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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.132 n.8 Santiago ago. 2004

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872004000800007 

  Rev Méd Chile 2004; 132: 955-960

Artículo deInvestigación

Mutación del gen K-ras en el cáncer de la vesícula biliar

K-ras gene mutation in gallbladder carcinoma

 

Juan Carlos Roa S1, Iván Roa E1, Xabier de Aretxabala U2, Angélica Melo A1, Gaspar Faría O2, Oscar Tapia E1.

Departamentos de Anatomía Patológica1 y Cirugía2, Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera.

Dirección para correspondencia


Background: Different K-ras mutation frequencies in gallbladder cancer have been reported. Aim: To study the frequency of K-ras gene mutations in advanced gallbladder carcinoma not associated to anomalous junction of pancreatic-biliary duct (AJPBD). Material and methods: 33 formalin fixed paraffin embedded samples of gallbladder carcinoma (30 women, age range 32-86 years) were selected. Pancreatic cancer tissue with K-ras mutations was used as control. DNA was extracted from the histological section by mean of microdissection and K-ras mutations in codon 12 were detected by polymerase chain reaction and restriction fragment length polymorphism (RFLP), using previously reported technique. Results: Most cases were poorly differentiated adenocarcinomas. K-ras mutation was detected in 10 cases (30%) samples. No differences in K-ras mutation frequency between subserous and serous tumors were detected and no relation between histological features and the mutation was observed. Conclusions: K-ras mutation in codon 12 is present in 30% in our advanced gallbladder carcinomas. The study of K-ras mutation in preneoplastic lesions and early carcinomas will be important to determine the role of this gene in the gallbladder carcinogenesis in Chile (Rev Méd Chile 2004; 132: 955-60).

(Key Words: Gallbladder neoplasms; Genes, ras; K-ras gene)


La familia de genes ras (H-ras, N-ras y K-ras) es uno de los grupos de oncogenes más frecuentemente alterados en las neoplasias humanas24,25. Las proteínas codificadas por estos genes se ensamblan entre sí, conformando una estructura proteica con un peso de 21Kd que le otorga el nombre (p21). Poseen actividad GTP-asa, participan en la vía de transducción de señales de crecimiento y diferenciación celular25,26. Las proteínas p21 mutadas se activan constitutivamente y estimulan el crecimiento y la diferenciación de manera autónoma. En alrededor del 80% de las mutaciones observadas en el gen K-ras se localizan en el codón 12 y, en menor frecuencia, en los codones 13, 60, 61. La mutación del codón 12 ocurre en el segundo nucleótido y corresponden predominantemente a transiciones (guanina-adenina) con sustitución de ácido aspártico por glicina27,28.

En el cáncer de la vesícula biliar en pacientes sin anomalías en la unión pancreático-biliar5,29-31, se han comunicado porcentajes de mutación del gen K-ras que fluctúan entre el 0% y 60%5,9,10,30,32. Las diferencias mencionadas en los porcentajes de activación de K-ras sobrepasan lo que pudiese esperarse producto de las variaciones propias de los tumores10, pudiendo ser atribuidas al uso de diferentes técnicas empleadas más que a las variaciones de las poblaciones bajo estudio. Se ha utilizado por ejemplo, detección y tipificación de mutaciones en el gen K-ras mediante PCR combinada con el uso de enzimas de restricción (RFLP)30, como también mediante polimorfismo conformacional de cadena simple (SSCP)33 o electroforesis en gel con gradiente denaturante (DGGE)34 seguido de secuenciación35. Cada uno de estos métodos con distinta sensibilidad. En el espectro de los resultados, hay autores que no han demostrado mutación de este gen, otros, en cambio, muestran cifras de mutación de entre 50% y 60% en los cánceres vesiculares y le asignan una importante participación en la carcinogénesis vesicular16,31,36.

El objetivo de este trabajo es determinar la presencia de mutaciones en el codón 12 del gen K-ras en carcinomas avanzados de la vesícula biliar mediante reacción de polimerasa en cadena (PCR) en seminido y RFLP (Restriction fragment length polymorphism).

Material y Método

Casos. Se incluyeron 33 casos de cáncer avanzado de la vesícula biliar de la Unidad de Anatomía Patológica del Hospital Temuco. En todos los casos, el nivel máximo de infiltración tumoral fue establecido mediante el mapeo completo de la pieza quirúrgica. Como controles se utilizó casos de cáncer de páncreas en los que previamente se había demostrado la mutación del codón 12 del gen K-ras.

Extracción del ADN. Se realizó microdisección manual en 5 cortes histológicos con áreas representativas del tumor. El ADN fue extraído con el Kt Puregene™ DNA Isolation System (Gentra Systems, USA), de acuerdo a las instrucciones del fabricante. El ADN se almacenó a -20°C hasta su análisis. En todos los casos se realizó amplificación previa del gen ß-globina para verificar su calidad.

Detección de mutaciones del codón 12 del gen K-ras. Se utilizó un PCR en seminido y RFLP, con iniciadores previamente reportados en la literatura40. Estos iniciadores («primers») permiten amplificar un fragmento del gen K-ras que incluye un sitio de restricción para la enzima MvaI. Las secuencias de los iniciadores y los tamaños de los fragmentos se muestran en la Tabla 1. Tanto los productos PCR (pPCR) de la primera como de la segunda amplificación, fueron digeridos con la enzima MvaI (10 U para 20 ul pPCR). El iniciador K-ras-A tiene una base cambiada con respecto a la secuencia del gen K-ras, esto produce un sitio de restricción para la enzima MvaI cuando el codón 12 es normal. También el iniciador K-ras-B tiene una base cambiada, lo que lo hace susceptible de digestión por la enzima MvaI y de esta manera no interfiere en la 2ª amplificación.


Los pPCR de la segunda amplificación fueron corridos en un gel al 10% de poliacrilamida (1:29), Buffer TBE 1X, Glicerol 5% a 150 volt por 2 h y posteriormente teñidos con bromuro de etidio.

Controles. Como control positivo, se empleó ADN de carcinomas de páncreas en los que previamente se había demostrado la mutación del K-ras en el codón 12. Como control negativo se usó DNA genómico comercial (Promega) y como control blanco se sustituyó el ADN por agua deionizada.

Resultados

Las características generales del grupo estudiado se resumen en la Tabla 2. La mayoría de los casos correspondieron a mujeres (90%) con un promedio de edad de 55,1 años (DS 14,6). La totalidad de los casos correspondieron a adenocarcinomas avanzados (subserosos o serosos) y en su gran mayoría eran tumores con un bajo grado de diferenciación.


En 10 de los 33 casos (30,3%) se detectó la mutación en el codón 12 del gen K-ras (Figura 1). En los tumores con infiltración de la subserosa se observó una leve mayor frecuencia de mutación respecto de los serosos (Tabla 3), sin embargo, esta diferencia no fue significativa. Tampoco se observó relación entre el grado de diferenciación de los tumores y presencia de la mutación del gen K-ras.


 
Figura 1. Gel de poliacrilamida teñido con bromuro de etidio. L: marcador 25 bp 1-5 y 7-11. Muestras de cánceres vesiculares, 6: control positivo (cáncer de páncreas).


Discusión

Nuestros hallazgos muestran la presencia de mutación del codón 12 del gen K-ras en alrededor de un tercio de los carcinomas vesiculares avanzados. Estos resultados demostrarían que este gen estaría activado y jugaría un rol en la carcinogénesis vesicular al igual que en otras neoplasias biliopancreáticas8,37. Estudios recientes de lesiones displásicas han demostrado que la mutación de este gen sería un evento temprano en la carcinogénesis vesicular16,31,32.

Algunos autores han demostrado una baja frecuencia de mutación de este gen en el cáncer vesicular, por lo que le asignan una escasa participación en el desarrollo de esta neoplasia16,38, otros en cambio, muestran cifras de mutación que fluctúan entre el 40%-60% de los cánceres vesiculares16,30,32. Los pacientes portadores de una unión pancreático-biliar anómala, condición frecuente en el oriente, presentan una mayor frecuencia de mutación del gen K-ras que los sujetos sin esta condición, sugiriendo además que el reflujo bilio-pancreático pudiese jugar un rol en la carcinogénesis de este tipo de pacientes35,39. Kim y cols, detectaron mutaciones del gen

K-ras en 31% en los CVB, sin embargo, no encontraron mutaciones en las displasias o adenomas32. Otros autores, han comunicado una baja frecuencia de mutaciones en el gen K-ras en el carcinoma de la vesícula biliar sin unión anómala pancreático-biliar y 25% en adenomas vesiculares sugiriendo que estas lesiones no serían precursoras del carcinoma invasor de la vesícula biliar8.

En conclusión podemos señalar que la mutación del codón 12 del gen K-ras está presente en al menos el 30% de nuestros cánceres avanzados de la vesícula biliar, lo que representa un importante avance en el entendimiento de esta neoplasia en nuestra población. El estudio de lesiones metaplásicas, displasia y carcinomas incipientes permitirá establecer con mayor precisión el momento de aparición de esta mutación y su participación en la evolución carcinogenética de la vesícula biliar.

 

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Correspondencia a: Dr. Iván Roa E. Casilla 54-D. Facultad de Medicina, Universidad de La Frontera, Temuco, Chile. E mail: iroa@ufro.cl

Recibido el 18 de diciembre, 2003. Aceptado en versión corregida el 1 de junio, 2004.

Trabajo financiado por Proyecto de la Dirección de Investigación Universidad de la Frontera 140305.