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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.135 n.1 Santiago ene. 2007

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872007000100003 

Rev Méd Chile 2007; 135: 17-25

ARTÍCULOS DE INVESTIGACIÓN

 

Identificación de asociaciones clínico-patológicas e hipermetilación de genes supresores de tumores en cáncer gástrico difuso a través de análisis de Hierarchical clustering

Hierarchical clustering analysis to detect associations between clinical and pathological features of gastric tumors and hypermethylation of suppressor genes

 

Luis Zavala G1a, Víctor Luengo J1a, Francisco Ossandón C1b, Erick Riquelme S1c, Claudia Backhouse E2c, Mariana Palma V2c, Jorge Argandoña C2d, Miguel Angel Cumsille3e, Alejandro Corvalán R1,2.

1Departamento de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina Pontificia Universidad Católica de Chile, 2Instituto Chileno Japonés de Enfermedades Digestivas, Hospital Clínico-San Borja Arriarán, Campus Centro y 3Escuela de Salud Pública, Facultad de Medicina Universidad de Chile.
aAlumno de Medicina
bAlumno de Bioquímica
cTecnólogo Médico
dLicenciado en Tecnología Médica
eMagíster en Bioestadística

Dirección para correspondencia

 


Background:Methylation is an inactivation mechanism for tumor suppressor genes, that can have important clinical implications. Aim: To analyze the methylation status of 11 tumor suppressor genes in pathological samples of diffuse gastric cancer. Material and methods: Eighty three patients with diffuse gastric cancer with information about survival and infection with Epstein Barr virus, were studied. DNA was extracted from pathological slides and the methylation status of genes p14, p15, p16, APC, p73, FHIT, E-caderin, SEMA3B, BRCA-1, MINT-2 y MGMT, was studied using sodium bisulphite modification and polymerase chain reaction. Results were grouped according to the methylation index or Hierarchical clustering (TIGR MultiExperiment Viewer). Results: Three genes had a high frequency of methylation (FHIT, BRCA1, APC), four had an intermediate frequency (p15, MGMT, p14, MINT2) and four had a low frequency (p16, p73, E-cadherin, SEMA3B). The methylation index had no association with clinical or pathological features of tumors or patients survival. Hierarchical clustering generated two clusters. One grouped clinical and pathological features with FHIT, BRCA1, and APC and the other grouped the other eight genes and Epstein Barr virus infection. Two significant associations were found, between APC and survival and p16/p14 and Epstein Barr virus infection. Conclusions: Hierarchical clustering is a tool that identifies associations between clinical and pathological features of tumors and methylation of tumor suppressor genes.

(Key words: Cluster analysis; Genes, supressor; Stomach neoplasms)

 


El cáncer gástrico representa la segunda causa de muerte por cáncer en el mundo1. En Latinoamérica, Chile ocupa el segundo lugar en mortalidad después de Costa Rica, sumando ambos países casi 50% de la mortalidad en este continente2. En Chile, el cáncer gástrico es la primera causa de muerte por enfermedades neoplásicas3, a pesar de una constante declinación en su mortalidad durante varias décadas y una estabilización entre 19 y 20 por 100.000 habitantes a fines de la década 1990-994. En este mismo período ha ocurrido un cambio en el perfil epidemiológico del cáncer gástrico, ya que se ha reportado un aumento en la proporción de casos de cáncer gástrico difuso (CGD), una característica considerada de mal pronóstico para esta enfermedad9.

Desde mediados de la década 1980-89, el reconocimiento de activación de oncogenes e inactivación de genes supresores de tumores (GST) en el proceso neoplásico, ha permitido proponer un modelo genético del cáncer, en el que por lo general existe un tipo de genes (GST u oncogenes) asociado de forma específica a un tipo de cáncer. Así, la identificación de los GST responsables del CGD tendría un impacto importante en el diagnóstico precoz, ya que podrían utilizarse como marcadores de tamizaje en sujetos con riesgo de desarrollar esta enfermedad. Los GST pueden ser inactivados por 2 mecanismos, deleción y metilación. Entre ellos, la metilación ocurre por incorporación de un grupo metilo en el carbono 5 de citosina, convirtiéndola en 5-metilcitosina10. Esta modificación epigenética ocurre con mayor frecuencia en regiones regulatorias de la expresión génica (secuencias promotoras), provocando represión transcripcional y, en consecuencia, inactivación génica10,11. La metilación ha sido recientemente reconocida como mecanismo frecuente de inactivación de GST en tumores humanos y algunos de ellos con importantes asociaciones clínico-patológicas12-22. Sin embargo, el estudio de la inactivación de GST por metilación y su significado clínico-patológico en CGD es escasa y de genes aislados23.

Actualmente, el reconocimiento del significado clínico-patológico de marcadores requiere de nuevas herramientas estadísticas. En este sentido el análisis mediante hierarchical clustering, una herramienta de emergente uso, ya que permite agrupar información recogida de múltiples variables y asociarlas a casos con características similares entre sí, generando clusters o agrupamientos. A partir de los clusters generados sería posible identificar asociaciones entre marcadores biológicos (como metilación de ciertos genes) y variables clínico-patológicas particulares. El objetivo de este trabajo es analizar la frecuencia de metilación de la región promotora de 11 GST relacionados a distintas vías metabólicas relevantes en la patogénesis del CGD y explorar sus asociaciones con variables clínico-patológicas utilizando el método de hierarchical clustering.

MATERIALES Y MÉTODOS

Casos clínicos. El estudio se realizó a partir de 305 casos de cáncer gástrico, en tejido incluido en parafina, de piezas quirúrgicas de pacientes operados entre 1993 y 1999 en el Instituto Chileno-Japonés de Enfermedades Digestivas - Hospital Clínico San Borja Arriarán. De este material, y utilizando la definición de Lauren24 para CGD25, se identificaron 83 casos que son la base del presente estudio. Las características clínicas de estos casos se obtuvieron de la revisión de fichas médicas y las características patológicas de informes anátomo-patológicos y revisión de láminas correspondientes. Las características clínicas consideradas fueron sexo (hombre, mujer), edad (menor o igual a 58 años, mayor de 58 años), sobrevida global (censura). Las características anátomo-patológicas consideradas fueron ubicación del tumor (antral, no antral), infiltración de pared gástrica (mucosa/submucosa, muscular propia/serosa) y compromiso ganglionar (sin consignar número de ganglios comprometidos) de acuerdo a la Unión Internacional Contra el Cáncer. Adicionalmente, incluimos la presencia del virus Epstein Barr (EBV) como variable anátomo-patológica en este estudio, dado que nuestro grupo ha descrito recientemente una fuerte asociación entre CGD y la infección por EBV26. Este estudio cuenta con la aprobación del Comité de Ética del Servicio de Salud Metropolitano Central (Hospital Clínico San Borja Arriarán).

Extracción de ADN. A partir de cortes histológicos de 50 micras, se realizó extracción de ADN según el método de proteinasa K27. Brevemente, el tejido obtenido del corte histológico fue traspasado a tubos de 1,5 ml y resuspendido en 100 µL de tampón de extracción (Tris pH 8,0, 50 mM; EDTA 1 mM; Tween 20 0,5%) con proteinasa K (1 mg/ml). Las muestras fueron incubadas a 55°C x 12 h y a 100°C x 10 min; luego, centrifugadas a 12.000 r.p.m. por 20 min y el sobrenadante traspasado a tubos estériles y mantenidos a -30°C hasta su modificación por bisulfito de sodio.

Modificación por bisulfito de sodio. El método se basa en la conversión de todos los residuos de citosinas no metiladas a uracilos (U) mediante deaminación. Sin embargo, los residuos metilados de citosinas que son resistentes a la modificación permanecen como citosinas28,29. Esta diferencia es utilizada en la amplificación por PCR a través de partidores específicos para cada condición. Brevemente, a 25 µL de ADN extraído, se agregaron 25 µL de agua bidestilada estéril, 5,5 µL de NaOH 2M y se incubó a 37°C durante 10 min. Luego agregamos 30 µL de hidroquinona (55 mg en 50 ml de agua estéril) y 520 µL de bisulfito de sodio (3,76 g en 10 mL de agua estéril) y se incubó a 55°C durante 16 h, de acuerdo a protocolos publicados para tejido incluido en parafina. Posteriormente, se utilizó el sistema de purificación Wizard® (Promega), agregando 1 mL de resina de purificación a 500 µL de ADN tratado con bisulfito de sodio. Luego, lavamos con 2 mL de isopropanol, adicionamos 50 µL de agua bidestilada a 65°C y 8,25 µL de NaOH 2M, 1 µL de glicógeno ultrapuro y 17 µL de acetato de amonio 10 M. La mezcla fue precipitada en etanol absoluto a -20°C durante 1 h, resuspendida en 50 µL de agua DEPC.

Reacción de polimerasa en cadena. La reacción de polimerasa en cadena se realizó en un volumen de 25 µL con 10 mM Tris-HCl pH 8.0, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl, 200 µM dNTP, 0.5 µM partidores, 2.5 U Taq polimerasa y 4 µL de ADN extraído y tratado con bisulfito previamente. Las condiciones de amplificación fueron desnaturación inicial a 94°C x 5 min x 1 vez, seguidos de 40 ciclos de desnaturación a 94°C x 30 s, alineamiento a 63°C x 1 min y extensión a 72°C x 30 s; posteriormente sigue una extensión final de 72°C x 5 min. La temperatura de alineamiento se ajustó experimentalmente para cada gen incluido en el estudio. Para cada muestra se realizó en paralelo la amplificación del gen ß-globina humana, para controlar pérdida de señal y eficiencia de la reducción. El resultado se analizó por electroforesis en geles de agarosa al 3% a 200 volts, durante 20 min y visualización por luz UV posterior a tinción con bromuro de etidio al 0,05%. Los genes seleccionados en este análisis fueron p14, p15, p16, APC, p73, FHIT, E-caderina, SEMA3B, BRCA-1, MINT2 y MGMT30, en base a revisión de la literatura. Dado el alto número de genes y casos analizados, utilizamos la estrategia descrita por Kang y col27 en la cual se amplifica la condición metilada de todos los genes analizados, pero sólo la condición no metilada del gen p16, como control positivo de modificación de bisulfito de sodio. Las secuencias de los partidores y el tamaño de amplificación fueron tomados de la literatura y se muestran en la Tabla 1.


Estadística. Los resultados fueron agrupados según el índice de metilación (IM), que se define como la proporción de genes con metilación positiva dentro del total de genes analizados y se clasificó como alto si tenía un valor mayor a 30% o bajo si era menor a 30%, de acuerdo a Makarla et al31. Adicionalmente utilizamos el método hierarchical clustering, el cual mide la similitud de las variables analizadas mediante la métrica euclidiana, considerando la máxima distancia de los componentes de los clusters entre sí (complete linkage)32. De este modo el hierarchical clustering, a diferencia de otros métodos estadísticos, permite tener una visión gráfica de asociaciones particulares entre los genes estudiados y las variables clínico-patológicas entre sí y no promedios de datos como el IM. Las asociaciones más cercanas observadas mediante el hierarchical clustering fueron confirmadas por el test de chi cuadrado, con un valor significativo de p <0,05 (Epinfo 2000).

RESULTADOS

Los casos seleccionados correspondieron a 53 hombres y 30 mujeres, con un promedio de edad de 57,8 (rango 20-84) años. Cuarenta y ocho casos (60,8%) estaban en localización no antral y 31 (39,2%) en ubicación antral. En 4 casos (5%), la localización no estaba consignada. Doce (14,5%) tumores eran incipientes (1 con metástasis ganglionar) y 70 (84,3%) avanzados. En un caso (1,2%) el estadio no fue consignado. Veintiún tumores (25,3%) de la serie eran de tipo mucinoso (10 casos) y anillo de sello (11 casos). Al momento de la selección, 46 pacientes estaban muertos (42 de ellos por CGD y 4 por otras causas), con un promedio de sobrevida de 68,2 meses.

Frecuencia de metilación genética en 83 casos de cáncer gástrico difuso (CGD). La frecuencia de metilación de 11 GST en 83 casos consecutivos de CGD se muestra en la Tabla 2 y Figura 1. La frecuencia de metilación varió desde 67,5% (FHIT) a 15,7% (SEMA3B). Tres genes demostraron una alta frecuencia de metilación: FHIT, BRCA1 y APC, 4 genes demostraron una frecuencia intermedia: p15, MGMT, p14 y MINT2 y 4 genes demostraron una frecuencia baja de metilación: p16, p73, E-caderina y SEMA3B. No se observan casos sin metilación en los genes estudiados.



Figura 1. Ejemplos representativos de PCR metilación específica (MS-PCR) para la forma no metilada de p16 (NM) y metiladas de p16, BRCA1 y APC.

Índice de metilación y correlaciones clínico-patológicas. Para comprender el significado clínico-patológico de la metilación de 11 genes en 83 casos consecutivos de CGD, agrupamos nuestros resultados de acuerdo al IM (ver Materiales y métodos). Treinta seis casos tuvieron un IM mayor a 30% y se consideraron como IM alto. Cuarenta y siete casos tuvieron un IM menor a 30% y fueron considerados IM bajo. Las correlaciones clínico-patológicas de ambos grupos se muestran en la Tabla 3. No encontramos características clínico-patológicas específicas de uno u otro grupo, con la excepción de una tendencia a baja frecuencia de infección por virus de Epstein-Barr en los casos IM bajo (p =0,07). El análisis de sobrevida mediante el método de Kaplan-Meier, no demostró asociaciones entre sobrevida e IM (datos no mostrados).


Análisis de hierarchical clustering y correlaciones clínico-patológicas. Para identificar asociaciones de metilación de genes particulares con variables clínico-patológicas específicas realizamos el análisis de hierarchical clustering (Figura 2). Este análisis nos generó dos clusters uno superior, donde se agruparon todas las variables clínico-patológicas (excepto ubicación y presencia de EBV) y los tres genes de mayor frecuencia de metilación identificados en este estudio (FHIT, BRCA1 y APC). Por otra parte, en el cluster inferior, se agruparon los restantes 8 genes junto con la variable ubicación e infección por EBV. A partir de los clusters generados, realizamos análisis de asociaciones clínico-patológicas con genes específicos. Este análisis nos permitió identificar dos asociaciones estadísticamente significativas, metilación de APC y menor sobrevida (Figura 3) y metilación de p16 y p14 en casos de CGD asociado a EBV22 (Tabla 4).


Figura 2. Análisis de hierarchical clustering en 83 casos de cáncer gástrico difuso. Se observan dos clusters, uno superior con todas las variables clínico-patológicas (excepto ubicación y presencia de virus EB) y FHIT, BRCA1 y APC y uno inferior con 8 genes y ubicación e infección por EBV. Se observa una fuerte asociación entre metilación de p16 y p14 e infección por EBV.


Figura 3. Análisis de sobrevida Kaplan-Meier para comparación de metilación de APC entre carcinomas gástricos difusos.


DISCUSIÓN

Nuestros resultados muestran una frecuencia importante de metilación de 11 genes en una serie consecutiva de CGD. El índice de metilación en nuestros datos confirma el fenotipo metilador en CGD, como ha sido descrito previamente33. Sin embargo, el estudio de las correlaciones clínico-patológicas e IM no indica asociaciones significativas que diferencien los grupos alto versus bajo. Sin embargo, el mismo conjunto de datos analizados por hierarchical clustering nos permite una lectura gráfica de asociaciones específicas entre variables clínico-patológicas y genes particulares. Esta estrategia nos permitió la identificación de 3 genes FHIT, BRCA1 y APC, cuya metilación está asociada a variables clínico-patológicas de conocida relevancia en la sobrevida de CGD, como linfonodos y estadio clínico. El análisis estadístico de estas asociaciones nos permitió identificar a la metilación de APC como factor pronóstico en CGD, tal como ha sido descrito recientemente34. Sin embargo, no encontramos una asociación entre sobrevida y metilación de FHIT o BRCA1. Esta información no es concordante con la literatura, que señala que la metilación de FHIT está asociada a un estadio tumoral avanzado, alto grado histológico y peor sobrevida35. El análisis de hierarchical clustering nos permitió, además, confirmar la asociación entre EBV con metilación de p16 y p14 no sólo en tercio medio, como ha sido descrito previamente36, sino a todas las localizaciones del cáncer gástrico. Tomados en conjunto, nuestros datos confirman la potencialidad del análisis de hierarchical clustering para la búsqueda de asociaciones entre variables clínico-patológicas y moleculares en estudios con gran cantidad de biomarcadores. Es interesante la observación que estos mismos resultados no demuestran asociaciones al analizarlos con IM, una aproximación que mide promedios de datos y no datos particulares.

Con respecto a las frecuencias de metilación de los distintos genes en estudio, llama la atención la baja frecuencia relativa de E-caderina, ya que se ha descrito metilada en casi 80% de casos de CGD29. Probablemente, el rendimiento del ensayo MS-PCR para E-caderina está disminuido por el tamaño de la región amplificada (120 pares de bases) y el tipo de muestra utilizada, tejido incluido en parafina37. En este sentido, los tres genes que con mayor frecuencia aparecieron como metilados (FHIT, APC y BRCA1), corresponden a tamaños entre 67 y 98 pb. Esta información puede ser relevante al momento de interpretar los resultados, porque pueden estar influidos por el tamaño de la secuencia utilizada para la identificación de genes particulares. Por otra parte, el uso de muestras en tejido fijado en formalina, e incluido en parafina, nos permitió el acceso a un número importante de casos de CGD en forma retrospectiva. El contar además en estos casos con información clínico-patológica y de sobrevida, nos permitió generar una información que de otra manera habría tomado años en reunirla en forma prospectiva.

Una proyección de nuestro estudio sería aplicar la metilación de GST en la búsqueda de marcadores de detección precoz en CGD. En este sentido, se ha reportado que los genes APC, c-met, y p53 pueden ser detectados en sueros de pacientes con cáncer gástrico38. De nuestro estudio, APC emergería como un potencial candidato para evaluación de tamizaje en pacientes con factores de riesgo o población asintomática. La

aplicación de esta estrategia de prevención secundaria sería un beneficio a la detección precoz del CGD, ya que permitiría focalizar la endoscopia digestiva alta a pacientes con APC metilado en suero. Esta aproximación se encuentra en evaluación en otros tumores, como cáncer colorrectal39 y cáncer de mama, entre otros.

En resumen, nuestros datos indican que el uso del método de análisis gráfico hierarchical clustering es capaz de identificar asociaciones potencialmente significativas entre variables clínico-patológicas y metilación de GST en una serie consecutiva de CGD, en particular sobrevida y metilación de APC e infección por EBV y metilación de p16 y p14, que mediante otros métodos de asociación estadística no encontramos.

 

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Agradecimientos

Agradecemos la revisión crítica del manuscrito al Dr. Juan Carlos Roa, Universidad de la Frontera, Temuco, Chile.

Recibido el 9 de enero, 2006. Aceptado el 29 de mayo, 2006.

Proyecto financiado por FONDECYT 1030130.

Correspondencia a: Dr. Alejandro Corvalán. Departamento de Anatomía Patológica, Facultad de Medicina, Pontificia Universidad Católica de Chile. Lira 85 4º piso, Santiago. Tel: (2) 3543209. Fax: 6395101. E mail: corvalan@med.puc.cl