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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.131 n.3 Santiago mar. 2003

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872003000300008 

Rev Méd Chile 2003; 131: 299-302

Susceptibilidad antifúngica
de levaduras mediante Etest ®.
Comparación de 3 medios

Cecilia Tapia P, Eugenia León C1, Elizabeth Palavecino R.

Antifungal susceptibility testing
by Etest ®. Comparison of three media

Background: The increasing frequency of systemic fungal infections and the emergence of secondary resistance to antifungals in the lasts years, has stimulated the use of methods for antifungal susceptibility testing. Etest(r) is an easily performed quantitative method that has a good agreement with the broth microdilution reference method (NCCLS), if appropriate media are used. Aim: To compare the susceptibility to Amphotericin B (AmB) and Fluconazole (Flu) of 22 opportunistic yeast isolates (C albicans (7), C tropicalis (9), C parapsilosis (3) and Cryptococcus neoformans (3) by Etest ®., using three different media and to choose the best medium for each tested drug. The studied media were RPMI 1640, Casitone (Cas) and Sabouraud. Results: The interpretation of minimal inhibitory concentration (MIC) endpoints on Sabouraud was difficult for AmB. The American Type Culture Collection (ATCC) strains MICs were out of the acceptable range in this medium. RPMI and Cas were suitable media to test AmB and Flu, but best endpoints were obtained for AmB in RPMI and Flu in Cas. Conclusions: The use of appropriate media for each antifungal drug optimizes the MIC readings by Etest(r). AmB should be tested in RMPI and Flu in Cas. Sabouraud must not be used (Rev Méd Chile 2003; 131: 299-302).
(Key Words: Antibiotics, antifungal; Colony count, microbial; Culture media)

Recibido el 3 de julio, 2002. Aceptado en versión corregida el 31 de diciembre, 2002.
Laboratorio de Microbiología de la Pontificia Universidad Católica de Chile.
1Tecnólogo Médico

El incremento en la población de pacientes inmunocomprometidos o con otros factores de riesgo (edades extremas, antibioterapia de amplio espectro, etc.), ha determinado un aumento en la incidencia de infecciones fúngicas sistémicas en las últimas décadas. Esto, asociado al uso creciente de drogas antifúngicas ha contribuido a la aparición de levaduras con resistencia secundaria a los antifúngicos, lo cual ha hecho necesario el desarrollo de métodos para evaluar susceptibilidad a estas drogas. Los estudios de susceptibilidad a los antifúngicos previo al uso de métodos estandarizados, eran inconsistentes y muy poco reproducibles, ya que muchos factores influyen en estos ensayos1. Es así como en el año 1992, surgió un método estandarizado de dilución en caldo, diseñado por la NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards)2 inicialmente como macrodilución y que posteriormente fue modificado a microdilución en caldo. Éste constituye el método de referencia, sin embargo, es muy laborioso, requiere de personal entrenado y se encuentra reservado principalmente a laboratorios especializados. Debido a esto, nuevas alternativas menos engorrosas de realizar y con buena reproducibilidad, han surgido en el mercado para laboratorios que no cuentan con el método de microdilución. Etest ® es un método de difusión en agar, que consta de una tira con una gradiente de concentración de antifúngico y que permite cuantificar, mediante la lectura de un elipse de inhibición, las concentraciones inhibitorias mínimas (CIMs). Este método ha demostrado una buena concordancia con el método de referencia en diversos estudios1-8.

Uno de las problemas más frecuentes en los estudios de susceptibilidad a antifúngicos, es el fenómeno de "trailing" que presentan algunas cepas fundamentalmente con azoles (drogas fungistáticas) y que en el caso de Etest(r) corresponde a la presencia de microcolonias alrededor o dentro del área de inhibición que dificultan la lectura de la CIM (Figura 1)4. Este fenómeno se observa también el método de microdilución en caldo como un crecimiento sostenido de colonias en todos los pocillos del gradiente de antifúngico.

Figura 1. Fenómeno de "trailing". Se observa la presencia de microcolonias dentro del elipse de inhibición. CIM 24 µg/mL. Fotografía facilitada por Promedar Ltda.

El grado de concordancia entre Etest ® y el método de referencia, depende del medio utilizado para realizar la técnica, siendo los medios más recomendados RPMI 1640 (2% glucosa) y Casitona3,4. El uso de estos medios enriquecidos, permite el óptimo crecimiento de las especies, mejora la lectura de los halos (punto de corte) y el fenómeno de "trailing" se minimiza3.

Este estudio compara la susceptibilidad a Anfotericina B (AnfB) y Fluconazol (FZ) de 22 levaduras oportunistas aisladas de hemocultivos y líquidos estériles de pacientes hospitalizados mediante Etest ®, utilizando tres medios diferentes: RPMI 1640 (American Biorganics), Casitona (Difco) y Sabouraud (Merck), con el fin de elegir el medio más adecuado para optimizar la lectura de la CIM.

MATERIAL Y MÉTODO

Material. Se estudiaron 22 cepas de levaduras recuperadas de hemocultivos y fluidos corporales estériles de pacientes del Hospital Clínico de la Pontificia Universidad Católica de Chile, en agosto de 1998. Las especies estudiadas fueron: Candida albicans (7), Candida tropicalis (9), Candida parapsilosis (3) y Cryptococcus neoformans (3).

Las cepas control (ATCC) utilizadas en cada ensayo fueron: Candida albicans 90027, Candida krusei 6258 y Candida parapsilosis 22019.

Los medios utilizados en base a agar fueron: RPMI 1640 Powder (American Biorganics), Casitona (BactoCasitone, Difco) y Sabouraud (Merk). Éstos fueron preparados de acuerdo a las especificaciones del fabricante.

Se utilizaron tiras de Etest ® (AB Biodisk) con AnfB y FZ.

Método. Las cepas fueron subcultivadas en agar Sabouraud 18-24 h previo al ensayo de susceptibilidad. Se preparó una suspensión de levaduras ajustando el inóculo a 0,5 unidades McFarland, para las especies del género Candida y 1 unidad McFarland para Cryptococcus neoformans. Se introdujo una tórula en la suspensión, se removió el exceso de fluido y se aplicó el inóculo frotando la tórula en la superficie de la placa repitiendo el procedimiento en 3 direcciones. Se dejó secar la placa durante 10 min y se aplicaron las tiras de Etest ® incubándose a 35°C por 24 y 48 h (Candida spp y C neoformans, respectivamente). La lectura de los elipses de inhibición se realizó de acuerdo a la especificación del fabricante utilizando entre 95 y 100% de inhibición para AnfB y 80% de inhibición para FZ (AB Biodisk, Solna, Sweden, Antifungal susceptibility testing of yeasts, Appendix. Etest ® technical guide 4B, 1994). Se compararon las CIMs obtenidas de todas las levaduras con los tres medios estudiados y se definió como lecturas concordantes aquellas que se encontraban dentro de ±1 log2 de la dilución. Los ensayos fueron validados mediante la utilización de cepas control ATCC.

Se evaluó la reproducibilidad de la técnica realizando 10 ensayos en duplicado para cada medio (RPMI y Casitona).

RESULTADOS

Con Sabouraud se obtuvieron elipses difusos en 50% (11/22) de los ensayos para AnfB, no pudiendo determinarse la CIM. Por otra parte, las CIMs de las cepas ATCC en la mayoría de los ensayos estuvieron fuera del rango de CIM aceptable para cada cepa control al utilizar agar Sabouraud.

Las CIM 50, CIM 90 y los rangos de CIMs fueron similares utilizando RPMI y Casitona para AnfB y FZ (Tabla 1). Hubo 95% de concordancia (21/22) entre las CIMs obtenidas con RPMI y 95% de concordancia con Casitona para ambos antifúngicos, sin embargo esas discordancias estuvieron dentro de ±2 log2 de la dilución y no fueron clínicamente significativas. Los elipses de inhibición para FZ fueron más nítidos en medio Casitona (Figura 2) que en RPMI, mientras que los puntos de corte para AnfB fueron más nítidos en RPMI (Figura 3). En la totalidad de los ensayos realizados con estos medios, las cepas control presentaron CIMs dentro del rango esperado (Tabla 2). Candida krusei (ATCC) no creció en agar Casitona.

La reproducibilidad de Etest ® fue aceptable, encontrándose las CIMs de las cepas estudiadas en 90% (9/10) de los ensayos dentro de ±1 log2 de la dilución en ambos medios evaluados (RPMI y Casitona).

Figura 2. Se observa un nítido elipse de inhibición en agar Casitona para Fluconazol. CIM 1,5 µg/mL.

Figura 3. Se observa un nítido elipse de inhibición en agar RPMI para Anfotericina B. CIM 0,19 µg/mL.

DISCUSIÓN

Los resultados obtenidos, confirman que tanto el RPMI como Casitona, son medios adecuados para estudiar susceptibilidad antifúngica a AnfB y FZ. Para Etest ® diversos medios, utilizados ampliamente en laboratorios clínicos, han sido evaluados incluyendo el medio Mueller-Hilton4, cuyos porcentajes de concordancia con el método de referencia son pobres (53-62%) y Sabouraud cuyos elipses de inhibición son difíciles de interpretar de acuerdo a este estudio.

Una excelente reproducibilidad fue obtenida con los medios RPMI y Casitona, y las cepas ATCC estuvieron dentro del rango aceptable con ambos medios lo cual los hace recomendables para este tipo de estudio. A pesar que algunos trabajos recomiendan el uso de RPMI y Casitona indistintamente para ensayar FZ4,5, nuestra experiencia demostró que la lectura de los elipses de inhibición es óptima con RPMI para AnfB y Casitona para FZ.

Candida krusei no crece en agar Casitona, por lo tanto esta especie debiera ser evaluada para ambos antifúngicos en agar RPMI.

En base a estos resultados, es posible concluir que a pesar de que tanto RPMI y Casitona son medios adecuados para evaluar AnfB y FZ, existen diferencias en la nitidez de lectura de los elipses de inhibición al utilizar estos medios dependiendo de la droga ensayada. Recomendamos el uso de RPMI para AnfB y Casitona para FZ, excepto en C krusei que no crece en este medio. El agar Sabouraud no es adecuado para esta metodología, por lo tanto, no debiera ser utilizado.

REFERENCIA

1. Rex JH, Phaller MA, Walsh TJ, Chaturvedi V, Espinel-Ingroff A, Ghannoum M et al. Antifungal Susceptibility Testing: Practical Aspects and Current Challenges. Clin Microbiol Rew 2001; 14: 643-58.        [ Links ]

2. National Committee for Clinical Laboratory Standards. 1997. Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts. Approved standard M27-A. National Committee for Clinical Laboratory Standards, Villanova, Pa.        [ Links ]

3. Tortorano AM, Viviani MA, Barchiesi F, Arzeni D, Rigoni AL, Cogliati M et al. Comparison of three methods for testing azole susceptibilities of Candida albicans strains isolated sequentially from oral cavities of AIDS patients. J Clin Microbiol 1998; 36: 1578-83.        [ Links ]

4. Pfaller MA, Messer SA, Karlsson A, Bolmström A. Evaluation of E-test for determining fluconazole susceptibilities of 402 clinical yeasts isolates by using three different agar media. J Clin Microbiol 1998; 36: 2586-9.        [ Links ]

5. Warnock DW, Johnson EM, Rogers TRF. Multi-centre evaluation of the E-test method for antifungal drug susceptibility testing of Candida spp y Cryptococcus neoformans. J Antimicrob Chemother 1998; 42: 321-31.         [ Links ]

6. Colombo AL, Barchiesi F, McGough DA, Rinaldi MG. Comparison of E-test and National Committee for Clinical Laboratory Standards broth macrodilution method for azole antifungal susceptibility testing. J Clin Microbiol 1995; 33: 535-40.        [ Links ]

7. Van Eldere J, Joosten L, Verhaegue A, Surmont I. Fluconazole and Amphotericin B antifungal susceptibility testing by National Committee for Clinical Laboratory Standards broth macrodilution method compared with E-test and semiautomated broth microdilution test. J Clin Microbiol 1996; 34: 842-7.        [ Links ]

8. Rex J, Pfaller MA, Lancaster M, Odds FC, Bolmström A, Rinaldi MG. Quality Control Guidelines for National Commitee for Clinical Laboratory Standards-recommended broth macrodilution testing of ketoconazole and itraconazole. J Clin Microbiol 1996; 34: 816-7.        [ Links ]

Agradecimientos
Expresamos nuestro agradecimiento a Promedar Ltda., representante exclusivo de la empresa AB Biodisk (Suecia) por facilitarnos información detallada del producto Etest ®. que contribuyó a la realización de este trabajo.

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Correspondencia a: Dra. Cecilia Tapia P. Hospital Dr. Sótero del Río. Unidad de Laboratorio Clínico. Av. Concha y Toro 3459. Puente Alto. Chile. Fono/Fax: 56-2-3536210. E mail: cvtapia@entelchile.net