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Revista médica de Chile

versión impresa ISSN 0034-9887

Rev. méd. Chile v.130 n.5 Santiago mayo 2002

http://dx.doi.org/10.4067/S0034-98872002000500005 

Múltiple FISH y múltiple BAND:
técnicas de citogenética molecular
en cinco casos

Silvia Castillo Taucher, Ana María Fuentes S1,
Alejandro Paulos M1, Andrea Pardo V2.

Application of the cytogenetic
techniques multiple Fish and
multiple Band. Report of five cases

The techniques of multiple FISH (M-FISH) or fluorescence in situ hybridization with different color assignment for all and each of the human chromosomes, and multiple BAND (M-BAND) or hybridization with different color assignment for each chromosomal band, allow the identification of some alterations that would not be possible to distinguish with classical banding techniques, like the origin of the chromosomal material that constitutes a (non identifiable) marker chromosome or confirming the constitution of the multiple and simultaneous aberrations that occur in cancer cells. We communicate five complex cytogenetic cases that benefited by the employment of this diagnostic strategy, allowing to corroborate or reformulate a previous given conclusion (Rev Méd Chile 2002; 130: 511-18).
(Key Words: Chromosome abnormalities; Cytogenetics; Neoplasms)

Recibido el 3 de octubre, 2001. Aceptado en versión corregida el 21 de marzo, 2002.
Laboratorio Clínica Alemana, Sección Citogenética, Clínica Alemana, Santiago, Chile.
1 Tecnólogo Médico
2Becaria Genética Clínica Facultad de Medicina, Universidad de Chile

La técnica de múltiple FISH (M-FISH) o hibridación in situ con fluorescencia de todos los cromosomas se utiliza en el mundo desde hace 5 años y ha causado revuelo por la introducción de colores en la citogenética tradicionalmente gris.

La visión de los cromosomas al microscopio es un logro mayor del año 1956, cuando por primera vez Tjio y Levan1 obtuvieron una preparación metafásica de cromosomas humanos a partir del cultivo de fibroblastos de pulmón de un mortinato. En los años siguientes se perfeccionaron las técnicas para obtener cromosomas en diversas muestras, tales como sangre, médula ósea, trofoblasto, líquido amniótico y distintos tumores sólidos, así como también las técnicas que tiñen ciertos componentes de los cromosomas, dando patrones de bandas diferenciales que permiten no sólo la identificación individual de cada cromosoma, sino también evaluar la integridad microscópica de su estructura. Los bandeos más comúnmente utilizados son el bandeo Q con quinacrina, el bandeo G con tripsina y Giemsa y el bandeo R de reverso (del G) y bandeo C de la heterocromatina constitutiva.

En la década 1980-90 se desarrolló la citogenética molecular que se considera una revolución al descubrir alteraciones submicroscópicas con sondas específicas de segmentos cromosómicos, de centrómeros o telómeros, también detectan fusiones específicas de regiones cromosómicas comprometidas en translocaciones conocidas, que permiten resolver preguntas, incluso a veces en ausencia de metafases, observando las señales en núcleos interfásicos2.

Desde 1996, el cariotipo multicolor y la diferenciación simultánea por colores de todos los cromosomas humanos definido por dos técnicas principales, SKY y M-FISH, que se diferencian en el análisis que utilizan para las marcaciones combinatoriales y la exposición secuencial a través de filtros específicos para los diversos fluorocromos (tinciones fluorescentes), se revela como una estrategia complementaria, útil y bonita (científica y literalmente), coadyuvante al diagnóstico citogenético de anomalías complejas, de tanta trascendencia en muchas oportunidades3-5. Se necesitan sólo cinco fluorocromos (con capacidad combinatorial de 31) para distinguir los 24 cromosomas, por hibridación de juegos de sondas de ADN cromosoma-específicas, cada uno es marcado diferencialmente y se le atribuye luego un color falso que lo identifica. Los procesos automatizados de análisis corrigen la imagen geométrica, calculan el delineamiento de cada cromosoma con una tinción general de ADN con DAPI (4’-6-diamidino-2-phenilindole), calculan y sustraen el trasfondo de cada fluorocromo considerando un valor umbral, visualizan el material que hibrida con cada sonda cromosómica haciendo posible la asignación individual, crean una imagen compuesta de valores grises que codifica a cada cromosoma y presentan los resultados finales con la asignación de un pseudocolor a cada uno de estos valores grises, permitiendo asimismo un pronto resultado.

Comunicamos algunos casos citogenéticos estudiados con esta técnica y analizamos brevemente el significado de la contribución de su información al diagnóstico. Nuestros datos apoyan que la técnica de hibridación in situ con fluorescencia múltiple (M-FISH) puede tener una amplia utilidad clínica y complementar la citogenética tradicional en cariotipos complejos.

MATERIAL Y MÉTODO

Los cromosomas metafásicos fueron preparados de muestras de sangre periférica o de médula ósea que habían sido referidas a la Sección Citogenética del Laboratorio Clínico de Clínica Alemana, previo consentimiento de los pacientes. El sexo, la edad, la técnica fluorescente empleada, el diagnóstico clínico de referencia y el tipo de muestra analizada en los cinco pacientes se resume en la Tabla 1.


Las preparaciones de cromosomas metafásicos y los análisis con bandeo G fueron realizados en todos los casos utilizando procedimientos de rutina con protocolos estandarizados6,7.

Para la hibridación con cinco fluorocromos se utilizaron los reactivos provistos por Metasystems (24Xcyte) y se siguieron las instrucciones de procesamiento en cuatro etapas principales: pretratamiento y denaturación de las preparaciones cromosómicas, denaturación de la sonda e hibridación, lavados posthibridación y detección de las sondas marcadas con biotina mediante Cy5. El análisis se realizó en un microscopio Zeiss Axioskop I especialmente equipado con filtros para fluorescencia y conectado a un monitor con el software Metasystems para el análisis de los 24 cromosomas mediante una asignación de color diferente a cada uno. La técnica para múltiple BAND que se utilizó en los dos últimos casos, con el mismo fundamento marca sólo el cromosoma estudiado con bandas de diversos colores. Utilizamos los reactivos específicos para el cromosoma 7 (Xcyte 7) y para el cromosoma 2 (Xcyte 2)8.

El primer caso (# 1-3957) correspondió al cariotipo en médula ósea de una paciente de sexo femenino, de 51 años de edad, que tenía diagnóstico hematológico de leucemia mieloide crónica que evolucionó a leucemia mieloide aguda. El diagnóstico citogenético con técnica convencional, bandeo G con resolución de 450 bandas, era 46-75,XX,t(9;22)(q34;q11)[cp25] con múltiples alteraciones numéricas y estructurales, es decir, un cariotipo compuesto considerando en total 25 metafases que tenían un número de cromosomas que oscilaba entre 46 y 75, con cromosomas sexuales femeninos XX y cromosoma Philadelphia en todas las células analizadas, o sea, presencia de la translocación entre un cromosoma 9 y 22, t(9;22)(q34;q11), entre las bandas q34 y q11 de sus brazos largos respectivamente; además de muchas y variadas alteraciones en el número y tamaño de otros cromosomas. Se analizaron con técnica de M-FISH siete mitosis.

El caso # 2-3400 fue el cariotipo en muestra de médula ósea de un paciente de sexo masculino, de 45 años de edad, con diagnóstico hematológico de leucemia mieloide aguda. El diagnóstico inicial con bandeo G y resolución de 400 bandas era 46,XY, der(3)t(3;?)(q13;?), add(19)(p13), también había dudas sobre la normalidad de los cromosomas 8, 9 y 12. Esto significa un resultado con número modal normal de 46 cromosomas, con cromosomas sexuales masculinos XY, con una alteración estructural en un cromosoma 3 de la que se conoce la banda comprometida en el brazo largo (q13), pero de la que se ignora con qué cromosoma existe un reordenamiento o translocación, y un cromosoma 19 con un segmento adicional en el extremo de su brazo corto (p13) pero cuyo origen del material genético se ignora. Se analizaron con técnica de M-FISH cinco mitosis.

En el caso # 3-3226 desconocemos los antecedentes clínicos, la muestra de sangre procedía de una paciente de sexo femenino de 62 años de edad. En todas las metafases analizadas se observó un cromosoma marcador pequeño no identificable adicional, con bandeo G y resolución de 550 bandas el cariotipo era 47,XX,+mar. Se analizaron ocho metafases con técnica de M-FISH.

El caso # 4-3854 correspondió a una lactante de 2 meses de edad, con dismorfias faciales, principalmente hipertelorismo, con estrabismo divergente en ojo derecho y fisura labiopalatina izquierda, cardiopatía congénita con comunicaciones interauricular e interventricular, luxación congénita de cadera derecha, e hipoplasia ungueal en manos y pies. En el cariotipo obtenido de una muestra de sangre se observó uno de los cromosomas 7 con lo que parecía una duplicación de la banda p15 en el brazo corto, 46,XX,dup(7)(p?15). Se seleccionaron ocho mitosis en que lo único visible en colores por la hibridación específica de M-BAND era ambos cromosomas 7.

El caso # 5-7947 correspondió a un niño de 3 años de edad con un trastorno conductual hiperactivo, dismorfias leves como surcos supraciliares marcados, nariz aguileña, boca pequeña y clinodactilia bilateral de ambos meñiques. El estudio cromosómico en una muestra de sangre reveló en todas las mitosis un cromosoma 2 con pérdida de un segmento intersticial en su brazo largo entre las bandas q31 y q33 y un pequeño cromosoma adicional en anillo cuyo origen no era posible establecer con certeza. El informe del cariotipo es 47,XY,del(2)(q31q33),+r(?2). En siete mitosis se analizaron las tres estructuras visibles con coloración en múltiples bandas correspondientes a material genético del cromosoma 2.

RESULTADOS

En la Tabla 2 se comparan el diagnóstico del cariotipo con técnica convencional y del cariotipo con técnica especial en los cinco pacientes presentados.


El análisis de algunas células con 49 cromosomas en el caso # 1-3957 (Figura 1. Cariotipo con bandeo G y con M-FISH) con técnica de M-FISH reveló un cariotipo con múltiples alteraciones, que, en virtud de los colores, es relativamente sencillo de interpretar: 49,XX,i(6p),der(6)t(6;8),i(8q),+del(8)orr(8),der(9)t(9;22),der(17)t(6;17),der(18)t(6;18),+19,+20,del(22). Esto significa que hay un cromosoma que está constituido por la fusión de dos brazos cortos de cromosoma 6, un cromosoma 6 derivativo por una translocación entre un cromosoma 6 y 8, otro por la fusión de dos brazos largos de cromosoma 8, un pequeño cromosoma 8 que podría tener pérdida o deleción de un segmento o ser un cromosoma en anillo, un cromosoma 9 derivativo por una translocación entre un cromosoma 9 y 22, un cromosoma 17 derivativo por una translocación de un brazo largo de un cromosoma 6 al extremo del brazo corto de un cromosoma 17, un cromosoma 18 derivativo por una translocación de un brazo largo de un cromosoma 6 al extremo del brazo corto de un cromosoma 18, un cromosoma 19 adicional, un cromosoma 20 adicional y un cromosoma 22 con pérdida de material genético.


Figura 1. Caso 1-3957 Cariotipo: 49,XX,der(6)t(6;8)(q12;q12),i(6)(p10),der(8)del(8)(q12),i(8)(q10),t(9,22)(q34;q11),der(17)t(6;17) (q12;p13),der(18)t(6;18)(q12;p11),+19,+20 Bandeo G y múltiple FISH.

El estudio con M-FISH del caso # 2-3400 (Figura 2. Cariotipo con bandeo G y con M-FISH) aclaró que había una triple translocación que involucra tres cromosomas 46,Y, t(X;3;19). Como el color asignado cubre en forma homogénea todo el cromosoma, no es posible precisar los puntos de fractura. La translocación del cromosoma X es con parte del cromosoma 3 y el segmento adicional en el cromosoma 19 proviene del cromosoma 3; también se reconoce que el cromosoma X ha perdido un segmento. Se obtiene razonable seguridad sobre la normalidad de los cromosomas 8, 9 y 12 en lo que se sospechaba respecto a translocaciones recíprocas con otros cromosomas en las cinco metafases analizadas.


Figura 2. Caso 2-3400 Cariotipo: 46,Y,t(X;3;19)(q21;q21;p13). Bandeo G con ideograma de cromosomas 3,19 y X y múltiple FISH.

En el caso # 3-3226 (Figura 3. Cariotipo con bandeo G y con M-FISH) fue posible determinar que el cromosoma marcador adicional estaba constituido por material genético del cromosoma 22.


Figura 3. Caso 3-3226 Cariotipo 47,XX,+der (22q) Bandeo G y múltiple FISH.

En el caso # 4-3854 (Figura 4. Detalle de ambos cromosomas 7 con M-BAND) se usó la técnica de múltiple bandeo, que permitió corroborar el diagnóstico planteado con bandeo G sobre la duplicación de la banda p15 en un cromosoma 7.

También en el caso # 5-7947 (Figura 5. Detalle de los tres cromosomas constituidos por material de cromosoma 2 con M-BAND) se utilizó la técnica de múltiple bandeo, apoyando los puntos de fractura de la deleción intersticial en el brazo largo del cromosoma 2 entre q31 y q33, pero sobre todo permitiendo la comprobación de la constitución del cromosoma en anillo por el mismo material perdido en la deleción del cromosma 2.


Figura 4. Caso 4-3854 Cariotipo parcial: cromosoma 7 normal, dup 7p15 Múltiple BAND cromosoma 7. Se aprecia que el cromosoma con la duplicación (derecha), tiene repetidas las bandas verde y roja en su brazo corto. Figura 5. Caso 5-7947 (proveniente Laboratorio Citogenética Hospital Clínico Universidad de Chile). Cariotipo parcial: del(2)(q31q33),r(2)(q31q33), cromosoma 2 normal e ideograma del cromosoma 2. Múltiple BAND cromosoma 2. Se aprecia que el cromosoma en anillo está formado por material proveniente del cromosoma 2 deletado.
DISCUSIÓN

La técnica de hibridación in situ con fluorescencia (FISH) se basa en la reasociación de cadenas únicas de ADN complementario. La sonda está hecha de segmentos específicos de ADN, cuyos nucleótidos están marcados con moléculas fluorescentes. El objetivo es el ADN denaturado de una determinada muestra. Luego se permite la reunión de secuencias complementarias del ADN de la sonda y del objetivo. La señal fluorescente correspondiente al segmento específico del ADN de doble cadena se detecta por microscopia de fluorescencia.

La hibridación in situ con fluorescencia multicolor utiliza varias tinciones fluorescentes para detectar diferentes sondas que se unen a todo un cromosoma al mismo tiempo. Esto permite la presentación simultánea de cada uno de los distintos 24 cromosomas humanos con una única hibridación. La detección de estas 24 sondas diferentes para cada cromosoma se logra con cinco fluorocromos de distintos espectros. Cada sonda está marcada con uno de estos cinco fluorocromos o una combinación única de ellos. La separación de diferentes espectros de excitación y emisión está garantizada por sets de filtros apropiados. La asignación inequívoca del color resultante a cada cromosoma permite el análisis de aberraciones cromosómicas complejas o la descripción de la composición de cromosomas marcadores.

Las sondas de M-BAND se circunscriben a sondas de regiones específicas marcadas con diferentes fluorocromos o combinaciones de éstos. La sobreposición parcial de sondas de bandas adyacentes resulta en una multitud de razones de colores únicos a lo largo del cromosoma. El análisis de razones de colores permite caracterizar el cromosoma en un número selecto de bandas de razones similares. El análisis cuantitativo de la razón de colores efectivamente multiplica la resolución de las sondas de regiones específicas. El M-BAND traslada el análisis multicolor a un nivel más alto de precisión y detecta reordenamientos intracromosómicos.

Los avances tecnológicos más relevantes asociados a M-FISH y M-BAND son la selección y prueba de diversos filtros basada en la excitación y la emisión de razones de contraste que logran más de 90% de discriminación entre fluorocromos y el desarrollo de software computacional para el análisis del espectro de cada sonda9.

Es muy importante que la información aportada por el análisis de M-FISH en el caso # 1-3957 permitió la reevaluación del cariotipo original con bandeo G, buscando en forma dirigida las alteraciones allí descritas, con lo que se pudo rediagnosticar con una mayor precisión lo que se había observado (Figura 1). El cariotipo final es 49,XX, der(6)t(6;8)(q12;q12), i(6)(p10),der(8)del(8)(q12),i(8)(q10),t(9;22)(q34;q11),der(17)t(6;17)(q12;p13),der(18)t(6;18)(q12;p11), +19, +20. Es relevante considerar que en otras células analizadas de este mismo paciente que tienen otro número modal (o de cromosomas) es esperable el hallazgo de otras aberraciones, lo que no es raro en procesos neoplásicos en evolución. No es posible de catalogar esta mayor precisión en el examen como un beneficio inmediato para la propia paciente, es conocido el mal pronóstico de la coexistencia de numerosas alteraciones lo que también informaba el bandeo G. Sin embargo, la aplicación de M-FISH puede resultar en el reconocimiento de nuevas anomalías recurrentes con implicancias clínicas en enfermedades bien caracterizadas, como leucemias y linfomas y algunos tumores sólidos. Esto ocurrió por ejemplo, con la translocación entre un cromosoma 12 y 21, t(12;21)(p13;q22), que resultó ser la anomalía más común en la leucemia linfática aguda de células B en la infancia, que no había sido descrita con bandeo G y fue descubierta con técnicas de biología molecular y confirmada con FISH10.

Revisando el cariotipo del caso # 2-3400 con la nueva información de los cromosomas involucrados fue posible plantear el diagnóstico final 46,Y, t(X;3;19)(q21;q21;p13). Está descrito el compromiso del cromosoma 3 con los mismos puntos de fractura sólo en el 2% de las leucemias mieloides agudas y le confieren mal pronóstico. También la participación de cromosomas sexuales es muy infrecuente. El cromosoma 19 se involucra en la misma región en el 11% de este tipo de leucemias, con mayor frecuencia (30%) en los tipos monoblástico y mielomonocítico11.

En el caso # 3-3226, con una trisomía parcial del cromosoma 22, este hallazgo es muy llamativo considerando la edad de la paciente y los posibles efectos deletéreos de esta trisomía parcial. Está indicado el estudio citogenético de familiares, que pueden ser portadores de una translocación balanceada que involucre a este cromosoma y haya dado origen al marcador adicional. Es especialmente frecuente un reordenamiento que compromete además al cromosoma 11. En caso de detectar un portador de translocación, éste debe ser informado de las posibles consecuencias en su descendencia, pérdidas reproductivas o hijos con malformaciones congénitas múltiples.

En el caso # 4-3854 se evidencia más gráficamente la alteración que ya se sospechaba con técnicas convencionales, en ese caso está indicado igualmente estudiar a los padres para descartar algún elemento constitucional en ellos que los predisponga al hallazgo en su hija y poder también definir posibles riesgos en sus otros hijos. La pareja está renuente a realizar el estudio citogenético en ellos.

En el caso # 5-7947 con la técnica de M-BAND, se describen alteraciones que se estiman como balanceadas, como si no hubiera pérdida ni ganancia de material genético. Por no ser éste un examen cuantitativo esto es posible de afirmar en base a las pocas alteraciones evidenciadas en el paciente en el examen físico. Lo más probable es que se trate de una alteración de novo, pero también está indicado el estudio de los padres, el cual está pendiente.

Las aplicaciones más claras de M-FISH son aclarar la constitución de diversas alteraciones citogenéticas, como el origen de un cromosoma marcador no identificable o reordenamientos complejos especialmente intercromosómicos pero también intracromosómicos como se objetiva claramente en el primer caso nuestro. Estos hallazgos son extraordinariamente frecuentes en células neoplásicas, donde existen múltiples clones con variables números cromosómicos, muchos de ellos con tantas aberraciones, que el análisis convencional del cariotipo es muy difícil. Incluso puede ser una dificultad hacer coincidir los clones analizados con ambas técnicas. Algunas publicaciones destacan el aporte en la caracterización de anomalías sutiles12,13. Es posible discernir casos complejos que clínicamente sugieren cromosomopatías, pero cuyos resultados con técnicas convencionales han sido repetidamente normales. Esto reviste gran trascendencia diagnóstica y repercute en el pronóstico y consejo genético por el eventual riesgo de recurrencia14. Su mayor valor radica en el examen simultáneo y efectivo de todo el genoma, aun cuando la resolución de detección de inserciones o translocaciones se ha estimado en 1 a 1,5 Mb.

Numerosas publicaciones se refieren a la contribución en la aclaración de cromosomas marcadores o derivativos no heredados15, donde no hay posibilidades de obtener la información que eventualmente aportan parientes portadores de las alteraciones en sus formas balanceadas que no producen efectos fenotípicos o funcionales. Esto es especialmente válido en nuestros casos # 3-3226 del marcador del cromosoma 22, # 4-3854 de la duplicación de 7p15 y # 5-7947 del cromosoma 2 reordenado con un pequeño anillo del mismo cromosoma 2.

La aplicación de M-FISH a núcleos interfásicos proveerá nueva información respecto a la organización y dinámica de las estructuras cromosómicas como función de la actividad metabólica nuclear.

Otra de las utilidades potenciales de M-FISH es la posibilidad de determinar localización y extensión de sintenia entre diversas especies para estudios de evolución.

No debe confundirse el término de FISH multicolor, que suele emplearse para señalar el uso simultáneo en una misma muestra de sondas únicas de ADN o de sondas alpha satélite centroméricas específicas visibles al mismo tiempo con diversos filtros, cuya utilidad ha sido descrita para realizar diagnóstico prenatal16. Las sondas que colorean completamente un cromosoma (whole chromosome paint probes) son útiles cuando se tiene un gran fundamento de sospecha sobre la afección de un determinado cromosoma, pero tiene una capacidad resolutiva muy restringida en relación al M-FISH que realiza un análisis simultáneo de este tipo en todos los cromosomas.

El M-FISH presenta limitaciones técnicas en la clasificación cromosómica. Por ejemplo, los reordenamientos intracromosómicos, como duplicaciones, deleciones o inversiones, no serán discernibles, porque después de la hibridación tendrán asignado el mismo color del cromosoma comprometido. Aun cuando pueda estimarse el cromosoma de procedencia en un rearreglo, no se conocen los segmentos (o bandas) cromosómicos comprometidos. Numerosos artefactos técnicos, como malas preparaciones citogenéticas, excesiva o insuficiente hibridación, pretratamientos inadecuados, pudieran interferir con la interpretación. Además se exige cautela para no calificar erróneamente como material cromosómico insertado un segmento intermedio en una translocación entre dos cromosomas, si éste tiene la combinación de fluorocromos que sea mezcla de los perfiles de los dos adyacentes17. También puede ocurrir esta mixtura de colores en el entrecruzamiento de cromosomas, lo que se soluciona al examinar diversos extendidos cromosómicos. Suelen realizarse análisis de entre cinco a diez metafases por caso.

Se sugiere, en caso de dudas razonables, complementar el estudio de los hallazgos con otras técnicas citogenéticas moleculares como CGH (Comparative Genomic Hybridization)18,19, conservando como información de base las técnicas de bandeo convencionales. La CGH permite la detección de desbalances genéticos y la ubicación de estas pérdidas y ganancias de cromosomas o subregiones cromosómicas en el mapa cromosómico utilizando una preparación metafásica normal de referencia.

Será necesaria una evaluación experimental adicional para definir las ventajas prácticas y las limitaciones técnicas, por ahora M-FISH se posiciona como una técnica versátil que complementa los métodos citogenéticos existentes, especialmente en la caracterización de cariotipos complejos.

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Correspondencia a: Dra. Silvia Castillo Taucher. Sección Citogenética, Laboratorio Clínica Alemana. Avda. Manquehue 1410, Vitacura, Santiago, Chile. Fono: 2101006 anexo 2052. Email: scastill@ns.hospital.uchile.cl