido con bromuro de etidio, visualizados con luz ultravioleta y fotografiados.

Estadística. Para el cálculo de tamaño muestral, se utilizó un universo de 200 donantes de sangre que mensualmente acude al banco de sangre. Con este universo, para una prevalencia de variación del factor α estudiar de 5%, y un error de 5%, el tamaño muestral requerido era de 139 sujetos.

Se utilizó la prueba de para establecer si la población de dadores de sangre se encontraba en equilibrio genético de Hardy-Weinberg para el locus TPMT. Mediante el uso del sistema ABO y Rh como marcadores genéticos, se estimó el porcentaje de mezcla caucásica de la muestra poblacional. Para ello se utilizó los datos de frecuencias publicadas para población española21: ABO-O =0,65; RHD*d = 0,41 y aborígenes chilenos22-23: ABO-O = 0,98; RHD*d = 0,0.

Resultados

De los 210 sujetos estudiados, 16 presentaban alguna de las variantes alélicas mencionadas (7,6%), todos con carácter heterocigoto, siendo de estos 9 hombres y 7 mujeres. En las Tablas 1 y 2 se muestran las frecuencias genotípicas y alélicas, respectivamente. Como se puede observar, el genotipo wild-type es el más frecuente, seguido por la variante TPMT*3A. Ningún individuo presentó la variante TMPT*3B.


 

La distribución genotípica obtenida no se aparta de la esperada en equilibrio de Hardy-Weinberg, considerando dos alelos, el wild-type (TPMT1) y el conjunto de los otros (no-TPMTl). Los valores esperados para TPMT*1/TPMT*1, TPMT*1/noTPMT*1 y noTPMT*1/noTPMT*1 eran de 194,3; 15,4 y 0,3.

El porcentaje de mezcla caucásica de la población estudiada, calculada en base a los sistemas ABO y Rh fue de 68,85%. Su complemento 31,15%, corresponde a componente indígena.

En la Tabla 3 se compara la frecuencia alélica de TPMT de nuestra serie con aquellas publicadas para otras poblaciones24, obteniendo porcentajes similares a las poblaciones caucásicas.


Discusión

El interés en el estudio de las variantes alélicas de la TPMT está dado por el uso cada vez más frecuente de AZA/6-MP en el manejo de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal5, así como su uso en otras patologías como la leucemia linfoblástica aguda infantil, hepatitis autoinmune, artritis reumatoide, miastenia gravis y trasplante de órganos2-4,6,7. En este contexto, los efectos adversos descritos posterior a la administración de estas drogas han sido asociados a la presencia de polimorfismo del gen de la TPMT y que obliga a la suspensión del tratamiento en 15-30% de los pacientes25.

Nuestro estudio es el primer trabajo descrito en extenso que evalúa la presencia de variantes alélicas de esta enzima en una población chilena. Recientemente, en un resumen presentado en un congreso, Jorquera y cols mostraron que 8% de los individuos donantes sanos presentaban variantes alélicas de la TPMT26. Nosotros encontramos la misma proporción; 16 de los 210 (7,6%) sujetos incluidos presentaban alguna de las variantes alélicas, todas al estado heterocigoto. Porcentajes similares han sido descritos en Argentina15, Bolivia17 y Colombia16.

Existe una amplia variación individual en la capacidad de S-metilación de TPMT, lo que depende del tipo de alelo que tiene un individuo, ya sea al estado homo o heterocigoto19. Al respecto, mediante experimentos de expresión heteróloga, se ha descrito que la variante homocigota TPMT*2 posee una disminución de 100 veces en a capacidad de S-metilación27. En el caso de la variante TPMT*3A, si ésta es heredada en forma homocigota, existe una pérdida total de la actividad enzimática28. Por otro lado, los ale los del gen de la TPMT son heredados con un patrón autosó-mico codo minante, por lo que la población heterocigota posee un nivel intermedio de actividad enzimática19.

Aunque 21 variantes alélicas del gen de la TPMT han sido identificadas, sólo tres de ellas han sido asociadas a cambios en la actividad de la TPMT (TPMT*2, *3A y *3C). La TPMT*3A es la variante genética más frecuente en la población caucásica, con una frecuencia que va desde 3,2% a 5,7% dependiendo de la población incluida19,31-36. En la población asiática, la variante TPMT*3C es la más frecuente24. En Latinoamérica, en la población de Argentina15, Colombia16 y Bolivia17 predomina el alelo TPMT*3A, mientras que en Brasil18, el alelo TPMT*3C es más común '. El polimorfismo TPMT*2 es una variante con una baja frecuencia alélica en la población caucásica, entre 0,17% a 0,5%20. En nuestro estudio, la frecuencia alélicas de TMPT*3A, TPMT*3C y TPMT*2 fueron 2,86%, 0,71% y 0,24%, respectivamente. Las diferencias en la frecuencia de las distintas variantes alélicas encontradas en los trabajos realizados en Sudamérica confirman que la composición étnica debe ser considerada al momento de evaluar la presencia de polimorfismos en una población.

Diversas publicaciones han demostrado un alto grado de correlación entre el genotipo y el fenotipo de la TPMT en población caucásica19,37. Jorquera y cols , encontraron que los individuos wild type tuvieron una actividad enzimática significativamente mayor que los heterocigotos, confirmando la correlación que existe entre genotipo-fenotipo26. Si bien nosotros no medimos la actividad enzimática de TPMT, todos los sujetos que presentaban alguna de las variantes alélicas eran de carácter heterocigoto, lo que podría predecir que tendrían una actividad intermedia.

La relación que existe entre la actividad de la TMPT y la respuesta al tratamiento o los efectos secundarios al uso de fármacos tiopurínicos, no es concluyente. En un estudio que incluyó 142 pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (97 con enfermedad de Crohn y 45 con colitis ulcerosa), la remisión se correlacionó con los niveles de 6-TGN (usando los niveles de 6-TGN como un marcador indirecto de actividad de la TPMT38. En otro trabajo, realizado con 92 pacientes pediátricos, se demostró que la presencia de heterocigotos para alguna de las tres variantes TPMT*3, se asoció a concentraciones elevadas de 6-TGN y que todos respondieron al tratamiento39. Sin embargo, sólo uno de cada 13 pacientes que desarrollaron mielosupresión, presentaba esta variante alélica. Gisbert y cols , tampoco pudieron confirmar que la dosis de AZA/6-MP basado en la actividad de la TPMT pueda prevenir el riesgo de toxicidad medular40. Pese a la controversia que aún existe sobre la relevancia clínica del análisis de la actividad de la TPMT o el genotipo de esta enzima, parece razonable sugerir que si se conoce que un paciente tiene una actividad de la TPMT disminuida previo a la iniciación de la terapia, una dosis baja de AZT (1-1.5 mg/kg/día) puede ser útil hasta que la tolerancia y efectividad pueda ser demostrada.

Una de la razones para explicar porqué los resultados sobre la TPMT son tan contradictorios, se debe probablemente a que los estudios en general, han evaluado únicamente los polimorfismos en una de las enzimas de las vías de la metabolización de las tiopurinas. El metabolismo de las tiopurinas está dado por un número variado de vías y varios estudios han tratado últimamente de analizar otros polimorfismos incluidos en estas vías. Una de estas vías es la enzima inosina trifosfato pirofosfatasa (ITPasa) (Figura 1). La deficiencia de la ITPasa se asocia con el polimorfismo de un solo nucleótido que da lugar a un cambio en el aminoácido prolina por una treonina en el codón 3241. La presencia de esta variante alélica se ha asociado a la presencia de efectos adversos como mielosupresión, erupción cutánea y pancreatitis. Sin embargo, recientemente un metanálisis que incluyó seis estudios no pudo demostrar una correlación entre la presencia de este polimorfismo y el riesgo de toxicidad por tiopurinas, sugiriendo que la determinación de la ITPasa no posee ninguna relevancia clínica en pacientes tratados con A2A/6-MP42.

En conclusión, este trabajo confirma que las variantes alélicas de la TPMT encontradas en la población chilena estudiada son similares a las descritas en la población caucásica, aunque la muestra posee 31% de componente indígena.

Si nuestro estudio fuera extrapolable a gran parte de la población chilena, creemos que 7,6% de genotipos que se asocian a baja actividad de TPMT, es un porcentaje alto y que debe ser considerado a la hora de indicar terapia con AZA/6-MP. Sin embargo, si bien la evaluación del polimorfismo de TPMT o la medición de la actividad enzimática pudiese alcanzar un papel en la práctica clínica y ser útil en la evaluación de pacientes que requieren tratamiento con AZA/6-MP para evitar el riesgo de toxicidad hematopoyética, esta estrategia no garantiza que estos eventos adversos no puedan ocurrir, por lo que una monitorización regular de los leucocitos y pruebas hepáticas es aún necesaria.

Agradecimiento

Al Dr. Carlos Valenzuela Yuraidini, Profesor Titular, Programa de Genética Humana, Instituto de Ciencias Biomédicas, Facultad de Medicina. Universidad de Chile; por su valiosa asesoría en conceptos de genética de poblaciones.

 

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Recibido el 15 de abril, 2008. Aceptado el 22 de octubre, 2008.

Trabajo financiado por Proyecto de Investigación Clínico Básico de la Dirección de Investigación del Hospital Clínico de la Universidad de Chile y Proyecto Fondecyt 1070954.

Correspondencia a: Dr. Rodrigo Quera P. Servicio de Gastroenterología, Clínica Las Condes. Lo Fontecilla 441. Santiago. E mail: rquera@clinicalascondes.cl