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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.130 n.12 Santiago dic. 2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872002001200005 

Rev Méd Chile 2002; 130: 1358-1364

Inmunodiagnóstico de las infecciones
por Strongyloides stercoralis en Chile
utilizando la prueba de ELISA

Rubén Mercado P1, María Isabel Jercic L2, Patricio Torres H3,
Sergio Alcayaga U4, Fabiana Martins de Paula5,
Julia María Costa-Cruz6, Marlene T Ueta5,7.

Immunodiagnosis of Strongyloides
stercoralis infections in Chile using an
Elisa test

Background: Strongyloides stercoralis is a world wide distributed small intestinal nematode parasite. In immunocompetent individuals S stercoralis can produce asymptomatic infections or a moderate clinical picture of diarrhea, some cases become chronic. In immunocompromised patients, a disseminated disease may appear, sometimes fatal. In Chile, there is little epidemiological information about S stercoralis infections and appropriate diagnostic techniques are usually not used. Aim: To evaluate the yield of an ELISA test for the diagnosis of strongyloidiasis in Chilean patients. Material and methods: Ten serum samples from patients with S stercoralis infections confirmed by a positive stool examination, 66 samples from individuals with other infections by tissue helminthes (24 toxocariasis, 15 trichinellosis, 11 hydatidosis, 12 fascioliasis and 4 cysticercosis), 13 samples from subjects with autoimmune diseases and 49 samples from apparently healthy individuals with a normal eosinophil count, were studied. ELISA antigen was prepared using a filariform larval extract obtained from a murine species of Strongyloides, maintained in laboratory animals. Results: Using 0.33 optical density units as a cut off value, 9 of 10 sera of S stercoralis infected individuals, had a positive ELISA test. No cross reactions were observed with sera of patients with other helminthic infections, autoimmune diseases or in healthy individuals. Thus, specificity, positive and negative predictive values were 100%. Conclusions: The results obtained are similar with those found by other investigators. ELISA test for strongyloidiasis is a useful tool for the diagnosis of clinical cases and for seroepidemiological studies of this nematode infection in Chile (Rev Méd Chile 2002; 130: 1358-64).
(Key Words: Enzyme linked immunosorbent assay; Nematode infections; Strongyloides stercoralis)

Recibido el 28 de junio, 2002. Aceptado en versión corregida el 25 de septiembre, 2002.
Trabajo financiado por el proyecto de Investigación y Desarrollo Tecnológico 2002,
del Instituto de Salud Pública de Chile y por el Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasil.
1Unidad de Parasitología Norte, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile.
2Laboratorio de Referencia de Parasitología, Instituto de Salud Pública de Chile.
3Instituto de Parasitología, Facultad de Medicina, Universidad Austral de Chile.
4Unidad de Epidemiología, Servicio de Salud Metropolitano Sur.
5Departamento de Parasitología, Instituto de Biología, Universidad Estadual de Campinas, UNICAMP,
Sao Paulo, Brasil.
6Departamento de Inmunología, Microbiología y Parasitología, Instituto de Ciencias Biomédicas, Universidade Federal de Uberlandia, Minas Gerais, Brasil.
1Tecnólogo Médico, Magíster en Ciencias Biológicas.
2Tecnóloga Médica, Licenciada en Tecnología Médica.
3Tecnólogo Médico, Doctor en Ciencias.
4Médico Veterinario, Magíster en Salud Pública.
5Graduada en Ciencias Biológicas, Magíster en Inmunología y Parasitología.
6Biomédica, Doctor en Inmunología.
7Graduada en Historia Natural, Doctor en Parasitología.

Strongyloides stercoralis es un nematodo parásito aguzado que mide entre 2 y 2,8 mm de largo y cuyo hábitat es el intestino delgado del hombre. Habitualmente, la strongyloidiasis -que es una parasitosis de amplia distribución geográfica- en individuos inmunocompetentes se presenta como una infección asintomática o con diarrea moderada, pudiendo hacerse crónica. En pacientes inmunocomprometidos (especialmente los tratados con corticoides o infectados con el virus de la inmunodeficiencia humana) se ha descrito un cuadro diseminado, a veces fatal1,2.

A diferencia de otras enteroparasitosis humanas, no se ha podido determinar la epidemiología de la strongyloidiasis, en individuos inmunocompetentes ni en inmunocomprometidos, debido principalmente a la carencia de exámenes parasitológicos de laboratorio sensibles y simples. Una estimación del número de infectados en países tropicales y subtropicales es 35 millones, siendo la quinta frecuencia entre las helmintiasis humanas3. En Chile, se han descrito casos aislados y brotes en instituciones, especialmente en hospitales de enfermos mentales, incluyendo un caso mortal2,4-8.

El hombre se infecta por la penetración de la larva filariforme de S stercoralis a través de la piel. En el intestino delgado la hembra (no hay machos parásitos) elimina huevos larvados, desde donde eclosionan larvas rabditoides. Estas larvas pueden pasar a ser filariformes (infectantes) en muy corto tiempo, pudiendo producirse nuevas infecciones a partir de su penetración por la mucosa intestinal (autoinfección endógena) o por la piel perineal (autoinfección exógena), explicándose así la cronicidad de la parasitosis9.

El diagnóstico de laboratorio de la infección se puede hacer cuando se observan larvas rabditoides de S stercoralis en muestras de deposiciones. Los métodos de elección son los que permiten recuperar larvas vivas como los de Rugai, Baermann o de cultivos en papel filtro (Harada-Mori) o en placas de agar y cuyo rendimiento en la detección de la parasitosis varía entre 30 y 60% cuando se estudia una muestra de deposiciones, pudiendo aumentar la sensibilidad al procesar muestras seriadas10-14. En Chile, estos métodos de laboratorio no han sido utilizados, ya que la pesquisa de los enteroparásitos habitualmente se realiza a partir de muestras fecales preservadas en formol. Dicha condición no permite practicar técnicas de cultivo o de recuperación de larvas vivas. Los métodos de laboratorio basados en la concentración por centrifugación de los elementos parasitarios, tales como el de Telemann modificado, son de bajo rendimiento en la detección de larvas de nematodos en muestras fecales (40-55%)12. Por otra parte, las infecciones por S stercoralis inducen una respuesta inmune que se puede evidenciar por una eosinofilia sanguínea elevada y la presencia de anticuerpos séricos específicos10,15. La detección de anticuerpos anti S stercoralis mediante ELISA ha demostrado ser muy útil para el diagnóstico de la infección en el hombre y para estudios seroepidemiológicos1,3,15.

Especies de Strongyloides, como S ratti y S venezuelensis que infectan a roedores y se pueden mantener en ratas de laboratorio, se han empleado para preparar extractos proteicos de larvas filariformes, los que han sido utilizados como antígeno en ELISA para detectar anticuerpos específicos en sueros humanos3,10,15,16.

En el presente estudio damos a conocer, por primera vez en Chile, la estandarización de una prueba ELISA para el diagnóstico de la strongyloidiasis humana. Esta herramienta de laboratorio permitirá contribuir al estudio de casos clínicos de la parasitosis así como a la determinación de la situación epidemiológica de la infección en nuestro país.

MATERIAL Y MÉTODO

Sueros: Los positivos se obtuvieron a partir de un estudio efectuado en 20 pacientes de un hospital psiquiátrico de Santiago que presentaban eosinofilia sanguínea elevada. En cuatro de ellos, a los que se adicionaron posteriormente dos más, se detectaron larvas de S stercoralis en sus deposiciones. En cuatro sueros de estos pacientes se efectuó ELISA e inmunofluorescencia indirecta en el Laboratorio de Parasitología de la Universidad Federal de Uberlandia, Minas Gerais, Brasil, siendo ésta la primera vez que se detectan anticuerpos anti-S stercoralis en chilenos8. Durante el curso del presente trabajo se recolectaron otros cuatro sueros positivos, correspondientes a tres niños y un adulto, que integraban dos grupos familiares constituidos por seis chilenos y cuatro personas peruanas, respectivamente. En dichos pacientes, se había detectado larvas rabditoides de S stercoralis en sus deposiciones, con estos cuatro pacientes se obtuvo un total de 10 sueros de individuos infectados por S stercoralis.

Como controles negativos se estudiaron 66 sueros de pacientes que presentaban otras helmintiasis: determinadas por la presencia de anticuerpos séricos específicos, 24 toxocariasis y 15 triquinosis, 11 con hidatidosis, con observación del parásito durante intervención quirúrgica, 12 con fascioliasis, con detección de huevos del parásito y 4 cisticercosis, con observación del parásito, en tres mediante estudios imagenológicos y uno durante intervención quirúrgica. También se estudiaron 13 sueros de pacientes con enfermedades autoinmunes, tres de los cuales tenían títulos >1:160 para factor reumatoideo. Además, fueron procesados 49 sueros de individuos aparentemente sanos que concurrieron a un centro médico de Santiago a efectuarse estudio de perfil bioquímico y hemograma, y que presentaban un recuento de eosinofilos dentro de límites normales. Todas las muestras de sueros se mantienen congeladas a -20°C en las serotecas de la Unidad de Parasitología Norte (ICBM), Facultad de Medicina de la Universidad de Chile y del Laboratorio de Referencia de Parasitología del Instituto de Salud Pública de Chile.

Antígeno: Se preparó un extracto proteico alcalino de larvas filariformes de S venezuelensis. El extracto se hizo usando 100.000 larvas que se adicionaron a 1 ml de NaOH 0,15 M y se mantuvieron a 4°C en agitación constante por 6 h, enseguida, se neutralizaron hasta pH 7,0 con HCl 0,3 M y posteriormente se centrifugaron a 10.000 rpm a 4°C. En el sobrenadante del extracto se determinó la concentración de las proteínas mediante el método de Bradford17 y luego, se conservó a -20°C hasta su uso. Cepas de S venezuelensis se mantienen en Rattus norvegicus (Wistar), efectuando infecciones estandarizadas subcutáneas en ratas machos de 20-30 días de vida, cada 15 días en el Departamento de Parasitología, Instituto de Biología, Universidad Estadual de Campinas, Sao Paulo, Brasil por uno de nosotros (MTU).

ELISA: Para su montaje se determinó la concentración óptima del antígeno, dilución del suero y del conjugado de anti inmunoglobulinas humanas IgG mediante el método de titulación descrito por Voller et al18. El ensayo fue efectuado en placas o tiras de pocillos desechables de poliestireno (Immulon 2, Dynatech). El antígeno fue diluido hasta la concentración óptima usando buffer carbonato pH 9,6 y se sensibilizaron los pocillos por 16 h a 4°C. Después de lavarlos tres veces (lavador automático Dynatech, solución de lavado con NaCl 0,85% y Tween-20 0,05%) se bloquearon con solución de leche descremada al 3% en buffer fosfato salino pH 7,2. Se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Se lavaron y se mantuvieron congeladas hasta su uso. Las determinaciones se realizaron usando 50 µl, tanto de suero diluido como de conjugado y se incubaron a 37°C durante 1 h, en cada caso. Se utilizó un conjugado de fosfatasa alcalina y anti-IgG humana y su respectivo sustrato (SIGMA Chem Co). Las placas o tiras se incubaron en cámara oscura a temperatura ambiente por 30 min, deteniéndose la reacción enzimática mediante NaOH 3 N. La densidad óptica (DO) de las soluciones de los pocillos se leyó en un espectrofotómetro de microplacas EL 340 (Biotek Instruments) a 405 nm. Todas las determinaciones se realizaron en duplicado.

RESULTADOS

La menor absorción inespecífica de conjugado de inmunoglobulinas anti-IgG, la dilución óptima de los sueros y la concentración adecuada de proteínas del antígeno se obtuvieron con las siguientes concentraciones: 1/3.500, 1/200 y 5 µg/pocillo, respectivamente. Al efectuar ELISA, así estandarizada, a los sueros controles negativos se obtuvieron valores de DO que variaron entre 0,07 y 0,25 para los considerados con otras helmintiasis o con patologías autoinmunes y entre 0,13 y 0,30 para los individuos aparentemente sanos. En cambio, los sueros de pacientes con strongyloidiasis parasitológicamente confirmada mostraron valores de DO que variaron entre 0,29 y 0,88 (Tabla 1). Los valores extremos y promedios de DO de los cuatro grupos de sueros estudiados se presentan en la Figura 1. Se puede apreciar que el promedio de DO de los sueros de los infectados por S stercoralis fue aproximadamente tres veces superior a los valores promedios de los sueros de controles negativos. La diferencia de positividad de la ELISA observada entre el grupo de infectados por S stercoralis y los grupos controles fue significativa (p <0,01) a la prueba de Chi cuadrado calculada mediante EPI Info 6,0.



Figura 1. Valores extremos y promedios de DO de ELISA para strongyloidiasis en Chile.

 

El promedio de DO de todos los sueros considerados controles negativos fue 0,17 y la desviación estándar (DE) de la serie 0,04. El valor de corte o cut-off de 0,33 obtenido sumando cuatro DE al promedio de los controles negativos hizo que la prueba mostrara una sensibilidad de 90% y una especificidad y valores predictivos positivos y negativos de 100%, calculados sobre la base de la muestra de sueros estudiada, ya que no se ha determinado aún la prevalencia de la parasitosis en Chile (Tabla 2).


DISCUSIÓN

La determinación de anticuerpos anti-S stercoralis mediante ELISA IgG en individuos con strongyloidiasis parasitológicamente confirmada fue claramente establecida en nuestro ensayo estandarizado. Los pacientes que eliminaron larvas de S stercoralis en sus deposiciones presentaron reacciones positivas con un promedio de DO aproximadamente tres veces superior a las de los individuos que se consideraron que no tenían la condición de estar infectados por el parásito. Estudios efectuados en diversos países empleando antígenos de larvas filariformes de la especie S stercoralis y de otras especies, especialmente las que infectan a múridos como S ratti han mostrado una sensibilidad de ELISA para strongyloidiasis humana que varía entre 64,3 y 100%1,10,11,16,19. Más recientemente, se describió ELISA con antígeno de larvas filariformes de S venezuelensis cuyo protocolo de preparación es similar al que utilizamos en el presente estudio. Esta prueba diagnostica eficazmente individuos infectados por S stercoralis, ya que sueros de infectados reconocen con alta sensibilidad y especificidad antígenos de diferentes cepas o lineajes de S venezuelensis, mostrando identidad antigénica en extractos de ambas especies20.

La especificidad reportada para ELISA para strongyloidiasis varía entre 82 y 100%1,11,12. En el presente trabajo, usando un valor de corte de 0,33, obtenido al adicionar cuatro DE al promedio de DO de los sueros de individuos con otra condición distinta a la strongyloidiasis, la especificidad fue de 100%. Usualmente, el valor de corte se calcula adicionando al promedio dos DE. Con este índice, la especificidad de ELISA strongyloidiasis disminuyó a 97,7% y simultáneamente la sensibilidad ascendió a 100% (Tabla 2). La adición de DE al promedio de los sueros controles negativos aumenta significativamente la especificidad del ensayo. Sin embargo, simultáneamente puede afectar su sensibilidad, tal como se apreció en el presente estudio. Las DO obtenidas con los sueros que presentaron anticuerpos contra otros helmintos o enfermedades autoinmunes no mostraron reacciones cruzadas de magnitud que pudieran dar valores superiores al valor de corte de 0,33. Por esto, la prueba de ELISA para strongyloidiasis en Chile sería de gran valor diagnóstico. En otros estudios se ha observado que ELISA para strongyloidiasis puede presentar reacciones cruzadas principalmente en individuos con filariasis16,21, dicha parasitosis no ha sido descrita en el hombre en Chile.


Los valores predictivos positivos y negativos determinados sobre la base de la muestra de sueros estudiada fueron 100%. En Chile, no se ha establecido hasta la fecha cúal es la situación epidemiológica de las infecciones por S stercoralis debido principalmente a su aparente baja frecuencia y a la carencia de técnicas de laboratorio eficaces para la detección de la parasitosis. Sin embargo, se han descrito casos de strongyloidiasis en un hospital psiquiátrico de la V región (incluyendo un caso mortal)2,6,7 y más recientemente en la Región Metropolitana8, además de infecciones aisladas y un brote en un centro de recuperación nutricional de Arica, I Región de Chile4,5.

De acuerdo a nuestros resultados, ELISA sería una herramienta muy útil para la detección de la strongyloidiasis humana en Chile. Este ensayo podría usarse en conjunto con exámenes de diagnóstico parasitológico directo, especialmente en aquellos casos que presenten eosinofilia sanguínea elevada. La strongyloidiasis debe considerarse entre las causas de esta alteración hematológica en pacientes chilenos o inmigrantes.

El control de las infecciones por S stercoralis implica necesariamente el conocimiento previo de la epidemiología de la parasitosis, para lo que la técnica de ELISA sería una herramienta simple que permitiría determinar parámetros descriptivos (seroepidemiología) y cuál es la población bajo riesgo de ser infectada -especialmente individuos inmunodeprimidos y pacientes internados en hospitales psiquiátricos-, a la cual deben dirigirse con mayor énfasis las medidas de profilaxis, de acuerdo al criterio de la Organización Mundial de la Salud22.

REFERENCIAS

1. Schaffel R, Nucci M, Carvalho E, Braga M, Almeida L, Portugal R, Pulcheri W. The value of an immunoenzymatic test (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) for the diagnosis of strongyloidiasis in patients immunosuppresed by hematologic malignancies. Am J Trop Med Hyg 2001; 65: 346-50.        [ Links ]

2. Oddo D, Duarte J. Síndrome de malabsorción por Strongyloides stercoralis. Caso de autopsia. Rev Méd Chile 1983; 111: 443-6.        [ Links ]

3. Costa-Cruz JM, Machado ER, Campos DMB. Seroepidemiological study of human strongyloidiasis with blood samples collected on filter paper, in Abadia dos Dourados (Minas Gerais, Brazil). Rev Inst Med trop S Paulo 1998; 40: 1-6.        [ Links ]

4. Palma J, Oñate C. Nuevos antecedentes sobre strongyloidiasis humana en Arica. Parasitol al Día 1992; 16: 62-4.        [ Links ]

5. Palma J. Brote de strongyloidiasis humana en un centro de recuperación nutricional de Arica, I Región de Chile. Rev Chil Tecnol Med 1992; 15: 721-3.        [ Links ]

6. Cornejo J, Arias B, Subiabre V, Quijada M, Schenone H. Estudio epidemiológico de protozoosis y helmintiasis en 490 pacientes crónicos del hospital psiquiátrico de Putaendo, IV Región de Chile. Bol Chil Parasitol 1985; 40: 91-3.        [ Links ]

7. Garibaldi R, Muñoz N, Neira P, Subercaseaux B, Villalón L. Entero y ectoparásitos en la V región de Chile. Estudio en el hospital psiquiátrico de Putaendo. Bol Chil Parasitol 1990; 45: 83-5.        [ Links ]

8. Mercado R, Jercic MI, Ueta MT. Infecciones por Strongyloides stercoralis en Chile. Bol Chil Parasitol 2001; 57: 72-5.        [ Links ]

9. Beaver PC, Jung RC. Animal agents and vectors of human disease. 5th edition. USA: Lea & Febiger, 1985; 155-9.        [ Links ]

10. Barbosa Campos DM, Ferreira MS. Estrongyloidiáse. En: Cimerman S, Cimerman B ed. Parasitologia Humana e seus fundamentos gerais. Sao Paulo, Brasil: Ed. Atheneu; 1999; 287-96.        [ Links ]

11. Uparanukraw P, Phongsri S, Morakote N. Fluctuations of larval excretion in strongyloides stercoralis infection. Am J Trop Med Hyg 1999; 60: 967-73.        [ Links ]

12. Conway DJ, Lindo JF, Robinson RD, Bundy DAP. Towards effective control of Strongyloides stercoralis. Parasitology Today 1995; 11: 420-4.        [ Links ]

13. Genta RM, Walzer PD. Strongyloidiasis. En: Walzer PD, Genta RM ed. Parasitic Infections in the Compromised Host. Nueva York: Marcel Dekker, Inc. 1989; 463-525.        [ Links ]

14. Dreyer G, Fernández-Silva E, Alves S, Rocha A, Alburquerque R, Addiss D. Patterns of detecction of Strongyloides stercoralis in stool specimens: Implications for diagnosis and clinical trials. J Clin Microbiol 1996; 34: 2569-71.        [ Links ]

15. Lindo JF, Atkins NS, Lee MG, Robinson RD, Bundy DAP. Short report: Long-term serum antibody isotipe responses to Strongyloides stercoralis filariform antigens in eight patients treated with ivermectin. Am J Trop Med Hyg 1996; 55: 474-6.        [ Links ]

16. Gam AA, Neva FA, Krotoski WA. Comparative sensitivity and specificity of ELISA and IHA for serodiagnosis of strongyloidiasis with larval antigens. Am J Trop Med 1987; 37: 157-61.        [ Links ]

17. Bradford MM. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 1976; 72: 248-54.        [ Links ]

18. Voller A, Barlett A, Bidwell DE. Enzyme immunoassays with special reference to ELISA techniques. J Clin Pathol 1978; 31: 507-20.        [ Links ]

19. Neva FA, Gam AA, Burke J. Comparison of larval antigens in an Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for strongyloidiasis in humans. J Infect Dis 1981; 144: 427-32.        [ Links ]

20. Machado ER, Lourenco EV, Oliveira JBA, Goncalves MRF, Ueta MT, Costa-Cruz JM, Roque-Barreira MC et al. Avaliaçao da reatividade cruzada entre linhagens de Strongyloides venezuelensis e Strongyloides stercoralis. J Bras Patologia 2001; 37 (Suplemento): 102.        [ Links ]

21. Conway DJ, Atkins NS, Lillywhite JE, Bailey JW, Robinson RD, Lindo JF, Bundy DAP. Immunodiagnosis of Strongyloides stercoralis infection: a method for increasing the specificity of the indirect ELISA. Trans R Soc Trop Med Hyg 1993; 87: 173-6.        [ Links ]

22. Organización Mundial de la Salud. Prevención y control de infecciones parasitarias intestinales. Serie de informes técnicos 749. OMS, 1987. pp. 74.        [ Links ]

Correspondencia a: Rubén Mercado. Unidad de Parasitología Norte, ICBM, Facultad de Medicina, Universidad de Chile. Casilla 9183, Santiago, Chile.Email: rmercado@machi.med.uchile.cl

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