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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.136 n.4 Santiago abr. 2008

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872008000400005 

 

Rev Méd Chile 2008; 136: 451-458

Artículos de Investigación

 

Estudio de patrones de metilación génica en tumores del tubo digestivo

Gene methylation patterns in digestive tumors

 

Juan Carlos Roa S, Patricia García M, Angélica Melo A, Oscar Tapia E, Miguel Villaseca H, Juan Carlos Araya O, Pablo Guzmán G.

Departamento de Anatomía Patología, Laboratorio de Patología Molecular, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera. Temuco, Chile.

Dirección para correspondencia


Background: The loss of tumor suppresor gene function damages the defensive mechanisms that protect the indemnity of genetic material. Promoter gene methylation is one of the inactivation mechanisms of suppressor genes. Aim: To study the methylation pattern of a group of genes in biopsy samples of gastrointestinal tumors. Material and methods: Forty eight gastric, 25 gallbladder, 24 colon and 6 pancreas cancer biopsy samples were randomly selected. The methylation pattern of CDH1, FHIT, CDKN2A, APC and MLH1 genes, was studied using a specific polymerase chain reaction test for methylation. Demographic, morphological and follow up variables of patients bearing the tumors were also analyzed. Results: The general methylation frequency of CDH1, FHIT, CDKN2A, APC and MLH1 genes was 64.1, 56, 39.8, 18.1 and 34% respectively. In gastric cancer samples there was a correlation between APC gene methylation and well differentiated tumors; between CDH1 methylation and Lauren diffuse type and the presence of three or more metastasic lymph nodes; between FHIT, CDKN2A and CDH1 gene methylation and male gender. In ¡ess differentiated gallbladder tumors, the frequency of CDH1 methylation was higher. There was a tendency towards a lower survival in colon and gastric cancer when MLH1 (p =0.07) y CDKN2A (p= 0.06) were methylated, respectively. Conclusions: An abnormal methylation pattern was associated with morphological features in gastric and gallbladder cancer and with a tendency towards a lower survival in colon and gastric cancer.

(Key words: Digestive system neoplasms; Genes, supressor; Methylation)


Los tumores del tubo digestivo son particularmente frecuentes a nivel mundial. Chile posee una de las tasas más altas de cáncer gástrico en el mundo y la más alta de cáncer de vesícula biliar1, especialmente en mujeres, donde se constituye en la primera causa de muerte por cáncer en mujeres mayores de 40 años1. La incidencia de cáncer de colon ha presentado un continuo aumento en las últimas décadas y todo hace suponer que con el envejecimiento de nuestra población y el cambio de nuestros hábitos aµMenticios, seguirá aumentado en el futuro. Otros tumores digestivos como cáncer de páncreas, vías biliares, esófago e hígado son menos frecuentes2.

La metilación del ADN es una modificación epigenética caracterizada por la incorporación de grupos metilos en la citosina dentro de los islotes de dinucleótidos CpG. La regulación epigenética de la función génica juega un rol relevante en el desarrollo y la metilación es el mecanismo que asegura la expresión específica de tipos celulares de unlimitado grupo o espectro de genes. Diferentes enfermedades, entre ellas el cáncer, presenta patrones alterados de metilación que cambian el balance perfecto epigenético que existe en las células normales3. En las células tumorales, el patrón aberrante de metilación está caracterizado por una hipometilación global del ADN genómico y por hipermetilación de las áreas promotoras. Tales procesos conducen a inestabilidad genómica y a silenciamiento génico respectivamente4-6. La represión transcripcional asociada a metilación aberrante de los islotes CpG en áreas promotoras es la consecuencia de intensos cambios de la estructura de la cromatina, producida por la interacción de metilcitosinas con diferente complejos proteicos que reclutan enzimas que modifican tristonas, como las acetilasas y metilasas de tristonas7.

Genes involucrados en diferentes vías metabólicas pueden sufrir metilación aberrante, incluyendo los genes reparadores de ADN, reguladores del ciclo celular, genes asociados con apoptosis, invasión celular y detoxificación celular, entre otros. Los análisis de la metilación del ADN han permitido asociar fenotipos metiladores con grupos específicos de tumores8. Estos avances han sido posibles debido a la aparición de nuevas metodologías en el campo de la investigación9-11.

El estudio de metilación génica de las áreas promotoras tiene al menos 4 potenciales aplicaciones en clínica12: a) Identificación de células tumorales en muestras biológicas. Como los cambios en la metilación frecuentemente preceden a la aparición de tumores avanzados, su estudio puede ser usado para el diagnóstico precoz, detectando células tumorales desde muestras biológicas13-15 , b) Marcador pronóstico mediante metilación de genes individuales o perfiles de metilación para grupos de genes específicos16-19, c) Marcadores de respuesta a quimioterapia u hormonoterapia19-23, d) Reactivación de genes inactivados por metilación mediante el uso de drogas demetiladoras24. La posibilidad de revertir la metilación del ADN y reactivar aquellos genes afectados es una atractiva opción para su uso como un nuevo blanco terapéutico en el tratamiento del cáncer o de lesiones preneoplásicas12. Es por esto que el estudio de la metilación génica en los tumores de nuestra población nos permitirá, probablemente, identificar blancos génicos con diferentes utilidades en el análisis tumoral.

Para nuestro estudio, se seleccionó genes supre-sores de tumores de diferentes vías metabólicas relacionados con el ciclo celular FHIT (Fragüe Histidine Triad), CDKN2A (pl6) y APC (Adenomatous Poliposis Coli), el gen MLHl (Human Mut Homologue 1) probablemente el más importante de los genes reparadores de ADN genómico, relacionado con inestabilidadlimicrosatelital y el gen CDH1 (Caderina E), que codifica una proteína de transmembrana que participa en el complejo de moléculas de adhesión involucrada en la metástasis e invasión tumora9,10,25.

Objetivo. Analizar el patrón de metilación de importantes genes involucrados en la carcinogénesis en pacientes con carcinomas del tubo digestivo, relacionando tales alteraciones con sus alteraciones morfológicas y el comportamiento biológico de la neoplasia.

MATERIAL Y MÉTODO

Casos. Se seleccionaron 103 casos de pacientes intervenidos quirúrgicamente por tumores digestivos: 48 de estómago (CG), 25 de vesícula biliar (CVB), 24 de colon (CC) y 6 de páncreas (CP) desde el banco de tumores del Departamento de Anatomía Patológica de la Universidad de La Frontera, todos con consentimiento informado aprobado por el Comité de Ética del Servicio de Salud Araucanía Sur. Todas las muestras fueron mantenidas en gel criopreservante (Jung, Alemania) a -70oC. Para la obtención del material, se seleccionó un área tumoral mediante corte de congelación y se fragmentó en cámara fría. En todos los pacientes se obtuvo seguimiento completo y las características clínicas de la serie se obtuvieron desde las fichas clínicas. Se consideró a un paciente como mapuche cuando sus 2 apellidos correspondieron a esta etnia. Para la clasificación morfológica y etapificación de las neoplasias se utilizaron los criterios de la OMS y TNM26.

Extracción del ADN. Se realizó según protocolo del kit de aislamiento de ADN genómico Puregene (CENTRA, USA). Brevemente, los fragmentos de tejido se incubaron a 65oC en una solución de lisis celular y proteinasa K (1 mg/ml) hasta observar lisis tisular total. Las proteínas fueron eµMinadas por precipitación en acetato de amonio 7,5M pH 7,5. El ADN fue precipitado con isopropanol, lavado con etanol 70%, resuspendido en solución de hidratación (buffer TE pH 8,0) y almacenado a -20oC.

Prueba de metilación específica mediante PCR (MSP). Modificación con Bisulfito-. El principio de la modificación de ADN con la técnica de bisulfito de sodio se basa en su capacidad de convertir a todos los residuos de citosina no metiladas en uracilos mediante deaminación, la citosina metila-da es resistente a la reacción y permanece como citosina27. Los iniciadores de PCR utilizados aprovechan estas diferencias para discriminar entre aquellas secuencias metiladas y no metiladas. Se usó el protocolo previamente descrito27. Brevemente, 2 Lig de ADN fueron denaturalizados incubando a 75oC por 15limin en un volumen de 22 µl con NaOH (concentración final 0,27 N). Se agregó hidroquinona y bisulfito de sodio pH 5,0 preparados en fresco, a concentraciones finales de 50µM y 4,2 M, respectivamente, seguido de una incubación a 50oC durante 16 h. El ADN modificado fue purificado y concentrado usando tubos Centricon YM 30 (Millipore, Bedford, MA). La desulfonación se llevó a cabo agregando NaOH a una concentración final de 0,3 N e incubando a 37oC durante 15 min. Después de neutralizar la solución con acetato de amonio, se precipitó durante toda la noche a -20oC con 3 volúmenes de etanol en presencia de glicógeno. Finalmente, se resuspendió en 80 ml de agua desionizada. Amplificación del ADN: Las secuencias de partidores y condiciones de PCR han sido previamente descritas28. Las reacciones fueron realizadas con aproximadamente 100 ng de ADN genómico modificado, 0,2 µM de cada iniciador, 200 µM de cada uno de los desoxinucleótidos trifosfatos, 1,5 mM de MgCl y 0,75 U de Taq Polimerasa (Promega) en un volumen final de 25 µl. Se usó como control negativo 100 ng de ADN genómico sin modificar. Como control positivo de metilación se utilizó ADN genómico comercial (Promega) metilado con Sssl (Biolab) y como control negativo ADN genómico (Promega) no metilado modificado. La integridad del ADN fue confirmada mediante la amplificación de secuencias no metiladas posterior a la modificación con bisulfito. Con el objetivo de verificar la eficiencia de la técnica, se secuenció 10% de las muestras que resultaron metiladas para verificar la técnica utilizada usando el sistema de secuenciación Macrogen. Las secuencias fueron analizadas y comparadas con Lasergene® v7.2 software. Los productos de PCR fueron visualizados mediante electroforesis en geles de poliacrilamida al 12% en buffer TBE y de agarosa al 2% en bufferTAE, teñidos con bromuro de etidio (Figura 1).


Se utilizó el índice de metilación como un indicador de la proporción de regiones promotoras metiladas respecto de la totalidad de los genes estudiados y se calculó dividiendo el número de genes metilados por el número de genes analizados.

Para el análisis estadístico se consideró significación estadística con p <0,05 y se utilizaron las pruebas de Kaplan Meier para el análisis de sobrevida Chi cuadrado y prueba de Fisher para el análisis de variables discontinuas.

RESULTADOS

Características clínicas. Las características generales del grupo estudiado para cada tipo de tumor estudiado se observan en la Tabla 1. Este fue mayoritariamente no mapuche (85,5%) con excepción de los carcinomas de vesícula biliar que mostraron una distribución similar al porcentaje de población mapuche de la Región de la Araucanía (aproximadamente 33% según Censo 2002). La serie total presentó una edad promedio de 62 años. La sobrevida en promedio fue de 31 meses con rango de 1 a 108 meses. Las sobrevidas promedio de los tumores de colon y estómago alcanzaron los 39-44 meses, a diferencia de los tumores de vesícula biliar y páncreas que no superaron los 9 meses. La mayor parte de los tumores (76%) se encontraban en etapas avanzadas (etapas III y IV), especialmente los tumores de vesícula biliar y páncreas. La totalidad de los casos correspondió a adenocarcinomas.


Estado de metilación génica. Las frecuencias de metilación de la región promotora de los genes estudiados en los 103 casos de tumores del tubo digestivo analizados (Tabla 2), fluctuaron entre 18,1% para MLH1 y 64,1% para CDH1. Sin embargo, se observaron marcadas diferencias en el estatus de metilación de los diferentes genes en localizaciones específicas (Tabla 2). En general, las frecuencias de metilación de los órganos específicos fueron similares a los promedios encontrados para ese órgano en particular. Dentro de las diferencias más destacables para los diferentes tumores fue la alta metilación del gen de la E-caderina. El gen MLH1presentó baja frecuencia de metilación (0-12%) en la mayoría de los tumores, con excepción del cáncer gástrico (31%). El cáncer de vesícula biliar fue el que presentó menor frecuencia de metilación, en la mayoría de los genes estudiados.


Encontramos en los casos de cáncer gástrico, que la metilación de la región promotora de los genes CDKN2A, FHIT y CDH1 fue más frecuente en hombres (p <0,05) (Tabla 3). En relación al grado de diferenciación del tumor, se observó que el gen CDH1 presentó una alta frecuencia de metilación en tumores poco diferenciados (p <0,05). En el caso del gen CDH1, se observó también que este gen estuvo frecuentemente metilado en aquellos casos que presentaron 3 o más ganglios positivos (p =0,04). En el cáncer de colon se evidenció una asociación de metilación mas frecuente en CDH1 en pacientes no mapuches (p =0,03)- Para el cáncer de vesícula biliar se observó una tendencia no significativa (p =0,06) de mayor metilación de CDH1 con menor diferenciación histológica.


El análisis del estatus de metilación entre los diferentes genes indicó que en casos de cáncer gástrico existe una correlación significativa entre gen CDKN2A metilado con respecto al estado metilado de los genes FHIT, APC y CDH1 (p <0,05). Igualmente, se observó una correlación significativa similar entre los genes CDH1y FHIT (p =0,01).

Sobrevida y metilación. Se encontró tendencias no significativas entre la sobrevida de los pacientes con cáncer gástrico y el patrón de metilación del gen CDKN2A, y entre sobrevida con cáncer de colon y metilación del gen MLH1. El 65% de los casos presentaron más de 2 genes metilados, es decir, un índice de metilación de 0,4 o superior (Figura 2).


DISCUSIÓN

En nuestro estudio analizamos el perfil de metilación de 5 conocidos genes, todos ellos relacionados con distintas vías carcinogenéticas alteradas en tumores humanos. La prueba aplicada en este estudio, mediación específica mediante PCR (MSP), detecta hasta 0,1% de ADN metüado, constituyéndose en una técnica altamente sensible que permite la pesquisa de este fenómeno, incluso en las primeras etapas del desanollo carcinogenético, donde la cantidad de alelos metüados puede ser muy escasa27.

Los tumores de la vesícula biliar presentaron una frecuencia de genes moderadamente metüados, sin embargo, notablemente más bajos que en los otros tumores estudiados. En estelimismo sentido, el índice de metilación, relación que representa la cantidad de genes metilados sobre el número de genes estudiados, mostró que sólo un tercio de las muestras de CVB mostraron 40% o más de los genes metilados (IM ≥0,4) y en el resto de los tumores, éste alcanzaba a más de los 2/3. La causa de esta diferencia no es clara, no obstante la influencia de la inflamación crónica o contacto con diferentes carcinógenos debiese ser investigado.

Aun cuando la metilación del gen CDH1es muy frecuente en todos los tumores estudiados, cuando se excluye a los CVB, la frecuencia de metilación se eleva hasta 85% en el resto de los tumores digestivos. El gen CDH1(Caderina E) pertenece a una familia de genes que se encuentran directamente relacionados con procesos de invasión tumoral y desestabilización del citoesqueleto y se han asociado a tumores menos diferenciados y que presentan clara relación con pronóstico29-33. Eso explica y valida nuestros resultados en cáncer gástrico y CVB donde se puede evidenciar una directa asociación entre el grado de diferenciación tumoral (CVB y CG), metástasis ganglionares linfáticas (CG) y metilación génica. Es destacable la asociación de etnia mapuche y metilación de CDH1, lo cual no tiene una explicación consistente en este momento.

El gen CDKN2A es un gen supresor de tumores que codifica una proteína conocida como pió, que es un inhibidor de una ciclina dependiente de quinasa34,35 una menor expresión de pió resulta en un aumento de la actividad de la ciclina D dependiente de quinasa, lo cual se traduce en una fosforüación aberrante del gen retinoblastoma (RB), con un subsecuentemente aceleramiento del crecimiento celular36,37, favoreciendo la aparición de una neoplasia. En nuestro estudio, el gen CDKN2A mostró una particular predisposición a estar metüado en pacientes con cáncer gástrico de sexo masculino, y en pacientes con peor sobrevida. Sorprendentemente, la mediación de este gen se asoció significativamente con la presencia de metüación en FHLT, APC y CDH1. Estas vías carcinogénicas se encuentran separadas de la vía del CDKN2A, por lo que subsecuentes estudios mecanísticos deberían dilucidar la posible relación que pudiese existir entre ellos.

El gen MLH1clásicamente asociado a inestabilidadlimicrosatelital, se ha correlacionado con el pronóstico en tumores gástricos, de colon y recto y algunos tumores endocrinos pancreáticos38,39.

El gen FHIT, inicialmente de función desconocida, se reconoce con certeza su función supresora de tumores y ha mostrado una clara tendencia a estar metilado en subgrupos de pacientes con peor pronóstico40.

La inactivación del gen APC se ha correlacionado con peor pronóstico41. En nuestra serie no observamos relación del estatus de metilación de estos genes con características clínico-patológicas.

La alta frecuencia de metilación anormal en pacientes con tumores digestivos confirma la importancia de este tipo de alteración epigenética en la carcinogénesis de estas neoplasias. Confirmamos la aparición de diferentes perfiles de metilación específicos de las áreas promotoras génicas, con una clara disminución de los niveles de metilación en los tumores vesiculares en relación con los otros tumores gastrointestinales. De nuestro análisis, podemos comprobar que la metilación de estos genes se relacionó en forma estadísticamente significativa con importantes parámetros clínicos y morfológicos asociados con superviviencia para tumores específicos como fueron la presencia de metástasis ganglionar linfática en cáncer gástrico (CDH1) y el grado de diferenciación histológica en cáncer gástrico y de vesícula biliar (CDH1). Mostrando, además, tendencias no significativas entre cáncer gástrico, de colon y el estatus de metilación de CDKN2A y MLH1 respectivamente. Así, el hallazgo de alteraciones en el patrón de metilación de genes supresores de tumores en tumores digestivos es una herramienta más en la búsqueda de nuevos criterios de decisión terapéutica e indicadores pronósticos.

 

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Recibido el 7 de mayo, 2007. Aceptado el 30 de octubre, 2007.

Financiado en parte por proyecto de la Dirección de Investigación de la Universidad de La Frontera (DIUFRO) 120537.

Correspondencia a: Dr. Juan Carlos Roa. Departamento de A. Patológica. Laboratorio de Patología Molecular, Facultad de envejecimiento de nuestra población y el cambio Medicina. Universidad de La Frontera. Manuel Montt # 112. Código Postal 478-1176. Temuco, Chile. E mail: jcroa@ufro.cl