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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.132 n.5 Santiago mayo 2004

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872004000500013 

 

Rev Méd Chile 2004; 132: 619-626

MEDICINA MOLECULAR

Integrones y cassettes genéticos de resistencia: estructura y rol frente a los antibacterianos

Integrons and resistance gene cassettes: structure and role against antimicrobials

 

Gerardo González R1a, Sergio Mella M2, Raúl Zemelman Z3b, Helia Bello T1c, Mariana Domínguez Y1c.

1Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas.
2Departamento de Medicina Interna, Facultad de Medicina, Universidad de Concepción. 3Facultad de Ciencias y Tecnología, Universidad San Sebastián. Concepción, Chile.
aLicenciado en Biología. Magíster en Microbiología. Doctor en Ciencias Biológicas
bQuímico Farmacéutico. Diploma in Bacteriology. Master of Science in Public Health
cBioquímica. Magíster en Microbiología

Correspondencia a :


Bacteria have developed sophisticated and successful genetic mechanisms to evade the action of antimicrobials. Bacterial multiresistance has caused serious problems in the treatment of nosocomial infections. Integrons and gene cassettes are considered the main genetic elements in the evolution of plasmids and transposons that actively participate in the mobilization of genes, codifying different bacterial resistance mechanisms. This article reviews the historical and structural aspects of integrons and resistance gene cassettes and the presence of these structures in Gram negative bacteria isolated from Chilean hospitals in the last ten years (Rev Méd Chile 2004; 132: 619-26).

(Key Words: Gene cassettes; Gram-Negative bacterial infectious; integrons; Microbial sensitivity tests)


 

Los mecanismos de resistencia bacteriana muestran una elevada sofisticación bioquímica y genética, limitando seriamente la utilidad de la terapia antiinfecciosa1,2. El hallazgo de determinantes de resistencia con propiedades similares en organismos y ecosistemas notoriamente distantes sugiere la ocurrencia de un flujo genético entre células de diferentes comunidades microbianas3-5. En efecto, los genes que confieren resistencia a ciertos antibióticos, en bacterias filogenéticamente no relacionadas, demuestran ser idénticos6, incluso en bacterias Gram positivas y Gram negativas7,8. Se han identificado varios elementos genéticos que participan en la transferencia de genes de resistencia, de los cuales los más conocidos son los plásmidos autotransferibles o movilizables5. También se incluyen los transposones conjugativos y no conjugativos9, el ADN de bacteriófagos y, más recientemente, los integrones y cassettes genéticos de resistencia10. La transferencia de estos elementos entre diferentes bacterias puede ocurrir por conjugación11, transformación12 o transducción13, procesos básicos de transferencia de genes entre bacterias.

En la actualidad, es bien conocido el rol de plásmidos y transposones en la multirresistencia de las bacterias a los antibióticos y en la diseminación natural de los determinantes de resistencia5. Sin embargo, sólo en los últimos años se está estudiando la participación de los cassettes genéticos de resistencia y de los integrones en el proceso evolutivo de los plásmidos de resistencia (plásmidos R).

La presente revisión analiza aspectos históricos y estructurales de los integrones y su implicancia clínica, incluyendo resultados obtenidos por nuestro Grupo de Investigación en la Resistencia a Antimicrobianos (GIRA).

ASPECTOS HISTÓRICOS

El término integrón o elemento de integración fue propuesto por Stokes y Hall en 198910, aunque la actual definición fue introducida en 1995 por Hall y Collis14: los integrones son una familia de elementos genéticos potencialmente móviles capaces de integrar y expresar genes de resistencia a los antibióticos. Los estudios iniciales se efectuaron con plásmidos del grupo de incompatibilidad Inc-W y con transposones relacionados a Tn2115-17 que poseían genes de resistencia a antibióticos en un mismo sitio, delimitado por secuencias nucleotídicas altamente conservadas. Varios de estos genes codificaban enzimas modificantes de aminoglicósidos (EMA)18, dihidrofolato reductasas19 o ß-lactamasas del tipo OXA20. Estudios con enzimas de restricción y secuenciación nucleotídica establecieron que las regiones de ADN que delimitaban estos genes eran muy similares en diferentes plásmidos y transposones19. A fines de la década de los 80 Stokes y Hall10 demostraron que las secuencias de ADN que delimitan las regiones con genes de resistencia representan zonas conservadas, con un extremo 5' conservado (5'CS) de 1,36 kb, y un extremo 3' conservado (3'CS) de 2 kb. La zona con los determinantes de resistencia presentaba longitud variable y era dependiente del número de genes insertos en dicho sitio.

ESTRUCTURA Y CLASIFICACIÓN DE LOS INTEGRONES

Los integrones han sido detectados principalmente en bacilos Gram negativos fermentadores, de las familias Enterobacteriaceae y Vibrionaceae21-23, y en algunos no fermentadores, como Pseudomonas aeruginosa24 y Acinetobacter baumannii25. Además, se ha descrito un integrón funcional en bacterias Gram positivas, en una cepa de Corynebacterium glutamicum26.

Formando parte de la estructura básica del integrón (Figura 1) se encuentra el gen intI que codifica una proteína con actividad de recombinasa específica de sitio (IntI), la integrasa, que forma parte de una familia de enzimas cuyo prototipo es la integrasa del bacteriófago l27, actualmente denominadas tirosina-recombinasas28. Adyacente a intI se encuentra el sitio de recombinación específica de sitio, attI, en el que se integra el cassette genético de resistencia29. Entre intI y attI se encuentran dos promotores divergentes, PI para la expresión de intI y PC, para la expresión de los cassettes genéticos insertos río abajo, puesto que la mayoría de éstos no tiene promotor30. La enzima IntI permite la interacción entre attI y el sitio attC o elemento de 59 pb de los cassettes genéticos, uniendo ambos sitios y facilitando la integración o escisión del cassette de resistencia en la zona variable del integrón (Figura 1).

Hasta la fecha se han descrito varias familias de integrones de acuerdo a la secuencia nucleotídica del gen intI31, al menos tres de ellas están relacionadas con la expresión de genes de resistencia. Sus integrasas presentan entre 45% y 58% de homología, sugiriendo una divergencia evolutiva por un período superior a 50 años, lo que corresponde, aproximadamente, a la era antibiótica32. Los integrones no pueden realizar autotransposición pero se asocian frecuentemente a secuencias de inserción o bien, a transposones y plásmidos conjugativos que les sirven como vehículos para su transmisión inter e intra especie. Se han encontrado integrones de las clases 1 y 2 en plásmidos y transposones, en tanto aquellos de clase 3 sólo han sido observados en plásmidos33. Por último, los integrones de clase 4 o "superintegrones" se han identificado principalmente en el cromosoma de Vibrio cholerae22,34.

En la mayoría de los integrones clase 1 descritos hasta ahora existe un extremo 3' altamente conservado (3'CS) con los genes qacED1, sul1 y orf5 que codifican resistencia, respectivamente, a compuestos de amonio cuaternario, a bromuro de etidio, a sulfonamidas y a una proteína con función desconocida32,35-37. Entre los extremos 5'CS y 3'CS se encuentra una zona variable con presencia o ausencia de cassettes genéticos de resistencia. Las otras clases de integrones relacionadas con resistencia a antibióticos no poseen extremos 3' altamente conservados, ya que sus secuencias pueden variar por inserción o deleción de algunos genes o secuencias de inserción.

Figura 1. Representación esquemática de la estructura básica de un integrón y de la adquisición de cassettes genéticos de resistencia. intI1: gen que codifica la integrasa clase 1; attI: sitio de recombinación del integrón en el cual los cassettes son integrados; PI: promotor que transcribe la integrasa; PC: promotor que dirige la transcripción de los cassettes integrados. attC: sitio de recombinación del cassette genético (esquema no dibujado a escala).

CASSETTES GENÉTICOS Y ELEMENTOS DE 59 pb (SITIOattC)

Los cassettes genéticos constituyen un grupo diverso de pequeños elementos móviles que usualmente contienen sólo un marco de lectura abierta completo (orf), o región codificante (gen)14,35. Además, formando parte de su estructura, a continuación del orf, existe un sitio de recombinación específica denominado elemento de 59 pb, o sitio attC, localizado en el extremo 3' del gen29,36. Aunque se considera que los cassettes genéticos son elementos móviles35, no codifican enzimas u otros productos involucrados en su propia movilización14. Estos elementos pueden existir libremente en forma de moléculas circulares covalentemente cerradas, generadas por acción de la integrasa que escinde el cassette desde un integrón29,36. La inserción específica de sitio de los cassettes genéticos al interior de la región variable de los integrones ha sido solamente detectada en las células que expresan la actividad de la integrasa. Esto indica que esta recombinasa es necesaria para la integración de los cassettes, predominantemente dentro del sitio attI del integrón36,37, aunque también es posible la recombinación entre dos sitios attC38. La integrasa interactúa con los dos sitios primarios de recombinación, el sitio attI de los integrones y el sitio attC de cada cassette genético37. Por otra parte, la especificidad de la orientación de los cassettes genéticos integrados permite su transcripción desde un promotor común localizado en el extremo 5'CS de los integrones14, cuya secuencia nucleotídica es altamente conservada y en el cual pequeñas variaciones afectan la fuerza de transcripción del promotor, llegando incluso a niveles tan bajos de expresión que la bacteria aparece fenotípicamente susceptible, aunque es potencialmente resistente por poseer el gen que codifica la resistencia. Por lo tanto, el uso de un determinado antibiótico, al ejercer la correspondiente presión selectiva, puede seleccionar las cepas con promotores más fuertes y capaces de expresar el gen, determinando la resistencia de las bacterias al antibiótico38. El nivel de resistencia a un determinado antibiótico, codificado por un cassette genético de resistencia, depende de su posición en el integrón, más cercana o lejana del promotor común. Collis y Hall38 demostraron que las bacterias manifiestan niveles de resistencia más elevados cuando el gen de resistencia se ubica en el primer cassette, esto es, muy cercano al promotor y estos niveles se reducen a medida que los genes están en cassettes posteriores, río abajo del promotor.

IMPLICANCIA CLÍNICA DE LA ASOCIACIÓN
INTEGRÓN-CASSETTE GENÉTICO DE RESISTENCIA

White y col39 han informado que la diseminación de genes de resistencia aumenta considerablemente cuando ellos forman parte de cassettes genéticos móviles, lo cual los habilita para su transferencia horizontal por varios mecanismos. Algunos incluyen la movilización de cassettes entre integrones, mediada por la integrasa. En el caso de integrones que forman parte de un transposón, pueden transponerse desde el cromosoma hacia plásmidos y viceversa. Por su parte, los plásmidos conjugativos pueden transferirse de una bacteria a otra de la misma o de diferente especie, fenómeno genético particularmente importante por la presión selectiva existente a nivel nosocomial4,5. Los cassettes genéticos codifican resistencia a una amplia gama de compuestos antibacterianos, que incluyen antibióticos ß-lactámicos, aminoglicósidos, trimetoprim, sulfonamidas, fenicoles, tetraciclinas, rifampicina, eritromicina y, según informaciones recientes, a quinolonas30,39,40. Además, los integrones clase 1 contienen genes que podrían ser remanentes de cassettes genéticos como parte de su estructura conservada 3'CS y ellos codifican resistencia a compuestos de amonio cuaternario (qacED1) y sulfonamidas (sul1)32. Los mecanismos de resistencia relacionados con genes de integrones son variados e incluyen la síntesis de enzimas como las EMA21, cloranfenicol acetil transferasas (CAT)38,39, modificantes de rifampicina41, ß-lactamasas, especialmente aquellas de más reciente descripción, incluyendo carbapenemasas42,43, dihidrofolato reductasas21. Además, se han descrito proteínas protectoras de la ADN girasa y bombas de eflujo40,44.

Los integrones han sido encontrados frecuentemente en cepas de origen nosocomial37. De igual forma estas estructuras, con sus respectivos cassettes de resistencia, han sido detectadas en bacterias aisladas de ambientes acuáticos45 y de animales domésticos y de crianza46, lo cual refleja su amplia diseminación en la naturaleza. Algunas clases de integrones han sido detectadas exclusivamente en cepas ambientales (Treponema denticola, Geobacter sulfurreducens, Shewanella putrefaciens)47. Más aún, se ha demostrado la presencia de integrones en microorganismos ancestrales de diferentes géneros, corroborando que estas estructuras son antiguas y que han evolucionado conjuntamente con el genoma bacteriano47.

Existen escasos estudios sistemáticos acerca de la distribución de integrones en diferentes especies bacterianas, pero los que han sido realizados establecen que la prevalencia de una u otra clase de integrón en bacterias Gram negativas depende de la especie bacteriana en cuestión y, en algunos casos, de la localización geográfica en que se recolectan las cepas48.

INTEGRONES EN BACTERIAS GRAM NEGATIVAS AISLADAS
EN HOSPITALES DE CHILE

En 1998, González y col25, publicaron las primeras evidencias de la presencia de integrones en bacilos Gram negativos aislados de productos patológicos en hospitales chilenos. Estos autores informaron que los integrones clase 2 son frecuentes en cepas de A baumannii, principalmente en aquellas de los biotipos 9 (76,3% de cepas con integrones) y 8 (16,7% de cepas con integrones). Estudios posteriores establecieron que las cepas con integrones son las mismas que presentan los patrones de resistencia más amplios49 como así también que los integrones están presentes en la mayoría de las cepas de A baumannii resistentes a cefalosporinas de tercera generación50. Los autores, sin embargo, no encontraron ningún tipo de asociación entre la presencia de integrones y de genes codificantes de ß-lactamasas del tipo TEM y SHV. Posteriormente, Ramírez51 y González52 demostraron que integrones de cepas de A baumannii poseían los cassettes genéticos aac(6')Ib, aac(3)IV, ant (3'')I, explicando la resistencia de las cepas a diversos antibióticos aminoglicósidos. Además, en la mayoría de las cepas se encontraron los cassettes genéticos dfrA1, sat y ant (3'')I, que constituyen un bloque que forma parte del transposón Tn7 y que determina resistencia a trimetoprim, estreptotricina, estreptomicina y espectinomicina, respectivamente. Ramírez, también demostró la presencia de un cassette genético que codifica una ß-lactamasa del tipo OXA, formando parte de un integrón clase 2 en una cepa de A baumannii51.

Nuestro grupo ha estudiado la presencia de integrones en enterobacterias, encontrando que los integrones clase 1 son predominantes en Klebsiella pneumoniae (68,4%) y E coli (36,5%). Las cepas de Serratia marcescens poseen, mayoritariamente, integrones clase 2. En cambio, la mayoría de las cepas de Shigella flexneri (75%) y de Proteus mirabilis (56,6%) posee integrones clase 1 y 2, simultáneamente53,54. En general, los integrones de las cepas de enterobacterias están constituidos por alguno de los cassettes genéticos acc(6')Ib, ant(2'')I y ant(3'')I, lo que explica la resistencia de estas bacterias a tobramicina, dibekacina, amikacina, netilmicina, sisomicina, kanamicina, gentamicina, estreptomicina y espectinomicina. En varias cepas se encontraron integrones, pero los cassettes de resistencia no estaban presentes.

De lo anteriormente expuesto, es claro que los integrones funcionan como sistemas de captación de genes que confieren ventajas selectivas para la bacteria. Dada su capacidad para reconocer una amplia variedad de secuencias de recombinación, su capacidad de intercambio y origen remoto, estas estructuras permiten a las bacterias una rápida adaptación a los cambios ecológicos, cuyo ejemplo más reciente corresponde sin duda al advenimiento de la moderna era de la quimioterapia antimicrobiana.

El conocimiento de estas nuevas estructuras y sus propiedades es un llamado de alerta para la implementación de programas de uso adecuado de antimicrobianos y de normas básicas de control de infecciones.

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Recibido el 26 de noviembre de 2002 y en versión corregida el 23 de marzo de 2004.

Trabajo financiado por FONDECYT, Proyecto # 1981044 y 1000352.

Correspondencia a: Gerardo González R. Grupo de Investigación en Resistencia a Antibióticos (GIRA), Departamento de Microbiología, Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Concepción, Concepción, Chile. Teléfono: 56-41-203237. Fax: 56-41-245975. E-mail: ggonzal@udec.cl